СИСТЕМА ГЕМОСТАЗА

55% плазма Питательные компоненты Выведение (элиминация) отходов, продуктов распада… 45% клетки Кровь Эритроциты (Оксигенация тканей) Лейкоциты (защита) Тромбоциты (Гемостаз) Примерно: от 3 до 5 литров крови Около 100,000 км артерий, вен и капилляров

Системы гемостаза Основные функции системы гемостаза: Поддержание постоянного состава и жидкого состояния крови; Остановка кровотечения при повреждении сосуда; Восстановление нормальной структуры сосуда Биологическая система, поддерживающая кровоток в жидком состоянии, с одной стороны, а с другой предотвращающая кровотечение при повреждении целостности сосуда путем образования тромбоцитарной-фибриновой пробки. З.С. Баркаган

Факторы, Фосфолипиды, Ca ++ AT III PC, PS TFPI… tPA, uPA PAI-1 Antiplasmin Коагуляция ТРОМБИН Система гемостаза как баланс (эквилибриум)ФибринолизПЛАЗМИН Фибрин Продукты деградации Фибрина

Хронология гемостаза Спазм сосудов: в пределах нескольких секунд; Формирование тромбоцитарного сгустка: от 3 до 5 минут; Формирование фибр и нового сгустка: от 10 до 30 минут; Процессы восстановления, с вовлечением системы фибринолиза: от дней до недель

Система гемостаза. Условные подразделения Сосудисто-тромбоцитарная система -Анатомическая структура сосудов -Функциональный статус сосудов -Факторы сосудистой стенки - Тромбоциты Система гемокоагуляции -Плазменные факторы свертывания - Ингибиторы гемокоагуляции - Тромбоциты Система фибринолиза - Активаторы фибринолиза - Ингибиторы фибринолиза

Три звена системы гемостаза Первичный гемостаз: Взаимодействие между стенкой сосуда, тромбоцитами и адгезивными протеинами тромбоцитарная пробка (сгусток); Коагуляция: Консолидация тромбоцитарнойго сгустка и сети нерастворимого фибрина; Коагуляционные факторы и ингибиторы; Фибринолиз: Лизис сгустка, реваскуляризация; Активаторы и ингибиторы фибринолиза;

Продукты эндотелиоцитов, участвующие в гемостазе Антикоагулянты Прокоагулянты Гепарансульфат Тканевой фактор* Тромбомодулин Ингибитор активатора плазминогена 1-го типа Аденозиндифосфатаза Фактор Виллебранда Простациклин, ПГЕ 2, ПГБ 2 Рецептор для фактора Ха Оксид азота Коллаген IV (рецептор для фактора IX i Тканевой активатор плазминогена Индуцированный гипоксией активатор фактора X Урокиназный активатор плазминогена Липополисахарид-индуцированный активатор протромбина Ингибитор пути тканевого фактора Эндотелиальный рецептор протеина С Аннексии V Аннексии II Протеин S Эндотелий-продуцируемый фактор релаксации * Доказано в экспериментах in vitro, in vivo имеются лишь единичные данные.

Антикоагулянтные функции эндотелия - Синтез PGI 2 - Синтез Тромбомодулина - Расщепление аденозин-нуклеотидов - Синтез t-PA

Прокоагулянтные функции эндотелия Активированные тромбоциты Эндотелий Синтез Фактора Виллебранда Синтез PAI-1 Синтез PAI-1 Депонирование 5-10% ФВ в тельцах Weibel-Palad

Свойства субэндотелья Активирует тромбоциты; Стимулирует их адгезию; Активирует систему гемокоагуляции; IV-V тип коллагена I-III тип коллагена

Тромбоцит. Схематическая структура тромбоцита гранулы Плотные гранулы Митохондрии Микротубулы Открытая канальцевая система Плотная тубулярная система Мембрана Диаметр Тr - 3,1±0,3 мкм; Толщина Тr – 1,0±0,2 мкм; Объем Тr – 7,3±1,2 мкм 3

Индукторы активации тромбоцитов in VIVO α - гранулы плотные гранулы Тромбоцит - АДФ, АТФ - Серотонин - Катехоламины - Кальций - фибриноген - фактор Виллебранда - 4 пластиночный фактор - β-тромбоглобулин. - Турбулентное движение крови - АДФ - Тромбин - Адреналин - Арахидоновая к-та - Серотонин - ТХА 2 - Фактор Виллебранда - Коллаген Активация Слабые стимулы Сильные стимулы Лизосомы Митохондрии Резерв энергии Протеазы, Гидролазы, Катепсин

Субстанции стимулирующие тромбоциты В организме больного - бактерии, вирусы; - комплекс АГ-АТ; - опухолевые клетки; - протеолитические ферменты; В эксперименте - АДФ, ристомицин; - Ионофоры; - Синетический ТХА2; - Гемагглютинины; - Форболовые эфиры; - Иономицин; α - гранулы Плотные гранулы Митохондрии Лизосомы

Интегриновые рецепторы тромбоцитов Тромбоцит Активация Факторы активации Gp Ib-V-IX - р. Ф.Виллебранда; Gp IIb/IIIa - р. Фибриногена; Gp Ia/IIa – р. Коллагена; Gp Ic/IIa – р. Фибронектина Gp III – р. Тромбоспондина; VN-R - р. Витронектина; Gp- Ic/IIa – р. Ламинина; С мембраной 1 тромбоцита Связано молекул GpIIb/IIIa

Активация тромбоцитов. Этапы 1. Индукция 2. Трансмиссия 3. Специфические реакции тромбоцита (адгезия, агрегация, изменение формы, реакция высвобождения)

Степени активации тромбоцита Нормальный неактивированный тромбоцит Активированный тромбоцит в виде сферы Активированный тромбоцит с псевдоподиями Первичная волна - обратимая В нормальных условиях все ограничивается первичной волной - Из внутриклеточных депо Са 2+ выходит в цитоплазму - Снижается уровень ц-АМФ - ТХА 2 – транспорт Са 2+ к контрактильным белкам актину и миозину

Обратимость активации тромбоцита Нормальный неактивированный тромбоцит Активированный тромбоцит в виде сферы Активированный тромбоцит с псевдоподиями Первичная волна - обратимая В нормальных условиях все ограничивается первичной волной -PGI 2 – транспорт Са 2+ от контрактильных белков в внутриклеточные депо - повышается уровень ц-АМФ - дезагрегация (обратимость агрегации тромбоцита)

Выброс содержимого гранул - АДФ - серотонин - катехоламины - фактор Виллебранда Экспрессия рецепторов GPIIb/IIIa (рецептор для фибриногена GPIIb/IIIa Образование конгломератов Из тромбоцитов Агрегация тромбоцитов. Секреция активных веществ из гранул Первичная волна Вторичная волна (обратимая) (необратимая)

Агрегация тромбоцитов. Волны агрегации Активированные тромбоциты с псевдоподиями Первичная волна Вторичная волна + Образование фибриновых мостиков (обратимая) (необратимая) фибриноген Мягкий метаморфоз Необратимый метаморфоз

Активированные тромбоциты Адгезия и агрегация тромбоцитов - Фибриноген - Фактор Виллебранда Эндотелий Субэндотелий -Рецептор для Фибриногена (GpIIb/IIIa) - Рецептор для Ф.Виллебранда (GpIb) Белки – кофакторы адгезии Ф. Виллебранда; Фибронектин; Тромбоспондин; Витронектин; Ламинин;

Тромбоцит vWf Гликопротеиновый рецептор Gp Ib-V-IX VIII:C Коллаген Адгезия тромбоцитов. Фактор Виллебранда D1 D2 D D3 A1 A2 A3 D4 B C1 C2 vWF vWF mRNA 8,7 kb, 2813aa 2N VWD V 2B VWD V 2A VWD V aa FVIII GрIIb/IIIa GpIb, Гепарин Коллаген Фактор Виллебранда: Мультимер состоящий из 2 до 100 субъединиц Ген ФВ локализован в 12 хромосоме; ФВ состоит из 4 типов повторяющихся доменов – А, В, С и D; Плазменный ФВ образует комплекс ФВ/FVIII в соотношении 1:50-100; Функциональные домены

Тромбоцит Интактные Tr Спазм сосуда под действием БАВ 1. Адгезия тромбоцитов Сосудисто-тромбоцитарный (первичный) гемостаз Повреждение сосуда Запуск первичного гемостаза

Активация Изменение формы Активация Реакция высвобождения Интактные Tr Тромбоцит Спазм сосуда под действием БАВ 1. Адгезия тромбоцитов Повреждение сосуда Сосудисто-тромбоцитарный (первичный) гемостаз

Активация тромбоцитов Взаимодействие c ФВ ведет к активации тромбоцитов: Изменение формы: Выброс из гранул тромбоцитов: Альфа гранулы: фибриноген, фактор V, фактор Виллбранда, PF 4, -TG, … Плотные гранулы: AДФ (индукция агрегации) Вскрытые мембранные фосфолипиды, поддерживают процесс коагуляции* Продукция тромбоксана A 2 (TX A 2 ) * Тромбоцитарный фактор 3, вовлекается в процессы коагуляции

Метаболизм Арахидоновой кислоты ASA Циклооксигеназа ТРОМБОЦИТ ЭНДОТЕЛИЙ Тромбоксан- синтетаза Простациклин- синтетаза Фосфолипаза A2 Фосфолипид Клеточной мембраны Стимул

Тромбоцит Сосудисто-тромбоцитарный (первичный) гемостаз Агрегация (вторая волна) Тромбоцитарный сгусток Активация Изменение формы Активация Реакция высвобождения Интактные Тr Спазм сосуда под действием БАВ 1. Адгезия тромбоцитов Повреждение сосуда

Активированные тромбоциты

Коагуляция Фибрин, конечный продукт коагуляции крови, результат ферментативного каскада реакций, консолидирующего тромбоцитарный сгусток. Результат комбинированных реакций активированных факторов и ингибиторов

Факторы коагуляции Используемое название: Фибриноген Протромбин Проакцелерин Проконверктин Антигемофильный фактор А Антигемофильный фактор B Фактор Стюарта Фактор Розенталя Фактор Хагемана Фибрин-стабилизирующий фактор Фактор Функция I Substrate II Pro-enzyme V Cofactor VII Pro-enzyme VIII Cofactor IX Pro-enzyme X Pro-enzyme XI Pro-enzyme XII Pro-enzyme XIII Pro-enzyme XII XIIa XIa XIa XI IX VIIIa IXa VIIVIIa X II IIa Va Xa V VIII XIII XIIIa Fibrin Активация Фермент

Витамин K-зависимые факторы Фактор коагуляции CH2 COO - Ca ++ Тромбоцитарные фосфолипиды* * Тромбоцитарный фактор 3 Факторы коагуляции II, VII, IX, X II, VII, IX, X Протеины C и S Нуждаются в карбоксильных группах

Витамин К. Механизм действия.

Коагуляционный каскад Активация Общий путь Внешний путь Внутренний путь Сгусток Формирование фибрина Формирование тромбина

VII VIIa X Xa Внешний путь формирования протромбиназы Тромбопластин PF3 PF3 Ca ++ PF3: Тромбоцитарный фактор 3

Ca ++ VIIa TF Adapted from G.J. Brose, Annu. Rev. Med. 1995, 46: Активация фактора VII Тромбопластин: Тканевой фактор + фосфолипид + Са 2+ Фосфолипид Ca ++

() ПВ пациента в секундах нормальное ПВ в секундах МНО= МИЧ МНО = Международное нормализованное отношение МИЧ = Международный индекс чувствительности Определение МНО

ВМК Прекалликреин Калликреин XIIa XIIa XII XIa XI ВМК IX Внутренний путь активации протромбиназы (1) Контакт ВМК: Высокомолекулярный Кининоген PF3: Тромбоцитарный фактор 3

IX IXa + VIII X Xa + V Внутренний путь активации протромбиназы (2) Контактная фаза PF3 PF3 Ca ++ PF3: Тромбоцитарный фактор 3 Ca ++

АПТВ - тест Стандартизированный интегральный тест оценки внутреннего пути коагуляции (факторы XII, XI, IX, VIII) Время свертывания рекальцифицированной плазмы в условиях стандартной контактной (каолин) и фосфолипидной (кефалин) активации. активированное парциальное тромбопластиновое время

VII VIIa IX IXa + VIII I (фибриноген) X Xa + V (тромбин) IIa II Фибрин мономер Сгусток Коагуляция крови XII,XI, ПК, ВМК PF3 Ca ++ PF3: Platelet Factor3 Внутренний путь Внешний путь PF3 PF3 free

VII VIIa IX IXa + VIII I (фибриноген) X Xa + V (тромбин) IIa II Фибрин мономер сгусток Коагуляция крови XII,XI, ПК, ВМК PF3 Ca ++ Действие тромбина Обратная связь a

Агрегация тромбоцитов V Va VIII VIIIa PC PCa XIII XIIIa + Тромбомодулин Фибриноген Фибрин Действие тромбина (IIa) IIa +

Ингибиторы коагуляции TFPI XIIa KK TF-VIIa Xa XIa IXa VIIIa Xa Va IIa Ингибиторы Факторы Ингибиторы - -- AT III: Aнтитромбин III APC: Активированный протеин C PS: Протеин S TFPI: Ингибитор пути тканевого фактора 2 -AT: 2 -антитрипсин 2 -MG: 2 -макроглобулин С1-ING: С1-ингибитор HрCF-II:Кофактор гепарина II AT III PS APC C1-ING 2 -MG HрCF-II 2-AT

AT III + фактор IIa AT III-IIa обратимый комплекс [ AT III-IIa ] необратимый комплекс В котором фактор IIa не активен Действие антитромбина III (AT III)

Total S APC: активированный протеин C TM: тромбомодулин S: протеин S C4bBP: C4b binding-protein EPCR: Эндотелиальный PC рецептор Adapted from Esmon CT et al, Thromb. Haemostasis, 78 (1), 70, 1997 C4 b BP S Free S Система активации протеина С EPCR TM IIa PC Эндотелий PC PCa VIIIa VIIIi Va Vi Vi: Фактор V инактивированный VIIIi: Фактор VIII инактивированный

2-х фазная реакция: 1. Быстрый разрыв связи ARG Медленный разрыв связи ARG 306 и ARG 579 Ca ++ Тяжелая цепь Легкая цепь 506 PCa Инактивация Va активированным Протеином C Фактор Va ARG ARG-аргинин

Ca ++ Легкая Цепь PCa Антикоагуляционный эффект активированного протеина C Фактор Vi

Ca ++ VIIa TF Xa TFPI Ингибитор пути активации тканевого фактора (TFPI) Ca ++ Эндотелий Тетрамолекулярный комплекс

fpA fpB D домен N-terminal of chains Фибриноген 3 пары полипептидных цепей: A B M.М. 340,000 fp: Фибринопептид E домен C-terminal of chains Структура фибриногена E D D

Упрощенная структура фибриногена D D E

From MW Mossesson Fibrin Polymerization and its regulatory Role In Haemotasis J. Lab. Clin. med. pp 8-17, July 1990 thrombin fibrin Фибриноген

Фибрин-мономер Формирование фибрина D D E D D E + 2 фибринопептида A + 2 фибринопептида B fpA: A 1-16 fpB: B 1-14 Тромбин ( IIa) Adapted from Moseson MW, J Lab Clin Med, 1990 Фибрин- мономер

Формирование фибрина Adapted from Moseson MW, J Lab Clin Med, 1990 Фибрин мономер

Водородные нековалентные связи Растворимый Фибрин-полимер Adapted from Moseson MW, J Lab Clin Med, 1990 Формирование фибрина Фибрин- мономер

Ковалентные связи Нерастворимый Фибрин-полимер Adapted from Moseson MW, J Lab Clin Med, 1990 Фактор XIIIa Формирование фибрина

From MW Mosesson, Fibrin Polymerization and Its Regulatory Role In Haemostasis J. Lab. Clin. Med. pp 8-17, July 1990 Формирование фибрина

Эритроцитарно-тромбоцитарный сгусток и сеть фибрина

Фибринолиз Восстановление тканей

Фибринолиз Растворение сгустка Предотвращение тромбоза Фибринолиз

Стабилизированный (нерастворимый) Фибриновый сгусток Фибриноген Фибрин мономер + фибринопептиды Растворимый Фибрин полимер XIIIa Тромбин Коагуляция

Эндотелий XII Scu-PA Калликреин PAI-1 t-PA Tcu-PA PAI-1 Плазминоген Плазмин AP С 1 IN 2 MG Продукты деградации фибрина Фибрин D-димер Продукты деградации фибриногена Фибриноген t-PA: Тканевой активатор плазминогена, Scu-PA, Tcu-PA : Урокиназа PA PAI-1: Ингибитор активатора плазминогена 1, AP: 2 Aнтиплазмин 2MG: 2MG Макроглобулин, С 1 -IN:С 1 Ингибитор Фибринолиз

плазмин Adapted from Moseson MW, J Lab Clin Med, 1990 плазмин Фибринолиз

DD E Д-димер Е Adapté de Moseson MW, J Lab Clin Med, 1990 Продукты деградации фибрина (ПДФ)

From Physiologie de la Fibrinolyse, Alessi et al., Manuel d'hémostase, Option Bio, 1996, pp 70 DD DD E D D DY E DD E YY DD E D XD E DD E D XY E DDDD DXD E D D DD E YXD E DDD E D XX E DDDD EE YXY E DDDD E D XXD Фибринолиз Д-димер - специфический продукт расщепления поперечно-сшитого фибрина плазмином Фибринолиз

Продукты деградации фибрина (ПДФ) Фибриноген ПДФ-X ПДФ-D ПДФ-Y ПДФ-E ПДФ-D Действие Плазмина

D-димер E Фибриновый сгусток Фибриноген DE D Фибрин-мономер + фибринопептиды растворимый фибрин полимер XIIIa Тромбин Плазмин Коагуляция и фибринолиз Продукты деградации фибрина Продукты деградации фибриногена

Хромогенные (колориметрические) методы исследования гемостаза определяется активность отдельных факторов коагуляции, фибринолиза, антикоагулянтов Плазминоген Стрептокиназа + [PLG+SK] Tos-Gly-Lys-pNA+H 2 0 [PLG+SK] Tos-Gly-Lys-OH + p-nitroaniline (Желтая окраска) Mix + Inc. 10min +37 o C Интенсивность окраски пропорциональна активности фактора или ингибитора Пример: Определение активности плазминогена

Маркеры активации гемостаза Показатель Характеристика Диагностическое значение D-димеры Продукты, образующиеся при лизисе фибрина под влиянием плазмииа. Накапливаются при активации гем о коагуляции и фибринолиза Выявление/исключение ДВС. тромбоза глубо­ких вен. эмболии легочной артерии, оценка эффективности тромболитической терапии ТАТ-тромбин-анти- тромби новый комплекс Комплексы взаимодействия тромбина и анти- хромбина. Отражают количество образующе­гося тромбина в системе циркуляции за ко­роткий период Выявление исключение ДВС. тромбоза глубо­ких вен, эмболии легочной артерии, контроль за лечением антикоагулянтами F1 +2 -фрагменты про­тромбина Указывают на активацию протромбина фак­тором Ха и на образование тромбина in vivo. Отражают количество образующегося тромбина в системе циркуляции за длительный период Выявление/исключение ДВС, тромбоза глубо­ких вен, эмболии легочной артерии, контроль за лечением гепарином и непрямыми антикоа­ гулянтами. Наследственный или приобретенный дефицит ингибиторов РФМК Фибрин-мономеры и олигомеры. а также их комплексы с ПДФ. Отражают активность тромбнна in viva Выявление/исключение ДВС, тромбоза глубо­ких вен, эмболии легочной артерии, контроль за лечением анти коагулянта ми ФПА -фибринопептид А Продукт протеолиза фибриногена. Отражает активность тромбина in vivo Выявление/исключение ДВС, тромбоза глубо­ких вен, эмболии легочной артерии, контроль за лечением антикоагулянтами ПДФ Продукты деградации фибрина/фибриногена под влиянием плазмина Определяют состояние гиперфибринолиза, повышаются у больных с тромбозами (реактивный фибринолиз) и ДВС, при лечении фибринолнтиками ПАП плазмин - (анти - плазминовый комплекс Отражает образование плазмина in vivo Выявление гиперфибринолиза или реактивного фибринолиза. ДВС, инфаркта миокарда, неста­ бильной стенокардии PF4 - фактор 4 тромбоцитов, [i- TG |3-тромб о- глобулин Метаболиты, освобождаемые из тромбоцитов в плазму. Отражают активацию тромбоцитов in vivo Диагностика гиперакгивного состояния тромбоцитов, артериального тромбоза, повре­ждения сосудов, инсульта vWF-фактор Виллебранда Освобождается из эндотелиальных клеток. Маркер повреждения шдотелиальных клеток Диагностика поражения сосудистой стенки, фактор риска инфаркта миокарда и инсульта ТМ Мембранный белок в эндотелиагтьных клетках, в плазме - маркер повреждения эндотелия Диагностика повреждения сосудистой стенки, ДВС- синдрома ф.ХПа Активный фактор XII, указывает на активацию контактной фазы Фактор риска сердечно-сосудистых заболеваний

