Российская академия медицинских наук Сибирское отделение Научно-исследовательский институт фармакологии ФАРМАКОЛОГИЧЕСКАЯ СТРАТЕГИЯ КЛЕТОЧНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ Академик РАМН А.М. Дыгай

Схема дифференцировки мезенхимальной стволовой клетки Направления клеточной терапии: -эмбриональные СК -фетальные СК -клетки пуповинной крови -выращенные in vitro ткани и органы и др.

Зародыш Костный мозг Скелетные мышцы Сердце Поджелудочная железа Печень Головной мозг Региональные клетки-предшественники

Несостоятельность механизмов регенерации глубокого резерва при патологических состояниях

Анализ данных, полученных на различных моделях патологических состояний, показал во всех случаях развитие практически однотипных реакций со стороны резидентных СК и клеток-предшественников костного мозга, представляющего собой основное депо данных элементов в организме. Не зависимо от характера повреждений имела место активация мультипотентных прогениторных клеток гемопоэтической ткани, которая, однако, не сопровождалась их значительной мобилизацией в периферическую кровь.

Механизмы регенеративных эффектов Г-КСФ

Костный мозг Сердце Поджелудочная железа Головной мозг Г-КСФ Печень Действие препарата Г-КСФ на миграцию стволовых клеток

МЕТАБОЛИЗМ ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ ГИАЛУРОНИДАЗА играет ключевую роль в метаболизме гиалуроновой кислоты. Под влиянием фермента происходит расщепление ГК до ее низко- и среднемолекулярных форм, стимулирующих пролиферацию и дифференцировку клеточных элементов. Кроме того, ГК in situ в костном мозге связывает клетки-предшественники различной степени зрелости посредством расположенных на них CD44 и RHAMM – рецепторов. ГИАЛУРОНОВАЯ КИСЛОТА Представляет собой наиболее распространенный гликозаминогликан в организме, входит в состав межклеточного матрикса, кликокаликса клеток, рецепторов к биологическим регуляторам и связывает in situ клетки-предшественники посредством специфических рецепторов.

Фундаментальные аспекты перспективы использования гиалуронидазы в регенеративной медицине СХЕМА МЕХАНИЗМОВ ВЛИЯНИЯ ГИАЛУРОНИДАЗЫ НА ПРОГЕНИТОРНЫЕ КЛЕТКИ Относительно низкие дозы гиалуронидазы способны существенно повышать функциональную активность клеток-предшественников, и потенцировать мобилизующую СК активность Г-КСФ. Происходит усиление мобилизующего действия Г- КСФ в отношении прогениторных элементов в 3 раза (содержание МСК в периферической крови увеличивалось до 1000,0% от фона)

ПОКАЗАТЕЛИ СИСТЕМЫ КРОВИ У ЖИВОТНЫХ ПОСЛЕ ВВЕДЕНИЯ 5-ФТОРУРАЦИЛА ПРИ ТРАНСПЛАНТАЦИИ МОНОНУКЛЕАРОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ, ПОЛУЧЕННЫХ ПОСЛЕ ВВЕДЕНИЯ Г-КСФ И Г-КСФ СОВМЕСТНО С ГИАЛУРОНИДАЗОЙ КОЕ-Э КОЕ-ГМ Эритрокариоциты Продукция ЭПА прилипающими миелокариоцитами Нейтрофильные гранулоциты Продукция КСА прилипающими миелокариоцитами - контроль - трансплантация мононуклеаров, полученных после введения Г-КСФ - трансплантация мононуклеаров, полученных после введения Г-КСФ и гиалуронидазы Показана значительно более высокая эффективность трансплантата, полученного после введения гиалуронидазы и Г-КСФ. При этом механизмами, лежащими в основе регенерации кроветворной ткани являлось не только увеличение пула кроветворных прекурсоров и возрастание их функциональной активности, но и восстановление гемопоэзиндуцирующего микроокружения костного мозга (особенно, его стромального компонента: повышение числа стромальных предшественников и усиление продукции гемопоэтинов прилипающими миелокариоцитами).

ОСНОВНЫЕ НАНОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ СОЗДАНИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ Основными задачами использования носителей являются: преодоление биологических барьеров, существующих в организме (кишечник – кровеносное русло, кровеносное русло – ткань); уменьшение побочных эффектов (токсичности, аллергенности); увеличение времени выведения лекарственного препарата из организма. Кроме того, представляется необходимым и активно исследуется проблема обеспечения адресной доставки лекарственных веществ, которая, однако, в настоящее время достаточно далека от ее практического решения. Неорганические вещества Органические вещества

ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ НАНОЧАСТИЦ НЕОРГАНИЧЕСКОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ Факторы, предрасполагающие к высокой токсичности: - отсутствие в организме адекватных систем их биодеградации и выведения значительная и неконтролируемая кумуляция в тканях - высокая проникающая способность - высокая реакционная способность - высокая каталитическая способность повреждение субклеточных структур, в том числе генетического аппарата в клеток - высокая адсорбционная способность контаминация вирусами Представляют наименьший интерес несут высокую потенциальную угрозу

НАНОКОНСТРУКЦИИ НА ОСНОВЕ ОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ – ПЕГИЛИРОВАННЫЕ ЛЕКАРСТВЕННЫЕ СРЕДСТВА Neulasta: ПЕГилированый рчГКСФ для лечения нейтропении (Hoffman-La Roche); Mircera, «С.E.R.A.» (Hoffman-La Roche) Pegasys: ПЕГилированый альфа-интерферон-альфа для лечения хронических гепатитов С и В (Hoffman-La Roche); PEG-Intron: ПЕГилированый альфа-интерферон-бета для лечения хронических гепатитов С и В (Schering-Plough / Enzon) Adagen (PEG-bovine adenosine deaminase) производства Enzon Pharmaceuticals, Inc.; Oncaspar: ПЕГилированая L -аспарагиназа для лечения острого лимфобластного лейкоза (Enzon). Doxil: ПЕГилированые липосомы с доксорубицином (Sequus) СТРУКТУРА ПОЛИЭТИЛЕНГЛИКОЛЯ Никитин И. Г., Сторожаков Т.Н., 2003 Преимущества: физическая стабильность, растворимость, увеличение периода жизни в организме, низкая токсичность (имуногенность) Недостатки: химический синтез является сложным многоступенчатым и дорогостоящим технологическим процессом, с применением высокотоксичных реагентов, требующих использование многочисленных стадий очистки с целью получения гомогенной популяции модифицированных молекул

НАНОТЕХНОЛОГИЯ ИММОБИЛИЗАЦИИ / ПЕГИЛИРОВАНИЯ/ ЭЛЕКТРОННО-ЛУЧЕВОГО СИНТЕЗА Преимуществами данных препаратов являются: - их максимально высокая эффективность, - низкая токсичность и имуногенность (высокая безопасность), - альтернативные пути использования (пероральное применение), - уникальные специфические эффекты. Зарегистрирован: тромбовазим Закончены доклинические исследования: им олигонуклеотиды, пегилин, имоцепт Проводятся доклинические исследования: им Г-КСФ им гиалуронидаза им алкалоза, им СТГ, им интерферон α-2β, им интерлейкин-2, им эритропоэтин Разработана: ООО «Саентифик фьючер менеджмент», Институт ядерной физики СО РАН, Институт цитологии и генетики СО РАН

Хроматограмма (SEC-HPLC-хроматография) раствора субстанции рчГ-КСФ (0,7 мг/мл) и полиэтиленгликоля (ПЭГ) до облучения и раствора рчГ-КСФ (0,7 мг/мл) ) и ПЭГ после ионизирующего воздействия Электрофореграмма (SDS-PAAG электрофорез): дорожки 1,5 – исходного рчГ-КСФ, 20 мкл, дорожки 2,6 – облученного раствора рчГ-КСФ и ПЭГ, 40 мкл, дорожки 3,7 - облученного раствора рчГ-КСФ и ПЭГ, 20 мкл, дорожка 4 – белков-стандартов «Сибэнзим». ИММОБИЛИЗИРОВАННЫЙ ГРАНУЛОЦИТАРНЫЙ КОЛОНИЕСТИМУЛИРУЮЩИЙ ФАКТОР Патент (RU) на изобретение «Средство для регенеративной медицины» (Бюл. 35 от ). Авторы: Артамонов А.В., Бекарев А.А., Верещагин Е.И., Дыгай А.М., Жданов В.В., Зюзьков Г.Н., Удут В.В.

МЕХАНИЗМЫ ГЕМОСТИМУЛИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ имГ-КСФ КОЕ-ГЭММ КОЕ-ГМ КОЕ-Г - цитостатический контроль - стандартный Г-КСФ - имГ-КСФ КлОЕ-Г/КОЕ-Г КСА прилипающих клеток КОЕ-Ф – имГ-КСФ 1 – стандартный Г-КСФ 2 1 Стимуляция процессов кроветворения под влиянием имГ-КСФ, в отличие от таковой при использовании неконъюгированного аналога, происходит в большей степени за счет активации «срочных» механизмов компенсации в результате воздействия препарата на «буферный отдел» регенераторного резерва гемопоэтической ткани с легко возобновляемыми ресурсами – коммитированные клетки- предшественники – КОЕ-ГМ и КОЕ-Г.

- подкожное введение Г-КСФ - подкожное введение имГ-КСФ МОБИЛИЗУЮЩИЕ СВОЙСТВА имГ-КСФ - пероральное введение имГ-КСФ КОЕ-Ф, костный мозг МСК, костный мозг КОЕ-Э, костный мозг КОЕ-ГМ, костный мозг КОЕ-Ф, периферическая кровь КОЕ-ГМ, периферическая кровь КОЕ-Э, периферическая кровь МСК, периферическая кровь - контроль Процесс пегилирования цитокина с использованием нанотехнологии электронно-лучевого синтеза сопровождается повышением эффективности стимуляции выхода в кровь наиболее ранних родоначальных элементов - клеток, обладающих максимально высоким ростовым потенциалом

ХРОНИЧЕСКИЙ ГЕПАТИТ, ЛЕЧЕНИЕ ПРЕПАРАТОМ имГ-КСФ КОЕ-Печ * на 100 тыс. клеток МСК, 3-и сутки на 1 млн. клеток * Применение имГ-КСФ практически не влияет на активность воспалительных процессов, но существенно снижает степень склерозирования печеночной ткани Количество клеток воспалительного инфильтрата (ед.) Относительная площадь соединительной ткани (%) * - контроль - введение имГ-КСФ SDF-1-фактор, стромальные миелокариоциты * * * * Cl4 Cl4+имГ-КСФ ФОН Мобилизация СК связана со снижением продукции стромальными клетками SDF-1- фактора

ФАРМАКОКИНЕТИЧЕСКИЙ ПРОФИЛЬ им Г-КСФ Определение содержания в сыворотке крови с помощью ИФА Определение содержания Г-КСФ в сыворотке крови с помощью ИФА им Г-КСФ п/к Стандартный Г-КСФ п/к им Г-КСФ per os им Г-КСФ per os + им ГД Препарат плохо детектируется с помощью стандартных наборов для ИФА, в результате, по- видимому, снижения способности молекул Г-КСФ после конъюгации с носителем взаимодействовать со специфическими АТ. Однако, при прохождении через ЖКТ, очевидно, происходит вторичная модификация имобилизированного фактора, которая, с одной стороны, повышает его способность связываться со специфическими АТ, что делает его доступным для обнаружения с помощью ИФА, но, с другой стороны, повреждает активный сайт белка, взаимодействующий с рецепторами

КОНФОКАЛЬНАЯ МИКРОСКОПИЯ ТКАНИ ТОНКОЙ КИШКИ КРЫСЫ (накопление FITC-меченных препаратов) Контроль Препарат пегилированного белка Препарат нативного белка Всасывание пегилированных препаратов: -через лимфатическую систему составляет около 40 % (с последующим транспортом по лимфатическому руслу в венозную систему). - через систему портальных вен (прямое всасывание в кровь) составляет около 20 %.

ИММОБИЛИЗИРОВАННАЯ ГИАЛУРОНИДАЗА (гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидаза) ИмГД обладает выраженным резорбтивным фармакологическим влиянием в результате появления устойчивости у созданной конструкции к сывороточным и тканевым ингибиторам фермента. На сегодняшний день не известны вещества, оказывающие столь выраженное влияние одновременно на такое количество функций прогениторных элементов и механизмы их регуляции.

ВЛИЯНИЕ ИММОБИЛИЗИРОВАННОЙ ГИАЛУРОНИДАЗЫ НА ФУНКЦИИ ПРОГЕНИТОРНЫХ КЛЕТОК И МЕХАНИЗМЫ ИХ РЕГУЛЯЦИИ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ГЕПАТИТЕ SDF-1-фактор, стромальные миелокариоциты, нг/мл SDF-1-фактор, клетки печени, нг/мл КОЕ-Ф, костный мозг КОЕ-Печ, печень КОЕ-Ф, периферическая кровь - Хронический гепатит - имГД Реакции со стороны прогениторных клеток развиваются на фоне резкого снижения выработки SDF- фактора стромальными клетками костного мозга, усиления его продукции элементами микроокружения печени и повышения способности самих клеток- предшественников к адгезии

ХРОНИЧЕСКИЙ ГЕПАТИТ, ТЕРАПИЯ ИММОБИЛИЗИРОВАННОЙ ГИАЛУРОНИДАЗОЙ Применение имГД значительно снижало активность воспалительных процессов, оказывало антихолестатический эффект и предотвращало развитие склеротических процессов в печеночной ткани Количество клеток воспалительного инфильтрата (ед.) Относительная площадь соединительной ткани - контроль - имГД Щелочная фосфатаза сыворотки крови * * ** * * Печень крысы на 40-е сутки после шестикратного введения ССl 4 препарат имГД (портальный склероз не выражен) без лечения (портальный склероз)

ГК ГЕМОПОЭТИЧЕСКАЯ ТКАНЬ (ТКАНЬ-ДЕПО СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК) ПОРАЖЕННАЯ ТКАНЬ (ОРГАН-МИШЕНЬ) SDF-1 МЕХАНИЗМЫ РЕГЕНЕРАТИВНОГО ДЕЙСТВИЯ ИММОБИЛИЗИРОВАННОЙ ГИАЛУРОНИДАЗЫ МСК SDF-1 имГД приводит к стимуляции процессов пролиферации и дифференцировки как регионарных стволовых клеток, так и прогениторных элементов тканей-депо. Причем активация последних сопровождается еще и их мобилизацией и направленной миграцией в органы- мишени.

МОДИФИКАЦИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ПРОГЕНИТОРНЫХ КЛЕТОК К РАЗЛИЧНЫМ РОСТОВЫМ ФАКТОРАМ ПОД ВЛИЯНИЕМ ИММОБИЛИЗИРОВАННОЙ ГИАЛУРОНИДАЗЫ КОЕ-Печ печени, фактор роста стволовой клетки Мультипотентные предшественники костного мозга, ФРФ КОЕ-ГМ костного мозга, Г-КСФ КОЕ-Печ печени, инсулин - без преинкубации - преинкубация в 0,1%-растворе имГД 10 мин КОЕ-Ф печени, инсулин Предварительная обработка родоначальных клеток ферментом сопровождается значительным усилением колониеобразования. Как при отсутствии специальных добавок в питательной среде, когда колониестимулирующая активность определяется совокупностью биологически активных веществ эмбриональной телячьей сыворотки, входящей в ее состав. Так и при внесении в культуру специфических раннедействующих (фактор стволовой клетки, фактор роста фибробластов), линейно-рестриктированных (эритропоэтин, Г-КСФ) и пр. факторов роста (инсулин и др.).

ОРИГИНАЛЬНЫЙ УНИВЕРСАЛЬНЫЙ ПОДХОД К ПОВЫШЕНИЮ ЭФФЕКТИВНОСТИ ТЕРАПИИ РАЗЛИЧНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ПРЕПАРАТАМИ- АНАЛОГАМИ ЭНДОГЕННЫХ РЕГУЛЯТОРОВ ФУНКЦИЙ С ПОМОЩЬЮ ИММОБИЛИЗИРОВАННОЙ ГИАЛУРОНИДАЗЫ Система крови (цитостатическая миелосупрессия) Печень (хронический гепатит) Сахарный диабет РЕКОРМОН КОЕ-Э, костный мозг НЕЙПОГЕН КОЕ-ГМ, костный мозг Г-КСФ КОЕ-Печ, печень Относительная площадь соединительной ткани, % ИНСУЛИН Глюкоза крови, аллоксановый диабет Глюкоза крови, мыши линии СВА в возрасте 2 лет - физ.раствор - основной препарат - имГД - основной препарат + имГД

гемопоэтические стволовые клетки мышей (CD3, CD45R (B220), Ly6C and Ly6G (Gr1), CD11b (Mac1), TER-119)-, Sca-1+, c-Kit+, CD34+ мезенхимальные стволовые клетки мышей CD44+, CD73+, CD90+, CD106+, CD31-, CD34-, CD45- ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КЛЕТОК-ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ ПРИ ФИБРОЗЕ ЛЕГКИХ (интратрахеальное введение 80 мкг блеомицина) Изучение патогенеза фиброза легких показало стимуляцию дифференцировки СК в клеточные элементы фиброзной ткани

ТЕРАПЕВТИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ МОДИФИКАТОРОВ ФУНКЦИЙ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ПРИ ФИБРОЗЕ ЛЕГКИХ Содержание соединительной ткани в лёгких мышей после интратрахеального введения блеомицина (количество коллагеновых волокон от общей площади лёгочной ткани, %) - Спиперон (антагонист D 2 дофаминовых рецепторов, α 1B -адренергических рецепторов, 5- HT 2A /5HT 1 –серотониновых рецепторов) снижает содержание предшественников фиброзной ткани в легких; - Гиалуронидаза, помимо, описанных ранее на других моделях патологии эффектов обладает еще и способностью снижать уровень миграции гемопоэтических СК в пораженную ткань. - Совместное применении приводит к суммации их терапевтических эффектов - Г-КСФ на данной модели обладает провоспалительным действием и усугубляет развитие фиброзной ткани

ГК ГЕМОПОЭТИЧЕСКАЯ ТКАНЬ (ТКАНЬ-ДЕПО СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК) ПОРАЖЕННАЯ ТКАНЬ (ОРГАН-МИШЕНЬ) SDF-1 МФСК, имГД МСК SDF-1 ЛЕКАРСТВЕННЫЕ СРЕДСТВА ДЛЯ РЕГЕНЕРАТИВНОЙ МЕДИЦИНЫ Наиболее значимых терапевтических эффектов за счет реализации программы систем клеточного обновления удается добиться при сочетанном использовании имГД с другими модификаторами функций СК МФСК Представленные данные свидетельствуют не только о принципиальной возможности, но и, безусловно, о высокой перспективности проведения клеточной терапии с помощью фармакологических агентов – модификаторов функций прогениторных клеток (МФСК)

По материалам работ опубликовано: Монографий – 5 Статей в реферируемых журналах – 97 Защищено диссертаций: Докторских – 3 Кандидатских – 5 Получено патентов – 38 Цикл работ удостоен международной премии Elsevier «SciVal / Scopus Award Russia 2012» (за создание Мирового кластера с отличительными компетенциями – нового высокоперспективного научного направления) НАУКОМЕТРИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ

СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ!