Кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии Лектор ст.преп. Малярчук А.Р. МОРФОЛОГИЯ И ФИЗИОЛОГИЯ ВИРУСОВ.

Д.Й. Ивановский Термин вирус означает яд.

Вирусы - это неклеточные системы живых существ, которые отличаются своими малыми размерами, отсутствием в вирионе белоксинтезирующих и энергогенерирующих систем, а также облигатным внутриклеточным паразитизмом. Целая вирусная частица называется вирионом Термин вирус означает яд.

Главное свойство вируса - предоставить свой геном в клетке-хозяине, для того, чтобы состоялась его экспрессия (трансляция и транскрипция)

За своей степенью опасности для людини вирусы разделяют на четыре группы. 1 группа: возбудители лихорадки Эбола, Ласса, Марбурга, Мачупо, натуральной оспы, а также вирус гепатита В (мартышек). ІІ группа - арбовирусы, некоторые ареновирусы, вирусы бешенства, вирусы гепатита С и В человека, ВИЧ. ІІІ группа - вирусы гриппа, полиомиелита, энцефаломиокардита, осповакцины. ІV группа - аденовирусы, коронавирусы, герпесвирусы, реовирусы, онковирусы.

Принципы классификации вирусов (1) Тип нуклеиновой кислоты, ее структура, стратегия репликации (2) Размеры, морфология, симметрия вириона, число капсомеров, наличие суперкапсида. (3) Наличие специфических ферментов, особенно РНК- и ДНК-ПОЛИМЕРАЗ, нейраминидазы (4) Чувствительность к физическим и химическим агентам, особенно к эфиру (5) Иммунологические свойства (6) Естественные механизмы передачи (7) Тропизм к хозяину, его тканям и клеткам (8) Патология, формирования включений (9) Симптоматология заболеваний.

Классификация вирусов ДНК-содержащие вирусы Parvoviridae Papovaviridae Adenoviridae Herpesviridae Poxviridae Hepadnaviridae Iridovoridae

Класификация вирусов РНК- содержащие вирусы Picornaviridae Reoviridae Togaviruses Arenaviridae Coronaviridae Retroviridae Bunyaviridae Orthomyxoviruses Paramyxoviruses Rhabdoviridae Caliciviridae Flaviviridae Filoviridae Birnaviridae

Структура вирусов A – простой вирус B – сложный вирус

Строение вирусов

Спиральный тип симметрии Вирусы мозаичной болезни табака

Икосаэдрический, кубический, квази сферический тип симметрии

Комбинованый (смешанный) тип симметрии

Классификация вирусов (РНК-содержащие ) Семейство вирусов Нали- чие супер- кап- сида Тип симметрии Структура РНК Вирусы патогенные для человека Picornaviridae НетКубичес кий Однонитчастая, линейная, не- сегментированннная, плюс Полиовирус, риновирус, вирус гепатита А Caliciviridae НетКубичес кий Однонитчастая, линейная, не- сегментированннная, плюс Вирус Норвoлк, вирус гепатита Е Reoviridae НетКубичес кий Двухнитчастая, 10 сегментов Реовирус, ротавирус Flaviviridae ДаКубичес кий Однонитчастая, линейная, не- сегментированннная, плюс Вирусы клещевого энцефалита, японского энцефалита, желтой ли-хорадки, лихорадки Западного Нила, гепатита С Togavirus ДаКубичес кий Однонитчастая, линейная, 2 сегменты, плюс Вирус краснухи

Семейство вирусов Нал и- чие супе р- кап- сида Тип симметрии Структура РНК Вирусы патогенные для человека Retroviridae ДаКубич еский Однонитчастая, линейная, не- сегментированнна я, плюс ВИЧ, вирус Т-клеточной лейкемии человека Orthomyxovirus ДаСпира льный Однонитчастая, линейная, 8 сегментов, минус Вирусы гриппа Paramyxoviridae ДаСпира льный Однонитчастая, линейная, не- сегментированнна я, минус Вирусы парагриппа, кори, паротита, респираторно- синцитиальный вирус Rhabdoviridae ДаСпира льный Однонитчастая, линейная, не- сегментированнна я, минус Вирус бешенства Классификация вирусов (РНК- содержащие)

Семейство вирусов Нали -чие супе р- кап- сида Тип симметрии Структура РНК Вирусы патогенные для человека Filoviridae ДаСпира льный Однонитчаста я, линейная, не- сегментированн ная, минус Вирус Эбола, вирус Марбурга Coronaviridae ДаСпира льный Однонитчаста я, линейная, не- сегментированн ная, плюс Коронавирусы Arenaviridae ДаСпира льный Однонитчаста я циркулярная, 2 сегменты, минус Вирус лимфоцитарного хориоменингита Bunyavirus ДаСпира льный Однонитчаста я циркулярная, 3 сегменты, минус Хантавирусы, вирус Кримской- Конго геморрагической лихорадки, вирус геморрагической лихорадки с почечным синдромом Классификация вирусов (РНК- содержащие)

Семейство вирусов Нали- чие супер- кап- сида Тип симметрии Структура РНК Вирусы патогенные для человека Bornaviridae ДаКубич еский Однонитчастая, линейная, не- сегментированнна я, минус Вирусы болезни Борна Astroviridae НетКубич еский Однонитчастая, линейная, не- сегментированнна я, плюс Астровирусы человека Deltavirus (не классифицированный вирус Данеизве стный Однонитчастая, циркулярная, кольцо, минус Вірус гепатиту Дельта Классификация вирусов (РНК- содержащие)

Классификация вирусов (ДНК- содержащие) Papovaviridae НетКубичес кий Двухнитчаст ая, циркулярна Вирус папилломы Adenoviridae НетКубичес кий Двухнитчаст ая, линейная Аденовирус Hepadnavirus ДаКубичес кий Двониткова, дефектна, циркулярна Вирус гепатита В Herpesviridae ДаКубичес кий Двухнитчаст ая, линейная Вирус простого герпеса 1, 2, опоясывающего герпеса- ветрянки, цитомегаловирус, Эпштейна-Барр вирус Poxviridae ДаСмеша- нный Двухнитчаст ая, линейная Вирус натуральной оспы, вирус вакцины Parvoviridae НетКубичес кий Однонитчас тая,,линейная Вирусы гастроэнтерита, инфекционной эритемы, гемолитической болезни Семейство вирусов Нали -чие супе р- кап- сида Тип симметрии Структура ДНК Вирусы патогенные для человека

Химический состав вирусов В состав вирусов входит нуклеиновая кислота, белок, липиды, гликолипиды, гликопротеиды. Они всегда содержат один тип нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК), которая составляет от 1 % до 40 % массы вириона. Вирусные геномы содержат информацию, достаточную для синтеза лишь нескольких белков. Их масса достигает мг, что в 1 млн. раз меньше, чем в клетки, а длина- до 0,093 мм Число нуклеотидных пар колеблется от 3150 (вирус гепатита В) до (вирус натуральной оспы).

Белки вирусов (70-90 %) разделяются на структурные и неструктурные. Структурными - белки, которые входят в состав зрелых внеклеточных вирионов. Они выполняют ряд важных функций: - защищают нуклеиновую кислоту от внешнего повреждения взаимодействуют с мембранами чувствительных клеток обеспечивают проникновения вируса в клетку - имеют РНК- и ДНК-ПОЛИМЕ-РАЗНУЮ активность и др.

Неструктурные белки не входят в состав зрелых вирионов, однако образуются во время их репродукции. Они: - обеспечивают регуляцию экспрессии вирусного генома - являются предшественниками вирусных белков, способные подавлять клеточный биосинтез.

В зависимости от расположения в вирионе, белки разделяются на капсидные, суперкапсидные, матриксные, белки сердцевины и ассоциируемые с нуклеиновой кислотой.

Липиды (15-35 %) содержатся в сложных вирусах и входят в состав суперкапсидной оболочки, образовывая ее двойной липидный слой. Они: - стабилизируют вирусную оболочку - обеспечивают защиту внутренних слоев вирионов от гидрофильных веществ внешней среды - принимают участие у депротеинизации вирионов. Липопротеиды - комплекс липидов клеточной мембраны и вирусных суперкапсидных белков, какие они приобретают при выделении из клетки во время репродукции.

Молекулы углеводов входят в состав гликопротеинов, гликолипидов, достигая 3,5-9 %. Они играют важную роль, обеспечивая защиту соответствующих молекул от действия клеточных протеаз.

Репродукция вирусов. дизъюнктивный Особенности ее заключаются в том, что геномы представлен как РНК, так и ДНК, они многообразные за структурой и формой, почти все вирусные РНК способны реплицироваться независимо от ДНК клетки.Вирусам присущий дизъюнктивный способ репродукции. Последний заключается в том, что синтез генома и белков вируса разорван в пространстве и времени: нуклеиновые кислоты реплицируются в ядре клетки, белки - в цитоплазме, а сбор целых вирионов может происходить на внутренней поверхности цитоплазматичної мембраны. Репродукция вирусов - уникальная система воссоздания чужие родной информации в клетках эукариотов и обеспечивает абсолютное подчинение клеточных структур потребностям вирусов.

В репродукции вирусов выделяют ряд стадий. ранним К ранним принадлежит адсорбция вирусов на поверхности клетки, проникновение (пенетрация) их внутрь клетки и их раздевание (депротеинизация). Поздние (стратегия вирусного генома) Поздние стадии (стратегия вирусного генома) включают синтез вирусных нуклеиновых кислот, синтез белка, сбор вирионов и выход вирусных частиц из клетки.

Прикрепление вирусов к поверхности клетки обеспечивается двумя механизмами: неспецифическим и специфическим. Неспецифический определяется силами электростатического взаимодействия, что возникает между химическими группами на поверхности вирусов и клеток, которые несут разные заряды. Специфический механизм (обратная и необоротная адсорбция) предопределяется комплементарными вирусными и клеточными рецепторами. Они могут иметь белковую, углеводную, липидную природу. Например, рецептором для вирусов гриппа является сиаловая кислота. Число рецепторов на участках адсорбции может достигать На поверхности вирусов рецепторы, как правило, расположены на дне углублений и щелей.

Проникновение вирусов внутрь клетки происходит за механизмом рецепторного эндоцитоза (вариант виропексиса) на специальных участках клеточных мембран, которые содержат особенный блок с высокой молекулярной массой - клатрин. Мембраны инвагинируются, и образуются покрытые клатрином внутриклеточные вакуоли. их число может достигать Вакуоли, объединяясь, образуют рецептосоми, а последние сливаются с лизосомами. Поверхностные белки вирусов взаимодействуют с мембранами лизосом, а их нуклеопротеид выходит в цитоплазму.

Однако существует еще один механизм проникновения вирусов в клетку - индукция слияния мембран. Она происходит благодаря особенному вирусному белку слияния (F- от fusion - слияние). В результате этого процесса вирусная липопротеидная оболочка интегрирует с клеточной мембраной, а геном его проникает в клетку. Такой белок идентифицирован у вирусов гриппа, парагриппа, рабдовирусов и др.

Раздевание вирионов - многостепенный процесс, во время которого высвобождается их нуклеиновый аппарат, исчезают защитные оболочки, которые тормозят экспрессию генома. Происходит оно в специализированных участок - лизосомах, аппарате Гольджи.

Поздние стадии репродукции направлены на синтез вирусных нуклеиновых кислот и белка. Механизм репликации (образование вирусных геномов, которые являются точной копией предшественника) зависит от особенностей нуклеиновой кислоты. У разных видов вирусов он неодинаковый. Выделяют 6 основных классов репликации вирусов.

У двухнитчастых ДНК-СОДЕРЖАЩИХ вирусов (герепесвирусы, аденовирусы, вирусы натуральной оспы) сначала происходит деспирилизация ДНК и расхождение ее нитей. На одной из них по принципу комплементарности синтезируется новая нить ДНК, на второй - информационная (матричная) РНК (ИРНК или МРНК). Этот процесс длится, пока в клетках не образуется достаточное количество нуклеиновых кислот. У однонитчастых ДНК- ГЕНОМНЫХ вирусов процесс происходит при условии образования промежуточной формы ДНК.

Репликация у вирусов, которые содержат РНК, происходит за подобными закономерностями. На материнской РНК синтезируется ИРНК, а матрицей для синтеза вирусного генома служат промежуточные формы РНК.