Классификация маркеров активации свертывания крови Ранние – маркеры тромбинемии: Фрагмент протромбина (F1+2) Комплекс Тромбин-Антитромбин III (TAT) Маркеры фибринобразования: Фибрин-мономер (FM) Фибринопептид А (FPA) Поздние - маркеры фибринолиза Д-Димер (D-D) Комплекс плазминоген-α2-антиплазмин (ПАП);

Причины ДВС-синдрома Повреждение тканей (массивный контакткрови с тканевым фактором): Механическая травма (краш-синдром, проникающие повреждения, например повреждения мозга). Термальные повреждения Асфиксия и гипоксия. Оперативные вмешательства. Ишемия органов, инфаркты.Жировая эмболия. Гиповолемический/геморрагический/ анафилактический шок. Гипертермия. Онкология (контакт с онкологическими прокоагулянтами, тканевым фактором, фактором некроза опухоли, клеточными протеазами): Лейкозы. Инфекция (воздействие эндотоксинов, повреждение эндотелиальных клеток, актива ция тромбоцитов): Бактериальные инфекции Вирусные инфекции Протозойные - малярия. Токсический шок. Патология сосудов и циркуляторные нарушения(поражение эндотелия, активация тромбоцитов): Гигантская гемангиома, сосудистые опу холи. Аневризма аорты. Хирургические вмешательства на сосу дах, внутрисосудистые манипуляции. Опухоли сердца. Операции шунтирования сосудов сердца. Острый инфаркт миокарда. Васкулиты. Эмболия легочной артерии. Иммунологические нарушения (активация комплемента, экспозиция тканевого фактора): Анафилактические реакции. Аллергические реакции. Острые гемолитические посттрансфузи- онные реакции. Реакция отторжения трансплантата. Прямая активация ферментов: Панкреатит. Укусы ядовитых змей. Другие расстройства: Фульминантный некроз печени. Цирроз печени. Респираторный дистресс-синдром у взрослых. Инфузия концентратов протромбиново- го комплекса. Гемолитико-уремический синдром. Перитонит. Геморрагический шок. Гомозиготный дефицит протеинов С и S. Осложнения беременности ДВС у новорожденных

Развитие ДВС

Предосторожности при взятии крови Забор крови: 1. дать пациенту отдохнуть 20 минут 2. сидя 3. 1 час не курить часа не употреблять алкоголь 5. 1 час не употреблять кофеин 6. из периферической вены (v. cubitales)

Предосторожности при взятии крови Причины повышения свертываемости: 1. Эмоциональный стресс пациента 2. Перетягивание жгутом (более 60 секунд) 3. Тупая игла 4. Большой диаметр иглы 5. Плохая техника забора крови Важные «мелочи»: первая порция крови – не для гемостаза!!!

Методы исследования гемостаза СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ!