Промышленное получение аминокислот и их применение в медицине и диетологии Профессор, доктор биологических наук Лившиц В.А. Российский университет дружбы народов 2011

Аминокислоты –компоненты белков Структура белка Структура аминокислот

20 аминокислот, входящих в состав белков, и их обозначение

Универсальный генетический код

Синтез белка в клетке белок Мембрана клетки трансляция транскрипция Комплекс рибосома-мРНК- белок цитоплазма ядро «Заряженная» аминокислотой тРНК

В состав белков входят L-стереоизомеры аминокислот

- группа Неполярные алифатические аминокислоты Глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, метионин

Ароматические аминокислоты Фенилаланин, тирозин, триптофан

Циклическая Полярные, незаряженные аминокислоты Серин, треонин, цистеин, пролин, аспарагин, глутамин

Положительно заряженные аминокислоты Лизин, аргинин, гистидин

Отрицательно заряженные аминокислоты Аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота

Нестандартные аминокислоты 4-гидроксипролин, 5-гидроксилизин, 6-N-метиллизин, -карбоксиглутамат и десмозин 4-гидроксипролин карбоксиглутамат 5-гидроксилизин 6-N-метиллизин Десмозин

Специфическая последовательность аминокислот, включающая гидроксипролин,обеспечивает образование прочной спирали коллагена. Нестандартные аминокислоты появляются в белках в результате посттрансляционной модификации Нестандартные аминокислоты

В настоящее время установлено, что генетически кодируются 22 аминокислоты 21-я и 22-я аминокислоты - это селеноцистеин и пирролидин

Увеличить риск возникновения рака простаты, лёгких и толстого кишечника Вызвать нарушение репродуктивной функции Увеличить риск вирусных инфекций Способствовать развитию заболеваний сердца. Селеноцистеин синтезируется непосредственно на специальной тРНК и кодируется стоп-кодоном UGA. Он входит в состав ферментов оксидоредуктаз, которые играют важную роль в нейтрализации активных форм кислорода, которые способны повреждать многие клеточные структуры. Поэтому селен необходим для здоровья человека. Синтез селеноцистеина зависит от присутствия селена. Недостаток селена может Селеноцистеин и селен

Продукты и препараты, содержащие селен

Образование пептидной связи

Лизин (LYS) Метионин (MET) Треонин (THR) Изолейцин (ILE) Лейцин (LEU) Валин (VAL) Триптофан (TRY) Фенилаланин (PHE) Аргинин (ARG) Гистидин (HIS) Незаменимые аминокислоты Аргинин и гистидин могут синтезируются в организме человека и являются незаменимыми для детей. Обязательно должны поступать в организм человека с пищей

Заменимые аминокислоты Глицин (GLY) Аланин (ALA) Серин (SER) Пролин (PRO) Цистеин (CYS) Тирозин (TYR) Глутаминовая кислота (GLU) Глутамин (GLN) Аспарагиновая кислота (ASP) Аспарагин (ASN)

Образование заменимых аминокислот в клетках млекопитающих Аминокислота Как образуется Аланин Трансаминирование пирувата Аспарагиновая кислота Трансаминирование оксалоацетата Аспарагин Амидирование аспарагиновой кислоты Цистеин Транссульфурация метионина Глутаминовая кислота Аминирование a-кетоглутарата Глутамин Амидирование глутаминовой кислоты Серин Из гидроксипирувата Глицин Трансметилирование серина Пролин Из глутамата или орнитина Тирозин Гидроксилирование фенилаланина

Аминокислотный состав суммарного белка различен у разных организмов и зависит от возраста. Наиболее существенное различие в аминокислотном составе суммарного белка наблюдается у растений и животных. В растительных белках, как правило, существенно меньше незаменимых аминокислот, чем в белках человека и животных. В связи с этим растительные корма животных для придания им большей питательной ценности балансируют, добавляя незаменимые аминокислоты, в первую очередь, лизин, метионин, треонин и триптофан.