Существенно отличается от предыдущих механизм репликации ретровирусов (онкорнавирусов). Их процесс репродукции тесно связан с репродукцией хозяина клетки. Сначала на РНК-вместительном геноме вируса происходит синтез нити ДНК с помощью РНК- зависимой ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ. За время некоторый синтезируется комплементарна нить ДНК, которая в дальнейшем интегрирует в геном хозяина клетки. В таком состоянии вирус длительное время сохраняется в клетке. Позже эта нить ДНК служит матрицей для образования вирусной РНК.

Транскрипцией называют процесс образования информационных (матричных) РНК. Она происходит с помощью специальных ферментов, которые называются ДНК- или РНК- зависимые РНК-полимеразы. У вирусов ДНК эти ферменты клеточного происхождения, а у РНК-вирусов - собственные вирусспецифические транскриптазы.

На стадии трансляции происходит считывание генетической информации из матричной РНК и перевод ее в последовательность аминокислот. Происходит процесс в рибосомах. Молекулы РНК продвигаются в рибосомах в соответствии с последовательностью триплетного кода, который распознают транспортные РНК. Последние несут на специальных участках аминокислоты.

Сборка вирионов - не до конца изученный процесс. В его основе лежит возможность специфического распознавания нуклеиновых кислот и вирусных белков при достижении их определенной концентрации. Подсчитано, что для образования одной вирусной частицы необходимо возле 10 тысяч молекул белков, липидов, углеводов, нуклеиновых кислот. Простые вирионы складываются на мембранах эндоплазматич- ного ретикулуму. У сложных вирусов он начинается в аналогичных участках, а заканчивается на цитоплазма- тической мембране. Простые вирусы оставляют клетку, как правило, путем «взрыва», разрывая ее мембрану. Сложные вирусы - почкованием. При этом клетка длительное время может оставаться жизнеспособной, пока полностью не истощится, продуцируя вирусных потомков.

Типы вирусной инфекции При производительной инфекции вирус функционирует в клетке автономно, а его репродукция происходит независимо от репродукции клеточного генетического аппарата. При этом образуется новое поколение вирулентных вирусов.Если цикл репродукции вирусов блокируется на одной из стадий, а инфекционные вирионы не образуется, такой тип взаимодействия обозначают как абортивный. Когда с клеткой взаимодействуют онкогенные РНК- вместительные вирусы (возбудители СИДа, лейкоза), нуклеиновая кислота интегрируется в клеточную хромосому и существует там в виде провируса. В результате может произойти изменение наследстве- нных свойств клетки. Такой тип взаимодействия называют вирогениею. Вирусы, которые вызывают вирогению, принадлежат к группе умеренных.

Определение размеров вирусов Фильтрование Седиментация в ультрацентрифуге Наблюдение в электронном микроскопе Сравнительные размеры: Staphylococcus имеет диаметр 1000 nm. Бактериофаги nm. Диаметр молекулы сывороточного альбумина 5 nm глобулина - 7 nm, гемоцианин (23 nm.

Культивирование вирусов Куриные эмбрионы дневного возраста. Способы заражения - открытый, закрытый

Культивирование вирусов Культуры клеток: - первично-трипсинизированные культуры эмбрионов человека, почек мартышек, фибробластов эмбриона курицы и тому подобное; способные расти на протяжении нескольких пасса- жей как вторичные культуры; перевиваемые клетки; они представляют собой культуры клеток, которые приобрели способность к неограниченному росту и размножению; Их получают из опухолей или из нормальных человеческих или животных тканей, которые имеют измененный кариотип. HeLa (карцинома шейки матки) Hep-2 (карцинома гортани человека), КВ (карцинома ротовой полости человека), RD (рабдомиосаркома человека), RH (почка эмбриона человека), Vero (почка зеленой мартышки), СПЭВ (почка эмбриона свиньи), ВНК- 32 (почка сирийского хомяка)

диплоидные клетки; они представляют собой культуры клетки одного типа, имеют диплоид- ный набор хромосом и способные выдерживать при этом до 100 пересеваний в условиях лабора- тории. Они являются удобной моделью для получения вакцинных препаратов вирусов, так как свободные от контаминации инородными вирусами, хранят исходный кариотип во время пассажей, не имеют онкогенной активности. Чаще всего пользуются линиями культур, которые получены с фибробластов эмбриона человека (WI-38, MRC-5, MRC-9, IMR-90), коров, свиней, овец и тому подобное. Культуры клеток хранят в замороженном состоянии. Культуры клеток

Питательные среды, которые используются для поддержки культур клеток или их роста бывают естественными или синтетическими (искусственными). Естественные среды - сыворотка крови крупного рогатого скота, жидкости из серозных полостей, продукты гидролиза молока, многообразные гидролизаты (5 % гемогидролизат, 0,5 % гидролизат лактоальбумина) или экстракты тканей. Их химический состав помогает создать условия, какие подобные к тем, что существуют в организме человека. Существенным недостатком таких сред считается их нестандартность, ведь качественный и количественный состав компонентов, которые входят к их составу, может изменяться.

Синтетические питательные среды не имеют этого недостатка, ведь их химический состав стандартен, потому что их получают комбинируя многообразные солевые растворы (витамины, аминокислоты) в искусственных условиях. К таким наиболее употребимым растворам принадлежат среда 199 (культивирование первинно-трипсинизированных и перевиваемых культур клеток), среда Игла (содержит минимальный набор аминокислот и витаминов и используется для культивирования диплоидных линий клеток и перевиваемых), среда Игла МЕМ (культивирование особенно требовательных линий клеток), раствор Хенкса, что используется для изготовления питательных сред, отмывания клеток и тому подобное.

Заражение лабораторных животных. Многочисленные лабораторные животные широко используются в вирусологии для выделения и идентификации вирусов, получения специфических противовирусных сывороток, изучения многообразных аспектов патогенеза вирусных заболеваний, разработки способов борьбы с заболеваниями и их профилактики. Чаще всего используют белых мышей разного возраста (двухдневного возраста), белых крыс, гвинейских свинок, кролей, сусликов, хлопчатниковых крыс, мартышек и других.

Существуют многообразные способы заражения животных в зависимости от тропизма вирусов, клинической картины заболевания и тому подобное. Исследуемый материал можно вводить: - через рот - в дыхательные пути (ингаляторно, через нос) - накожный - внутрикожно - подкожно, внутримышечный - внутривенно - внутрибрюшинно - внутрисердечно - на скарифицированную роговицу - в переднюю камеру глаза - в мозг.

Для выделения вирусов простого герпеса, натуральной оспы используют заражение лабораторных животных (кроликов) на скарифицированную роговицу глаза. При исследовании вирусов гепатита А вводят исследуемый материал через рот. При выделении вирусов с нейротропными свойствами, таких как арбовирусы, вирусы бешенства, полиомиелита, Коксаки целесообразно заражать белых мышей (1-2-дневных сосунков) в мозг.

Цитопатическое действие 1. Полная дегенерация клеточного монослоя.Отдельные клетки, которые остаются живыми, изменяют свою мо-рфологию, у них заметный пикноз ядра и цитоплаз-мы. (пикорнавирусы -вирусы полиомиелита Коксаки, ЕСНО). 2. Симпластообразующий тип ЦПД (возбудители кори, эпидемического паротита, парагриппа, респираторно- синцитиальных вирусов). Возникают многоядерные гигантские клетки (симпласты или синцитии). 3. Круглоклеточная дегенерация (аденовирусы). При репродукции риновирусов образуются округлые клетки, которые имеют отростки, а при размножении герпесвирусов наблюдается формирование подобных клеток одинакового размера, которые разбросаны по всему монослою. 4. Пролиферативный тип изменений (онкогенные вирусы) - формирование нескольких слоев клеток.

5. Отдельные вирусы не способны вызывать видимых дегенеративных проявлений со стороны клеток. В таких случаях для их выявления используют феномен интерференции, при котором клеточные культуры параллельно заражают другими вирусами, способными вызывать ЦПД (вирусы краснухи, крымской геморрагической лихорадки). 6. Образование внутриклеточных включений: внутриядерные и внутрицитоплазматические Такие включения образуют вирусы бешенства (тельця Бабеша-Негри), натуральной оспы (тельця Гварниери), простого герпеса (тельця Липшютца), аденовирусы, вирусы гриппа и другие. 7. Адсорбция эритроцитов (вирусы парагриппа) 8. Повреждение цитоскелета клетки