Фундаментальные и прикладные проблемы хронических инфекций Академик РАМН А.Л. Гинцбург IX Съезд Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов «Итоги и перспективы обеспечения эпидемиологического благополучия населения Российской Федерации» апреля 2007 г. Москва

В основе многих хронических патологических процессов лежит воспаление, индуцируемое инфекционными агентами Пусковым механизмом развития хронических патологий является инфицирование конкретными микроорганизмами Артриты Гастрит, язва желудка Обструктивные легочные заболевания Сердечно-сосудистые заболевания Хр.заболевания печени Онкологические заболевания

Количество смертельных случаев % смертельных случаев Всего на тыс. населения тыс. Инфекционные болезни тыс. 32,1% Соматические заболевания из них хронические заболевания тыс. 70% тыс. 58,8% 39,2% Статистика смертности по всему миру на 2002 г. (по данным ВОЗ)

Хронические патологии различных систем организма, в основе которых лежит воспалительный процесс, индуцированный бактериальными и вирусными инфекциями Нозологическая единица Этиологический агент АтеросклерозC.pneumoniae ЭндокардитStreptococcus sp., Enterococcus sp ТуберкулезMycobacterium tuberculosis Хронический обструктивный бронхитM.сatarrhalis St.pneumoniae H.influenzae Хронический бруцеллезBrucella sp. СифилисT.pallidum Рак простатыMycoplasma hominis ЛимфомаH.pilori Хронические уретриты и простатиты N.meningitides, N.gonorrhoae, T.pallidum, Mycoplasma sp., U.urealyticum, Chlamydia sp., Str.pneumoniae, Enterococcus sp. Бесплодие, патология беременности, неонатальные инфекции Enterobacteriaceae, Campylobacteriaceae Артрит Neisseria gonorrhoeae, Streptococcus sp., Chlamydia sp., Mycoplasma sp., Borrelia sp. Хронический гепатит Гепатит С Цирроз печени Гепатит С Карцинома печени Гепатит С Астма бронхиальнаяVycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae

Хронические патологии различных систем организма, в основе которых лежит воспалительный процесс, индуцированный бактериальными и вирусными инфекциями Нозологическая единица Этиологический агент АтеросклерозC.pneumoniae ЭндокардитStreptococcus sp., Enterococcus sp ТуберкулезMycobacterium tuberculosis Хронический обструктивный бронхитM.сatarrhalis St.pneumoniae H.influenzae Хронический бруцеллезBrucella sp. СифилисT.pallidum Рак простатыMycoplasma hominis ЛимфомаH.pilori Хронические уретриты и простатиты N.meningitides, N.gonorrhoae, T.pallidum, Mycoplasma sp., U.urealyticum, Chlamydia sp., Str.pneumoniae, Enterococcus sp. Бесплодие, патология беременности, неонатальные инфекции Enterobacteriaceae, Campylobacteriaceae Артрит Neisseria gonorrhoeae, Streptococcus sp., Chlamydia sp., Mycoplasma sp., Borrelia sp. Хронический гепатит Гепатит С Цирроз печени Гепатит С Карцинома печени Гепатит С Астма бронхиальнаяVycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae

Острая инфекция Хроническая инфекция Размножение Распространение Выживание Антимикробный препарат Острая и хроническая инфекции – две разные формы взаимодействия патогена с организмом хозяина изменчивость «Молекулярный Паразитизм»

Toll-2 Toll-4 MyD88 NFkB Ядро IFN-γ TNF-α IL-1 IL-2 IL-6 Транскрипционная активация генов провоспалительных цитокинов Первой линией борьбы с инфекционными агентами служит врожденный иммунитет, основу которого составляют различные фагоцитирующие клетки, на поверхности которых располагаются различного класса рецепторы фагосома

Специфичность Толл-подобных рецепторов (TLRs) TLR6 TLR2 TLR1 TLR5 TLR11 TLR9 TLR3 TLR7TLR8 TLR10 TLR4 CD14 Липопротеины Липоарабидоманнан Липотейхоевые кислоты Зимозан (дрожжи) ЛПС Флагеллин T.gondi Профилин Немети- лирован- ная CpG ДНК дцРНК оцРНК ? ? Бактериальные компоненты Вирусные компоненты Неизвестные компоненты

MyD88 TLR NF-kB IRAK TRAF6 Сигнальные пути Толл-подобных рецепторов (TLRs) Индукция экспрессии провоспалительных и антимикробных факторов

TLR GP1 МНС фагосома лизососома деградация Благодаря взаимодействию с цитоскелетом, только Toll-содержащие фагосомы попадают в секреторную часть клетки – аппарат Гольджи

Группа Природа соединений Представители I Природные соединения (микроорганизмы и их компоненты) Бактериальные и вирусные вакцины, эндотоксины, липополисахариды, гликаны, продигиозан, сальмазан, пирогенал, рибомунил II Синтетические препараты (высоко и низкомолекулярные) Полифосфаты, поликарбоксилаты, поли сульфаты, левамизол, инозиплес, диуцифон Иммуномодуляторы все по своей природе являются лигандами и индукторами для Toll-подобных рецепторов Это справедливо в отношении как иммуномодуляторов, являющимися фрагментами клеточной стенки грам(-) и грам(+) бактерий, получаемых из природных источников или химически синтезированных, иммуномодуляторов полинуклеотидной природы, полиэлектролитов как растительного происхождения, так и химически созданных. Это справедливо в отношении как иммуномодуляторов, являющимися фрагментами клеточной стенки грам(-) и грам(+) бактерий, получаемых из природных источников или химически синтезированных, иммуномодуляторов полинуклеотидной природы, полиэлектролитов как растительного происхождения, так и химически созданных.

Схема конструирования клеток, экспрессирующих Toll-подобный рецептор Лентивирусный вектор, несущий ген b-галактозидазы под контролем NF-kB зависимого промоутера Лентивирусный вектор, несущий ген Toll-подобного рецептора Экспрессия гена b-галактозидазы Экспрессия гена TLR Toll-подобный рецептор лиганд Активация NF-kB

Cхема NF-kB-зависимой экспрессии гена галактозидазы после взаимодействия лиганда с TLRs Таким образом, созданная нами система позволяет легко, по цветной реакции на β-галактозидазу определять специфичность действия иммуномодулятора по отношению к тому или иному Toll-рецептору, а следовательно и патогену, и в ряду гомологичных по специфичности иммуномодуляторов оценивать количественно их силу. Таким образом, созданная нами система позволяет легко, по цветной реакции на β-галактозидазу определять специфичность действия иммуномодулятора по отношению к тому или иному Toll-рецептору, а следовательно и патогену, и в ряду гомологичных по специфичности иммуномодуляторов оценивать количественно их силу.

293 hTLR4/CD14-MD2 293 hTLR5 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТОЛЛ-ПОДОБНЫХ РЕЦЕПТОРОВ СПЕЦИФИЧНЫХ ДЛЯ ПИРОГЕНАЛА (1) И ФЛАГЕЛЛИНА (2) активность -галактозидазы, ОD 420 активность -галактозидазы, ОD В настоящее время созданы клеточные линии для исследования иммуномодуляторов по отношению к Toll 4, 2, 6, 5, 7 и 9. При использовании разработанных систем скрининга была установлена специфичность действия различных иммуномодуляторов. Предлагается использование разработанных систем для скрининга химических библиотек с целью поиска новых, высокоэффективных иммуномодуляторов – химических лигандов Toll-подобных рецепторов. В настоящее время созданы клеточные линии для исследования иммуномодуляторов по отношению к Toll 4, 2, 6, 5, 7 и 9. При использовании разработанных систем скрининга была установлена специфичность действия различных иммуномодуляторов. Предлагается использование разработанных систем для скрининга химических библиотек с целью поиска новых, высокоэффективных иммуномодуляторов – химических лигандов Toll-подобных рецепторов. 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 K-Флагеллин, 10 нг/мл Пирогенал 250 нг/мл Пирогенал 50 нг/мл Пирогенал 10 нг/мл 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 K-ЛПС, 50 нг/мл Пирогенал 250 нг/мл Пирогенал 50 нг/мл Пирогенал 10 нг/мл

Итак, мы пришли к заключению, что фагоцитоз является основополагающим моментом, определяющим характер взаимодействия патогена с макроорганизмом, за что И.И.Мечников 99 лет тому назад получил Нобелевскую премию. За это время мы узнали ряд ценных деталей, позволяющих уже сейчас управлять процессом фагоцитоза. Что же происходит с патогенами, которым удалось избежать фагоцитоза, каковы их шансы в отношении становления хронической инфекции? Итак, мы пришли к заключению, что фагоцитоз является основополагающим моментом, определяющим характер взаимодействия патогена с макроорганизмом, за что И.И.Мечников 99 лет тому назад получил Нобелевскую премию. За это время мы узнали ряд ценных деталей, позволяющих уже сейчас управлять процессом фагоцитоза. Что же происходит с патогенами, которым удалось избежать фагоцитоза, каковы их шансы в отношении становления хронической инфекции?

Цитоплазма Клеточная мембрана Внешняя мембрана Периплазма Внутренняя мембрана APTase (InvC) Inner membrane components (InvA, SpaP, SpaQ, SpaR, SpaS) Наиболее универсальной и эффективной системой, позволяющей Остаться на «свободе», не быть фагоцитированной, является наличие у бактерии так называемой третьей транспортной системы. Это кластер генов, примерно около 20. Эти гены включаются при контакте бактерии с наружной мембраной. Синтезирующиеся белки, образуют фактически молекулярный шприц, соединяющий цитоплазму бактериальной и эукариотической клеток. Через этот шприц бактерия вводит в клетку различные белки, в том числе и белки разрушающие цитоскелет, тем самым блокируя подвижность и образование псевдоподий у фагоцита. Это кластер генов, примерно около 20. Эти гены включаются при контакте бактерии с наружной мембраной. Синтезирующиеся белки, образуют фактически молекулярный шприц, соединяющий цитоплазму бактериальной и эукариотической клеток. Через этот шприц бактерия вводит в клетку различные белки, в том числе и белки разрушающие цитоскелет, тем самым блокируя подвижность и образование псевдоподий у фагоцита.

По мере увеличения количества внеклеточных бактерий, начинают включаться молекулярные механизмы, определяющие социальное поведение бактериального сообщества Наиболее важным медицинским и эпидемиологическим аспектом которого является образование биопленок. Показано, что независимо от того, где персистируют бактерии, в организме хозяина или во внешней среде,бактерии образуют структуры называемые биопленками. Наиболее важным медицинским и эпидемиологическим аспектом которого является образование биопленок. Показано, что независимо от того, где персистируют бактерии, в организме хозяина или во внешней среде,бактерии образуют структуры называемые биопленками.

Перечень инфекционных заболеваний, ассоциированных с биопленками Инфекция или заболевание Бактерии-возбудители, способные к формированию биофильмов Кариес зубной Периодонтит Отиты Инфекции костно-мышечной системы Некротизирующие фасциты Инфекции билиарного тракта Остеомиелиты Бактериальные простатиты Эндокардиты Кистозно-фиброзная пневмония Мелиоидозы Внутрибольничные инфекции Пневмония, вызываемая различными возбудителями, в отделениях интенсивной терапии Инфекции хирургических швов Exit sites Артериовенозные шунты Склерит Контактные линзы Катетерные циститы мочеполовой системы Перитониальные диализные перитониты Инфекции, обусловленные внутриматочными противозачаточными спиралями Эндотрахеальные трубки Хикман-катетеры Центральные венозные катетеры Искусственные сосуды сердца Сосудистые имплантанты Билиарные эндопротезы Ортопедические протезы Грамположительные кокки (Streptococcus spp) Грамположительные анаэробные бактерии ротовой полости Нетипируемые штаммы Haemophilus influenzae Грампожительные кокки (staphylococci) Стафилококки группы А Кишечные бактерии (Escherichia coli) Различные виды бактерий и грибов – часто вместе E.coli и другие грамотрицательные бактерии Различные группы стрептококков Pseudomonas aeruginosa Burkholderia cepacia Pseudomonas pseudomallei Грамотрицательные палочки Staphyloccoccus epidermidis и S.aureus Грамположительные кокки Pseudomonas aeruginosa и грамположительные кокки E.coli и другие грамположительные rods Множество бактерий и грибы Actinimyces israelii, S.aureus, S.epidermidis, P.aeruginosa, Neisseria gonorreae,Candida albicans Множество бактерий и грибов Staphyloccoccus epidеrmidis и C.albicans Staphyloccoccus epidermidis и другие S.aureus и Staphyloccoccus epidermidis Грамположительные кокки Множество бактерий и грибов Staphyloccoccus epidermidis и S.aureus

Прямое электронно-микроскопическое исследование живой биопленки, состоящей из бактерий одного вида или сложного мультивидового сообщества показало, что в основном, структура биопленок универсальна и, независимо от состава, различается незначительно. Живая, полноценная биопленка состоит из клеток (15% объема), окруженных матриксом (85% объема), в виде различных образований, по форме напоминающих башни или грибы. Между микроколониями, состоящими из прикрепленных, «сидящих» клеток, проходят водные каналы и вода, циркулирующая по этим каналам образует конвекционный поток. Прямое электронно-микроскопическое исследование живой биопленки, состоящей из бактерий одного вида или сложного мультивидового сообщества показало, что в основном, структура биопленок универсальна и, независимо от состава, различается незначительно. Живая, полноценная биопленка состоит из клеток (15% объема), окруженных матриксом (85% объема), в виде различных образований, по форме напоминающих башни или грибы. Между микроколониями, состоящими из прикрепленных, «сидящих» клеток, проходят водные каналы и вода, циркулирующая по этим каналам образует конвекционный поток.

Чувствительность к антибиотикам свободно растущих и находящихся в составе биопленок патогенных бактерий Микро- организм В жидкой среде MIC mg/ml Биопленка MIC mg/ml S.aureusVancomycin220 E.coliAmpicillin2512 P.pseudomal- lei Ceftazidime8800 Streptococcus sanguis Doxicycline0,0633,15 Структура биопленки и особенности физиологии составляющих ее клеток обеспечивают многократно повышенную, по сравнению с аналогичными свободно живущими бактериями, устойчивость членов сообщества к антимикробным препаратам, будь то антибиотики или факторы иммунной защиты макроорганизма. Механизмы этой устойчивости состоят в затруднении и замедлении проникновения антимикробных агентов через полисахаридный матрикс биопленки и замедлении скорости роста бактерий в биопленках. По мере достижения определенных размеров, часть клеток в виде биопленки отрывается, и она может фактически метастазировать в другие органы и ткани.

7h 36h 7h 18h 7h 18h 36h control 18h Биопленки не только обеспечивают защиту бактерий, но как показано в исследованиях, проведенных в лаборатории экологии возбудителей инфекционных заболеваний НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи, дает возможность активно обороняться от клеток, пытающихся фагоцитировать биопленку. На этих слайдах с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии исследовали взаимодействие вирулентного представителя Burkholderia cepacia с реснитчатым простейшим Tetrahymena pyriformis, одним из наиболее часто встречающихся простейших, способных к фагоцитозу. А. Наблюдается формирование биопленки в присутствии простейшего. В. Увеличенное изображение простейшего. Видны вакуоли, заполненные бактериями С и D. Разные стадии деструкции простейших. Простейшее лопнуло. Разрушен макронуклеос. Видна разрушающаяся вакуоль, ряд ьактерий вышел в цитоплазму. Таким образом, биопленка не только защищает бактерий от фагоцитоза обусловленного простейшими, но и уничтожает фагоцитирующую клетку. Конечная цель этих исследований изучить взаимодействие бактерий, находящихся в составе биопленок с фагоцитирующими клетками иммунной системы человека. Логика исследований состоит в идентификации бактериальных продуктов необходимых для защиты от фагоцитоза, что позволит блокировать образование биопленок или разрушать уже сформировавшиеся. На этих слайдах с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии исследовали взаимодействие вирулентного представителя Burkholderia cepacia с реснитчатым простейшим Tetrahymena pyriformis, одним из наиболее часто встречающихся простейших, способных к фагоцитозу. А. Наблюдается формирование биопленки в присутствии простейшего. В. Увеличенное изображение простейшего. Видны вакуоли, заполненные бактериями С и D. Разные стадии деструкции простейших. Простейшее лопнуло. Разрушен макронуклеос. Видна разрушающаяся вакуоль, ряд ьактерий вышел в цитоплазму. Таким образом, биопленка не только защищает бактерий от фагоцитоза обусловленного простейшими, но и уничтожает фагоцитирующую клетку. Конечная цель этих исследований изучить взаимодействие бактерий, находящихся в составе биопленок с фагоцитирующими клетками иммунной системы человека. Логика исследований состоит в идентификации бактериальных продуктов необходимых для защиты от фагоцитоза, что позволит блокировать образование биопленок или разрушать уже сформировавшиеся.

Безусловно важнейшим способом защиты от хронических инфекций, также как и от острых, является вакцинация. При этом, для успешного использования вакцин в борьбе с хроническими заболеваниями, необходимо понимать, что существующие вакцины, как правило, были созданы как профилактические препараты, а для борьбы с хроническими инфекциями они должны обладать терапевтическими свойствами. Очень наглядно эта проблема, как ее научная составляющая, так и организационная, видны при анализе эффективности вакцины BСG для различных групп населения. Вакцина BСG прекрасно защищает новорожденных, но ее протективный эффект против легочного туберкулеза взрослых (основной по частоте и эпидемиологической опасности форме) как правило низок. Изучение микобактерий методами клеточной микробиологии и биоинформатики позволили понять причины различной эффективности BСG. Безусловно важнейшим способом защиты от хронических инфекций, также как и от острых, является вакцинация. При этом, для успешного использования вакцин в борьбе с хроническими заболеваниями, необходимо понимать, что существующие вакцины, как правило, были созданы как профилактические препараты, а для борьбы с хроническими инфекциями они должны обладать терапевтическими свойствами. Очень наглядно эта проблема, как ее научная составляющая, так и организационная, видны при анализе эффективности вакцины BСG для различных групп населения. Вакцина BСG прекрасно защищает новорожденных, но ее протективный эффект против легочного туберкулеза взрослых (основной по частоте и эпидемиологической опасности форме) как правило низок. Изучение микобактерий методами клеточной микробиологии и биоинформатики позволили понять причины различной эффективности BСG.

Зрелая гранулема BCG – живая вакцина, и после введения вызывает инфекционный процесс, который у иммунологически полноценных переходит в стадию персистенции, при которой бактерии BCG становятся некультивируемыми BCG – живая вакцина, и после введения вызывает инфекционный процесс, который у иммунологически полноценных переходит в стадию персистенции, при которой бактерии BCG становятся некультивируемыми 1 – BCG 2 – фибробласты 3 – эпителиоидные клетки 4 – моноциты 5 – макрофаги 6 – лимфоциты 1 – BCG 2 – фибробласты 3 – эпителиоидные клетки 4 – моноциты 5 – макрофаги 6 – лимфоциты

Иммунодоминантные антигены, характерные для острой и хронической фаз туберкулезной инфекции N spx – 2 кристолин Продукты rpf-генов E sAT-6 Ag 85A фибронектин Ag 85B связывающие Ag 85C белки Хроническая Острая У НФ совершенно другая стратегия генома – экспрессируются другие гены, синтезируются другие белки (антигены). Так как протективный иммунитет при туберкулезе, как и при любой другой инфекции не стерильный, то со временем (7-10 лет) в результате смены антигенного спектра антигены НФ не будут защищать от инфицирования возбудителями туберкулеза экспрессирующими антигены острой фазы. У НФ совершенно другая стратегия генома – экспрессируются другие гены, синтезируются другие белки (антигены). Так как протективный иммунитет при туберкулезе, как и при любой другой инфекции не стерильный, то со временем (7-10 лет) в результате смены антигенного спектра антигены НФ не будут защищать от инфицирования возбудителями туберкулеза экспрессирующими антигены острой фазы.

Что же делать? Необходимо учитывать, что резкое снижение целенаправленных противотуберкулезных мероприятий, таких как санаторно- курортное лечение, специализированная белковая диета приводит к снижению эффективности врожденного иммунитета, что выражается в падении количества Toll- подобных рецепторов, а как следствие этого фагоцитоза и эффективности полноценного иммунного ответа. В результате происходит увеличение прослойки чувствительных к туберкулезу людей. Что же делать? Необходимо учитывать, что резкое снижение целенаправленных противотуберкулезных мероприятий, таких как санаторно- курортное лечение, специализированная белковая диета приводит к снижению эффективности врожденного иммунитета, что выражается в падении количества Toll- подобных рецепторов, а как следствие этого фагоцитоза и эффективности полноценного иммунного ответа. В результате происходит увеличение прослойки чувствительных к туберкулезу людей.

Профилактическая иммунизация Терапевтическая иммунизация НоворожденныеBCG– Взрослые (–) BCG + полиGC – Взрослые (+)–Вакцина на основе антигенов НФ Для эффективной вакцинопрофилактики туберкулеза Необходимо понимать какие задачи, профилактические или терапевтические, нужно решить. С эпидемиологической точки зрения имеет смысл рассмотреть три ситуации. Если вакцинируются новорожденные с полноценным врожденным иммунитетом, то BСG в том виде в котором она существует полностью адекватна имеющимся задачам. Если вакцина применяется для взрослых положительных в туберкулиновой пробе, то необходимо применение еще несуществующей терапевтической вакцины. Если пациент отрицателен в туберкулиновой пробе, то необходимо использовать BСG в бустерном варианте, усиливающем врожденный иммунитет, а именно полиGpC+BCG (для индикации рецептора TLR3) или хитшоковые белки + BCG (для индикации Toll-4 рецептора). Эти варианты вакцины в данный момент созданы и испытываются. Таким образом, борясь с патогенном всегда нужно четко знать какую стратегию реализует наш соперник. И в зависимости от этого применять те или иные средства диагностики, профилактики и лечения, хотя при этом надо констатировать, что мы очень ограничены в выборе средств для противостояния патогенам, когда они вызывают хронические заболевания. С эпидемиологической точки зрения имеет смысл рассмотреть три ситуации. Если вакцинируются новорожденные с полноценным врожденным иммунитетом, то BСG в том виде в котором она существует полностью адекватна имеющимся задачам. Если вакцина применяется для взрослых положительных в туберкулиновой пробе, то необходимо применение еще несуществующей терапевтической вакцины. Если пациент отрицателен в туберкулиновой пробе, то необходимо использовать BСG в бустерном варианте, усиливающем врожденный иммунитет, а именно полиGpC+BCG (для индикации рецептора TLR3) или хитшоковые белки + BCG (для индикации Toll-4 рецептора). Эти варианты вакцины в данный момент созданы и испытываются. Таким образом, борясь с патогенном всегда нужно четко знать какую стратегию реализует наш соперник. И в зависимости от этого применять те или иные средства диагностики, профилактики и лечения, хотя при этом надо констатировать, что мы очень ограничены в выборе средств для противостояния патогенам, когда они вызывают хронические заболевания.