Способы получения аминокислот 1. Гидролиз белоксодержащих субстратов 2. Химический синтез 3.Химико-энзиматический синтез 4. Микробиологический синтез

1. Гидролиз белоксодержащих субстратов Белоксодержащие субстраты: Мясо Молоко (казеин) Семена бобовых культур (соя) В Китае налажено производство L-цистеина (3000 т) из человеческого волоса. Кислотный гидролиз белка обычно приводит к образованию смеси из 18 L-аминокислот. Недостатки метода: Дорогое сырьё Трудность выделения отдельных аминокислот из полученной смеси. Метод используется в том случае, когда сырьё бросовое – (отходы производства). Аминокислоты получают в результате гидролиза белоксодержащих субстратов (ферментативный или кислотный гидролиз)

2. Химический синтез Аминокислоты синтезируются химически на основе определённых (не биогенных) соединений, обычно в несколько этапов. Недостатки метода: Химический синтез требует дорогостоящего оборудования, осуществляется при высоких температурах и давлении. Исходные соединения могут быть токсичными или агрессивными, опасными для работающего персонала. В процессе производства образуются вредные отходы, загрязняющие окружающую среду. При химическом синтезе получают рацемическую смесь D,L-аминокислот. В случае некоторых аминокислот (например, треонина) синтезируется 4 изомера, из которых только один биологически активен. Метод используется для синтеза не имеющего стереоизомеров глицина (аминоуксусной кислоты), а также метионина, поскольку в организме человека и животных D-метионин превращается с помощью фермента рацемазы в L-метионин.

3. Химико-энзиматический синтез Синтез осуществляется в два этапа. На первом этапе получают предшественник аминокислоты, например карбоновую кислоту. На втором этапе это предшественник превращают с помощью ферментов микроорганизмов в соответствующую L-аминокислоту. Недостатки метода: Первый этап – это химический синтез предшественника, со всеми особенностями этого метода. В ряде случаев синтез предшественника и его последующее превращение в аминокислоту являются трудоёмкими и дорогостоящими. Метод используется для получения L-аспарагиновой кислоты из фумаровой кислоты и аммиака в присутствии фермента аспартазы. Источник фермента – иммобилизованные клетки бактерий, например, Escherichia coli или Serratia marcescens. Аналогичным образом из коричной кислоты в присутствии клеток дрожжей получают L-фенилаланин.

4. Микробиологический синтез При прямом микробиологическом синтезе специально полученные бактерии-продуценты при росте на жидких средах простого состава потребляют источники углерода и азота, а взамен выделяют в среду целевую аминокислоту. Преимущества метода: Микроорганизмы синтезируют биологически активные L-аминокислоты. Используется сравнительно простое оборудование. Используются возобновляемые сырьё и простые минеральные соли Отходы производства небольшие. Возможно организация безотходного экологически чистого процесса. Процесс биосинтеза осуществляется при невысоких температурах и производство не сопряжено с серьёзной опасностью для работающего персонала. С помощью микробиологического синтеза сегодня получают многие заменимые и незаменимые аминокислоты: глутаминовую кислоту, лизин, треонин, триптофан, аргинин, лейцин, изолейцин, валин, фенилаланин, пролин, серин. В процессе разработки и продуценты других аминокислот.

Микробиологический синтез 5 семейств аминокислот на основе их происхождения в процессе биосинтеза Аминокислоты синтезируются из различных интермедиатов Центрального метаболизма.

Микробиологический синтез Бактерии способны синтезировать все 20 аминокислот. Но синтез каждой аминокислоты и её концентрация в клетках строго регулируется. Регуляция осуществляется по механизму обратной связи с помощью: ретроингибирования – подавления активности ключевого фермента одним конечным продуктом; совместного ретроингибирования – подавления активности ключевого фермента двумя или несколькими конечными продуктами; репрессии или аттенюации – подавления экспрессии генов (т.е., в конечном итоге - синтеза ферментов), контролирующих данный биосинтетический путь; совместной репрессии или аттенюации; активацией или подавлением транспорта аминокислоты в клетку и из клетки. Селекция регуляторных мутантов, у которых нарушен механизм ретроингибирования и репрессии является важным приёмом получения штаммов-продуцентов аминокислот. В некоторых случаях очень важно с самого начала активировать транспорт аминокислоты из клеток (экспорт аминокислоты).

Первая аминокислота, которую стали получать на основе микроорганизмов – глутаминовая кислота (штамм-продуцент - Corynebacterium glutamicum). Эта бактерия - природный ауксотроф по биотину. При культивировании в условиях дефицита биотина индуцируется активный выброс глутамата из клетки. Микробиологический синтез Схема получения глутамата натрия с помощью ферментации

Микробиологический синтез Биосинтез лизина у Cor. glutamicum регулируется с помощью механизма совместного ингибирования Lys + Thr аспартаткиназы и Thr - гомосериндегидрогеназы. Для создания продуцента лизина вводят мутацию, блокирующую синтез Thr, или получают мутацию, нарушающую ретроингибирование. Такая мутация придаёт устойчивость к аналогу Lys. Структура лизина и его аналога АЭЦ Момент исчерпания треонина из среды Экспортёр лизина Блок синтеза Thr

АСПАРТАТ ИЗОЛЕЙЦИН Регуляция биосинтеза треонина у Escherichia coli Ретроингибирование thrA1, 2thrBР АСПАРТИЛ- ФОСФАТ АСПАРТАТ ПОЛУАЛЬДЕГИД ГОМОСЕРИН ФОСФАТ ТРЕОНИН thrC Аттенуация thrA1thrA2asdthrB thrC * Микробиологический синтез Ретроингибирование аспартаткиназы, продукта гена thrA, осуществляется у E. coli треонином. Аттенуация тренингового оперона на участке промотора происходит при одновременном увеличении содержания в клетке треонина и изолейцина.

Предварительные этапы получения Продукция треонина продуцента треонина: исходный штамм E. coli 0,0 селекция мутации устойчивости к аналогу (нарушающей ретроингибирование ключевого фермента) 0,5 г/л нарушение репрессии (аттенюации) thr-оперона (введением мутации, блокирующей синтез изолейцина) 5 г/л Микробиологический синтез Получение продуцента треонина традиционными методами В дальнейшем на основе полученного штамма впервые в мире с помощью метода рекомбинантных ДНК (генетической инженерии) был получен эффективный штамм-продуцент аминокислоты (треонина). С этой целью тренинговый оперон (гены thrA, thrB, thrC) из этого штамма клонировали в мультикопийный вектор и получили плазмидный продуцент. Это произошло во ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов (СССР) в 1978 г.

Микробиологический синтез Плазмидный штамм-продуцент треонина Треониновый оперон E. coli, несущий гены thrA, thrB и thrC c мутацией в гене thrA, был встроен в плазмиду pBR322. Полученную рекомбинантную плазмиду pYN7, которую ввели в клетки бесплазмидного продуцента, полученного ранее. В результате был создан первый рекомбинантный штамм-продуцент треонина. Хотя активность ферментов аспартаткиназы и гомосериндегидрогеназы в клетках этого штамма возросла в 20 раз, продукция треонина увеличилась всего в 6 раз – штамм накапливал более 30 г/л треонина. Тем не менее, это был рекордный для того времени результат. Важнейшую роль в дальнейшем улучшении штамма сыграло обнаружение гена (rhtA), кодирующего синтез белка-экспортёра треонина и гомосерина. Мутация rhtA23, повышающая уровень экспрессии этого гена, увеличила продукцию треонина в 2,5 раза. Кроме того, метаболизм штамма был изменён таким образом, что он перестал расщеплять треонин, в нём стало синтезироваться больше предшественника треонина – аспартата. В настоящее время продуценты треонина, полученные на основе этого штамма, накапливают в среде более 100 г/л треонина, причём треонин составляет 96-98% от всех продуцируемых метаболитов.

Диффузия Метаболизм и транспорт треонина у Escherichia coli ТРЕОНИН ГЛЮКОЗА ФТС Глюкозо-6-фосфат АСПАРТАТ АСПАРТИЛ- ФОСФАТ ГОМОСЕРИН ТРЕОНИН АСПАРТАТ ПОЛУАЛЬДЕГИД ГОМОСЕРИН ФОСФАТ Sst TdcC ТРЕОНИН L ivHM ТРЕОНИН Синтез белка Катаболизм RhtA RhtC RhtB RhtA ГОМОСЕРИН NH 4 + Усиление активного транспорта аминокислоты из клетки за счёт активации экспрессии соответствующих генов играет важную роль при создании промышленных штаммов-продуцентов аминокислот. Гены, контролирующие экспорт треонина, впервые описаны российскими учёными.

Технология получения аминокислот микробиологическим методом Для получения аминокислоты штамм-продуцент культивируют, т.е. выращивают в ферментёре. Процесс включает следующие этапы: 1. Приготовление питательных сред и добавок. 2. Подготовка ферментёров к работе. 3. Засев «посевного» ферментера и выращивание в нём посевного материала. 4. Засев ферментационной среды в рабочем ферментёре посевным материалом. 5. Процесс «ферментации» аминокислоты в ферментёре в условиях интенсивной аэрации и pH-статирования при дробной подаче источника углерода и азота. 5. По завершению «ферментации» отделяют биомассу (фильтрацией, сепарированием или центрифугированием на проточной центрифуге). 7. Выделение аминокислоты из культуральной жидкости обычно проводят методом ионного обмена на колоннах с ионообменной смолой. 8.Раствор, полученный после элюции водой с колонны, упаривают и отделяют выпавшие кристаллы. 9. После повторных прцедур перекристаллизаций и дополнительной очистки получают апирогенные препараты медицинского назначения.

Лабораторные и промышленные ферментёры

Аминокислота Произведено в 2002 году (т) Произведено в 2006 году (т) Основное применение Глутаминовая кислота ~ ~ Усилитель вкуса (пищевая промышленность) Лизин ~ ~ Кормовая добавка (животно- водство и птицеводство) Треонин ~ ~ Кормовая добавка(животно- водство и птицеводство) Фенилаланин ~ ~ (без Китая) Получение подсластителя аспартама (метиловый эфир L- аспартил-L-фенилаланина) Триптофан ~ 500~ Кормовая добавка Фармацевтическое производство Аргинин ~ 2000~ 3000 Фармацевтическое производство Лейцин Изолейцин Валин ~ 1000~ 2000 Фармацевтическое производство Производство аминокислот в мире микробиологическим синтезом

Рост мирового производства лизина микробиологическим синтезом

Применение аминокислот Аминокислоты и аминокислот комплексы как самостоятельные лекарственные препараты и БАДы Глицин Глутаминовая кислота Метионин Цистеин Гистидин Триптофан Аргинин Орнитин Лизин Лейцин Изолейцин Валин Глутамин Фенилаланин Серин

По современным данным глицин (Г), является центральным нейромедиатором тормозного типа действия. Обладает глицин- и ГАМК-ергическим, альфа 1- адреноблокирующим, антиоксидантным, антитоксическим действием; регулирует деятельность глутаматных (NMDA) рецепторов. За счет этого Г способен: уменьшать психоэмоциональное напряжение, агрессивность, конфликтность, повышать социальную адаптацию; улучшать настроение; облегчать засыпание и нормализовать сон; повышать умственную работоспособность; уменьшать вегето- сосудистые расстройства (в т.ч. и в климактерическом периоде); уменьшать выраженность общемозговых расстройств при ишемическом инсульте и черепно-мозговой травме; уменьшать токсическое действие алкоголя и других лекарственных средств, угнетающих функцию ЦНС. Показания к применению: сниженная умственная работоспособность. стрессовые ситуации – психоэмоциональное напряжение (в период экзаменов, конфликтных и т.п. ситуациях); девиантные формы поведения детей, подростков; различные функциональные и органические заболевания нервной системы сопровождающиеся повышенной возбудимостью, эмоциональной нестабильностью, снижением умственной работоспособности и нарушением сна (неврозы, неврозоподобные состояния и вегето-сосудистая дистония, последствия нейроинфекций и черепно-мозговой травмы, перинатальные и другие формы энцефалопатий,в т.ч. алкогольного генеза; ишемический инсульт. Глицин

Особая роль метионина (М) в обмене веществ связана с тем, что он содержит подвижную метильную группу (-СНз), которая может передаваться на другие соединения (реакции переметилирования). С пособностью М отдавать метильную группу обусловлен его липотропный эффект (удаление из печени избытка жира). М способствует синтезу холина с недостаточным образованием которого связаны нарушение синтеза фосфолипидов из жиров и отложение в печени нейтрального жира. Липотропным свойством обладает также богатый М белок казеин (и содержащий его творог. М участвует в синтезе адреналина, креатина и других биологически важных соединений; активирует действие гормонов, витаминов (В 12, аскорбиновой и фолиевой кислот), ферментов. Путем метилирования и транссульфирования, метионин обезвреживает токсичные продукты. Применяют М для лечения и предупреждения заболеваний и токсических поражений печени (цирроз, поражения мышьяковистыми препаратами, хлороформом, бензолом и другими веществами), а также при хроническом алкоголизме, сахарном диабете и др. Эффект более выражен при жировой инфильтрации клеток печени. При вирусном гепатите применять М не рекомендуется. М назначают для лечения дистрофии, возникающей в результате белковой недостаточности у детей и взрослых после дизентерии и других хронических инфекциях.Введение метионина при атеросклерозе вызывает снижение содержания и крови холестерина и повышение уровня фосфолипидов. Коэффициент фосфолипиды/холестерин повышается. Метионин

Глутаминовая кислота (глутамат) Глутамат (Г) является нейромедиатором, стимулирует передачу возбуждения в синапсах ЦНС. Участвует в синтезе других аминокислот, ацетилхолина, АТФ, способствует переносу ионов калия, улучшает деятельность скелетной мускулатуры (является одним из компонентов миофибрилл). Оказывает дезинтоксикационное действие, способствует обезвреживанию и выведению из организма аммиака. Нормализует процессы гликолиза в тканях, оказывает гепатопротекторное действие, угнетает секреторную функцию желудка. Показания к применению: Эпилепсия (преимущественно малые припадки с эквивалентами), шизофрения, психозы (соматогенные, интоксикационные, инволюционные), реактивные состояния, протекающие с явлениями истощения, депрессия, последствия менингита и энцефалита, токсическая нейропатия на фоне применения гидразидов изоникотиновой кислоты (в сочетании с тиамином и пиридоксином), печеночная кома. В педиатрии задержка психического развития, церебральный паралич, последствия внутричерепной родовой травмы, болезнь Дауна, полиомиелит (острый и восстановительный периоды). Входит в состав препаратов для профилактики стрессов (Глутамевит - содержит глутамат, витамин А, тиамина хлорид или тиамина бромид, рибофлавин, пиридоксина гидрохлорид, аскорбиновую кислоту, альфа-токоферол ацетат, никотинамид, фолиевую кислоту, рутин, кальция пантотенат, железа сульфат закисный, меди сульфат, калия сульфат, кальция фосфат)

Препараты на основе цистеина Цистеин (Ц) является заменимой аминокислотой; может синтезироваться в организме с использованием метионина. При отсутствии метионина или при нарушении превращения метионина в Ц недостаток этой кислоты может привести к нарушению обменных процессов в организме, в частности обмена веществ в хрусталике глаза, а изменения, происходящие при катаракте, связаны с нарушением концентрации этой аминокислоты в хрусталике. Показания к применению: Катаракта (в т.ч. возрастная, миопическая, лучевая, контузионная). В виде 2% раствора на дистиллированной воде для глазных ванночек. Электрофорез 5% водного раствора (с отрицательного полюса). Раствор готовят непосредственно перед применением на дистиллированной воде. Таурин (Т), образуется в в организме в процессе превращения цистеина. Т стимулирует процессы репарации и регенерации при заболеваниях дистрофического характера и заболеваниях, сопровождающихся резким нарушением метаболизма глазных тканей. Показания к применению : Дистрофия роговицы; старческие, диабетические, травматические и лучевые катаракты; травмы роговицы; дистрофические поражения сетчатой оболочки глаза. Ацетилцистеин (АЦ) обладает муколитическим, отхаркивающим, детоксицирующим действием. Показания к применению : Затрудненное отделение мокроты (бронхит, пневмония, бронхоэктатическая болезнь), бронхиальная астма, муковисцидоз легких, отиты, риниты, синуситы, осложнения при операциях на органах дыхания (профилактика), отравление парацетамолом (в качестве антидота).

Смеси аминокислот для парэнтерального питания Применение аминокислот Аминокислоты являются основным источником азота для организма человека. Препараты для парэнтерального питания содержат различные смеси очищенных аминокислот. Адекватность аминокислотных смесей (биологическая ценность) оценивают по наличию и соотношению в их составе заменимых и незаменимых аминокислот. При этом оптимальными считают те синтетические аминокислотные смеси, которые содержат незаменимые и заменимые L-аминокислоты в тех же пропорциях, в каких они находятся в яичном белке. Значение биологической ценности выражается в процентах относительно состава цельного яичного белка (100%), что позволяет точно дифференцировать биологическую ценность аминокислотных смесей. Включение всех 20 аминокислот (8 незаменимых и 12 заменимых) обеспечивает поддержание аминокислотного гомеостаза в крови уже во время введения препарата, снимает дополнительную нагрузку на организм, связанную с необходимостью синтезировать заменимые аминокислоты в условиях стресса, исключает снижение скорости синтеза белка из-за недостатка той или иной аминокислоты.

Наименование препарата Количество аминокислот Аминокислот ы, г/л Углеводы, г/л Биологическая ценность, % Полиамин сорбит 56 Вамин глюкоза 78 Аминосол КЕ Аминосол сорбит 52 Инфезол ксилит 61 Аминоплазмаль СЕ сорбит 87 Характеристики некоторых препаратов для парэнтерального питания, наиболее часто используемых в России

Применение аминокислот СИНТЕЗ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ПЕПТИДОВ Чистые аминокислоты – исходные субстраты для синтеза биологически активных пептидов, которые играют важную роль в регуляции функций различных органов и систем организма человека. Кроме того, некоторые пептиды нашли применение в пищевой промышленности. Например, сладкий дипептид аспартам (метиловый эфир аспартил-фенилаланина) Сладкий дипептид - аспартам

Аминокислоты используют для придания большей питательной ценности пище на основе растительных продуктов Аминокислоты используют в качестве БАДов и в специальных диетах для спортсменов и лиц, которые испытывают большие физические нагрузки. Аминокислоты используют в приготовлении так наз. «синтетической пищи» для больных с наследственными дефектами метаболизма аминокислот. Применение аминокислот Важная область применения аминокислот - диетология.

Деградация аминокислот до интеримедиатов ЦТК и глюконеогенез Поступающие с пищей, но не используемые для синтеза белка аминокислоты разрушаются и усваиваются как интермедиаты цикла трикарбоновых кислот, участвуют в глюконеогенезе (образовании глюкозы).

Некоторые генетические нарушения обмена аминокислот у человека Заболевание Нарушенный процесс Частота (на новорожденных) Симптомы и последствия Альбинизм <3 Синтез меланина Отсутствие пигментации, светлые из тирозина волосы, розовый цвет кожи Алькаптонурия <0,4 Деградация тирозина Темный пигментв моче, поздно развивающийся артрит Аргининемия <0,5 Синтез мочевины Задержка умственного развития Гомоцистеинемия <0,5 Деградация метионина Неправильное развитие костей задержка умственного развития Болезнь кленового <0,4 Деградация лейцина, Рвота, судороги, задержка сиропа (лейциноз) изолейцина и валина умств. развития, ранняя смерть Фенилкетонурия <8 Превращение фенил- Рвота новорожденных, аланина в тирозин задержка умственного развития Больные с наследственными дефектами метаболизма аминокислот нуждаются в специальной диете с ограниченным содержанием аминокислоты, обмен которой нарушен.

БАДы на основе аминокислот Применение аминокислот

БАДы на основе аминокислот Применение аминокислот

Возраст: 38 дней. Вес: 2,25 кг. В животноводстве и птицеводстве незаменимые аминокислоты используют для балансировки кормов при получении «скороспелого мяса».

Применение аминокислот в разных странах Собственное биотехнологическое производство аминокислот в России отсутствует. В 2010 г. в страну было импортировано около т лизина и 5000 т треонина.