Ферменты зерна 1. Практическое значение ферментов зерна при хранении и переработке. 2. Значение протеазы для хлебопечения 3. Особенности действия амилаз.
ФЕРМЕНТЫ ЗЕРНА В зерне злаковых растений, как и во всяком живом организме, большое количество ферментов. Рассмотрим некоторые из них, имеющие наибольшее значение для биохимических процессов, протекающих в зерне и оказывающих влияние на качественное состояние зерна при хранении и его переработке. Ферменты первого класса. Это оксидазы: моно фенол-моно- оксигеназа (тирозиназа), аскорбатоксидаза, пероксидаза, каталаза и липоксигеназа. Монофенол-моно оксигеназа окисляет аминокислоту тирозин с образованием темноокрашенных соединений меланинов. Активная моно фенол-моно оксигеназа содержится в ржаной муке и грибах. Темный цвет ржаного хлеба частично объясняется действием моно фенол-моно оксигена. Той же причиной объясняется наблюдающееся потемнение некоторых партий макарон при их сушке, некоторые сорта пшеницы содержат активную моно фенол- моно оксигеназу. Аскорбатоксидаза представляет собой белок, содержащий медь (0,24%). В растениях имеется оксидаза, которая превращает аскорбиновую кислоту в дегидроаскорбиновую.
Пероксидаза способствует окислению органических соединений пероксидом водорода в живом организме. Может окислять те или иные соединения с помощью пероксида водорода или каких-либо органических примесей. С пероксидом водорода она образует комплексное соединение, в результате чего пероксид активизируется и приобретает способность действовать как акцептор водорода. Особенно легко перекиси образуются при окислении кислородом воздуха соединений, имеющих непредельные связи между двумя атомами углерода: терпенов, каротиноидов, насыщенных жирных кислот. Пероксидаза, как и каталаза, двухкомпонентный фермент, простетическая группа его содержит железо, соединенное с остатками четырех пиррольных колец в виде гематина. Гематин пероксидазы и каталазы имеет одно и то же строение. Различия в каталитической функции каталазы и пероксидазы объясняются разными свойствами белков, связанных в этих ферментах с одной и той же простетической группой. Пероксидаза играет важную роль в дыхании растений. Каталаза состоит из четырех субмолекул, каждая из которых хорошо видна при большом увеличении в электронном микроскопе. Роль каталазы в организме заключается в том, что она разрушает ядовитый для клеток пероксид водорода. Каталаза ингибируется синильной кислотой, сероводородом, фторидами. Гематин также слабо катализирует окисление перекисями различных спиртов и других соединений.
Окисление ненасыщенных жирных кислот под действием липоксигеназы приводит к образованию гидроперекисей. Образующиеся таким образом гидроперекиси имеют высокую окислительную способность и могут окислять далее новые порции ненасыщенных жирных кислот, а также каротиноиды, витамин А, аминокислоты, хлорофилл, аскорбиновую кислоту.
Поскольку липоксигеназа катализирует вторичное окисление каротиноидов, сопровождающееся исчезновением характерной для них желтой окраски, делаются попытки применить липоксигеназу в качестве препарата, отбеливающего тесто, и придающего мякишу хлеба более светлую окраску. Липоксигеназа играет важную роль при разрушении каротина во время сушки и хранения различных растительных продуктов. Перекиси жирных кислот могут легко подвергаться дальнейшему распаду, по этой причине липоксигеназа играет существенную роль в процессе прогоркания муки и различных круп. Ферменты второго класса трансферазы. К этому классу принадлежат ферменты, катализирующие перенос целых атомных группировок от одного соединения к другому. Под действием фосфотрансфераз остатки фосфорной кислоты переносятся от аденозинтрифосфата на глюкозу или фруктозу.
Ферменты третьего класса гидролазы. Катализируют реакции гидролиза, т. е. расщепление сложных соединений на более простые с присоединением воды. Класс гидролаз весьма обширен, и его подразделяют на ряд подгрупп. Фермент, гидролизующий распад жира, или триацилгли-церинов(по-старому триглицериды),называется триациглицероллипазой. Его часто называют по- старому липазой. Липаза действует таким образом, что сначала отщепляет от триацилглицерина один кислотный остаток, затем второй и,наконец, третий.
Липазы различного происхождения весьма существенно различаются по свойствам и характеру действия. В растениях и микроорганизмах липаза содержится в двух формах в виде нерастворимого и растворимого в воде фермента. Нерастворимая липаза содержится в семенах клещевины. С помощью триацилглицерол- липазы клещевины можно не только гидролизовать жир, но при соответствующих условиях синтезировать его (триацилглицерин). Клещевинная липаза обладает большой специфичностью, она почти не действует на водорастворимые эфиры глицерина и низкомолекулярных жирных кислот уксусной, пропионовой, валериановой и др. Оптимум ее действия соответствует рН 3,6. В отличие от липазы клещевины липаза, содержащаяся в семенах злаков, многих масличных культур и в микроорганизмах, относится к растворимым ферментам. Оптимум ее действия по кислотности среды также значительно отличается от клещевинной липазы: он находится при рН 8. Действие липазы имеет большое значение при хранении муки и крупы, особенно содержащих много жира (например, пшено). При повышенной влажности и температуре хранения этих продуктов липаза быстро расщепляет триацилглицерины с образованием свободных жирных кислот, что приводит к повышению кислотности продукта и его быстрому прогорканию.
Во всех звеньях растений содержится эстераза фермент хлорофилла за, активно действующая в спиртовых растворах и осуществляющая реакцию «переэстерификации»: фермент отщепляет от хлорофилла остаток фитола и заменяет его остатком того спирта, в среде которого ведется реакция. Имеются ферменты, катализирующие гидролиз тиоэфиров, например фермент тиогликозидаза ранее называвшаяся тирозиназа, гидролизующая глюкозид синигрин, содержащийся в семенах черной горчицы. При увлажнении растертых семян горчицы под действием тирозиназы синигрин расщепляется на глюкозу, изородановый эфир аллилового спирта и бисульфат калия.
К подгруппе эстераз относят фосфатазы ферменты, гидролизующие сложные эфиры фосфорной кислоты. Они отличаются друг от друга по химической природе гидролизуемых ими субстратов. В зерне важную роль играют гидролазы фосфомоноэфиров, к которым относят фитазу. В семенах многих растений и дрожжах содержится активная фитаза. Фитаза оказывает большое влияние на пищевую ценность хлеба. Фитаза дрожжей и муки в процессе брожения теста расщепляет большую часть содержащейся в нем инозитфосфорной кислоты, и тем способствует лучшему усвоению солей кальция.
Протеазы ферменты, катализирующие гидролитическое расщепление белков и полипептидов. Протеазы катализируют расщепление пептидной связи поэтому в классификации ферментов их называют пептидгидролазами. Протеазы разделяют на пептидазы и протеиназы.Пептидазы катализируют гидролитическое расщепление полипептидов и дипептидов. Протеиназы осуществляют непосредственно гидролиз белков. Впоследствии оказалось, что протеиназы способны гидролизовать пептидные связи не только в белках, но и в различных полипептидах. Однако условное деление протеаз на пептидазы и протеиназы закрепилось в практике работы с протеазами. Аминопептидазы первая цифра обозначает класс гидролаз, вторая подкласс пептидгидролаз, третья группу аминопептидаз. Для действия аминопептидаз необходимо наличие в молекуле субстрата свободной а-аминной группы:
Карбоксипептидазы (3.4.17) расщепляют в полипептидах пептидную связь, находящуюся рядом со свободной карбоксильной группой пептида Протеиназы гидролизуют непосредственно белки. При этом из белка образуются пептоны (продукты неполного гидролиза белков), полипептиды и свободные аминокислоты. В зависимости от природы гидролизуемого белка оптимальная зона действия отдельных протеиназ находится при слабокислой, нейтральной или слабощелочной реакции. Протеиназы, содержащиеся в млечном соке и в семенах растений, в дрожжах, составляют особую группу ферментов, типичным представителем которых является папаин ( ). Его получают в виде сухого порошка из млечного сока дынного дерева (Сапса рарауа). Молекула папаина состоит из 212 аминокислотных остатков. Первичная структура молекулы папаина полностью выяснена. Она содержит три дисульфидных мостика и одну сульфгидрильную группу, входящую в активный центр фермента. Характерная особенность папаина, как и ряда других протеолитических ферментов растительного происхождения, заключается в том, что они активизируются синильной кислотой и сульфгидрильными соединениями, прежде всего цистеином и восстановленным глютатионом.
На действие ферментов большое влияние оказывает молекулярная структура субстрата его атакуемость ферментами. Подтверждена различная атакуемость разных белков одними и теми же протеазами. Это обстоятельство оказывает существенное влияние при тесговедении на белки различных сортов пшеницы, резко различающихся по физическим свойствам клейковины, а, следовательно, и на их хлебопекарное достоинство.
Скорость расщепления белков протеолитическими ферментами зависит от присутствия в белке определенных химических группировок, например сульфгидрильных, аминных и окси групп. Если эти группы в белковой молекуле каким-либо образом ликвидировать, то атакуемость белков ферментами изменяется. Так, при восстановлении дисульфидных связей белка скорость его расщепления протеиназами возрастает, а в результате блокирования окси групп бензилированием или ацетилированием атакуемость белка понижается. Атакуемость белка протеиназами зависит от присутствия в его молекуле определенных химических групп, а также от его первичной, вторичной и третичной структуры.
Кислородная связь в веществах, расщепляемых карбогид- разами, имеет характер ацетальной или эфирной связи. Карбогидразы делят на олигазы (а-глюкозидаза, б-галактозидаза, б- фруктофуранозидаза) и полиазы (амилазы, глюкоамилаза, целлюлаза, гемицеллюлозы). а-Глюкозидаза ( )систематическое название а-О- глюкозид-глюкогидролаза, старое название мальтаза. Фермент, расщепляющий а-глюкозидную связь в дисахаридах и глюкозидах, содержится в тканях растений, плесневых грибах, дрожжах, бактериях. Особенно большое количество а- глюкозидазы в проросшем зерне проса. Просяной солод применяется в качестве добавки к ячменному солоду при изготовлении мальтозной патоки. Активная а-глюкозидаза просяного солода обеспечивает гидролиз мальтозы с образованием двух молекул глюкозы. Глюкоза более сладкая, чем мальтоза. а-Глюкозидаза расщепляет мальтозу, но может гидролизовать и сахарозу, поскольку сахароза, как и мальтоза, является а- глюкозидом. Она не только катализирует реакцию гидролиза, но способна и к реакции синтеза а-глюкозидов из а-глюкозы и соответствующего спирта.
Галактозидаза ( ) систематическое название а-Б-галактозид-галактогидролаза, старое название мелибиаза. При действии а-галактозидазы на рафинозу происходит расщепление связи между остатком а- галактопиранозы и остатком глюкопиранозы. В результате из рафинозы образуются а-галактопираноза и сахароза. б-Фруктофуранозидаза ( ) систематическое название б-Б-фруктофуранозид-фруктогидролаза, старые названия сахараза, инвертаза. Фермент катализирует расщепление сахарозы на глюкозу и фруктозу. В то время как а - глюкозидаза гидролизует сахарозуу а-глюкозидного углеродного атома остатка глюкозы, б-фруктофуранозидаза разрывает связь у б- глюкозидного углеродного атома остатка фруктозы:
В обоих случаях получается один и тот же результат: свободные глюкоза и фруктоза. У трисахарида рафинозы имеется такая же связь между остатком глюкозы и остатком фруктозы, как и в сахарозе. Поэтому б- фруктофуранозидаза гидролизует также рафинозу. При этом из рафинозы получается молекула фруктозы и молекула дисахарида мелибиозы (из остатков глюкозы и галактозы). б-Фруктофуранозидаза содержится в высших растениях, микроорганизмах и в пищеварительных соках животных. Особенно активен этот фермент в дрожжах, из которых его обычно получают в виде очищенных препаратов.
Амилазы ферменты, под действием которых происходит гидролиз крахмала с образованием декстринов и мальтозы. Амилазы гидролизуют неизмененные крахмальные зерна и крахмальный клейстер. Гидролиз неизмененных крахмальных гранул сопровождается образованием мальтозы и постепенным изменением формы крахмальных зерен они как бы разъедаются ферментом и теряют свои первоначальные очертания. Скорость расщепления амилазами крахмала из зерна разных культур и сортов или из разных частей одного и того же растения неодинакова. Эта различная податливость крахмала действию амилазы получила название атакуемости крахмала. Таким образом, скорость расщепления крахмала амилазой зависит не только от количества и активности фермента, но также от атакуемости субстрата.
Атакуемость крахмала возрастает с уменьшением размеров крахмальных зерен, т. е. с увеличением их относительной поверхности. Она резко возрастает также при механическом нарушении структуры крахмальных зерен при их длительном перетирании в сгупке или при помоле зерна на мукомольном заводе. Действие амилазы на неизмененные или механически поврежденные крахмальные зерна значительно слабее по сравнению с их действием на оклейстеренный крахмал. По этой причине во многих отраслях пищевой промышленности перед осахариванием крахмала солодом (источник активной амилазы) муку или картофель предварительно заваривают горячей водой. Различают три амилазы: а-амилаза, б-амилаза и глюкоамилаза.
Различают три амилазы: а-амилаза, б-амилаза и глюкоа милаза. а-Амилаза ( ) систематическое название 1,4-а-О- глюкан-глюканогидролаза, старые названия диастаза, птиалин, гликогеназа, дексгриногенамилаза. а-Амилаза содержится в слюне, пищеварительном соке поджелудочной железы, в плесневых грибах, в проросшем зерне пшеницы, ржи, ячменя. Характерной особенностью всех а-амилаз является наличие в них по крайней мере одного моля прочно связанного кальция на один моль фермента. Обработка фермента этилендиаминтетраацетатом, связывающим кальций, его инактивирует. Роль кальция заключается в том, что он стабилизирует вторичную и третичную структуру молекулы а-амилазы, обеспечивая таким образом ее каталитическую активность и предохраняя фермент от действия протеолитических ферментов.
Атакуемость крахмала а-амилазой связана с количеством в грануле крахмала амилозы: крупные высокоамилозные гранулы с большей легкостью атакуются а-амилазой. Выявлена возможность наряду с активацией зимогенной амилазы ее новообразования в прорастающем зерне. При повышенной влажности атмосферы наблюдается усиление синтеза а-амилазы в созревающем зерне, что приводит к ухудшению хлебопекарных достоинств зерна. б-Амилаза ( ) систематическое название 1,4-а-О- глюкан-мальтогидролаза, старые названия диастаза, сахарогенамилаза, гликогеназа. б-Амилаза находится в зерне пшеницы, ржи, ячменя, в соевых бобах. Оба фермента существенно различаются по характеру действия на амилозу и амилопектин крахмала.
б-Амилаза расщепляет амилозу нацело, превращая ее на 100% в мальтозу. Амилопектин б-амилаза гидролизует на мальтозу и декстрины, дающие коричнево-красное окрашивание с йодом, б-амилаза расщепляет лишь свободные концы глюкозных цепочек с образованием мальтозы. Ее действие прекращается, когда происходят разветвления в молекуле амилопектина (б-амилаза расщепляет амилопектин с образованием мальтозы лишь на 54%). Декстрины, образовавшиеся при действии б- амилазы на амилопектин, гидролизуются а-амилазой с образованием декстринов с меньшей молекулярной массой, не дающих окрашивания с йодом
При последующем, длительном воздействии б-амилазы на крахмал около 85% его превращается в мальтозу. При действии (3-амилазы на крахмал образуются главным образом мальтоза и небольшое количество высокомолекулярных декстринов. При действии на крахмал а-амилазы образуются главным образом декстрины меньшей молекулярной массы и незначительное количество мальтозы. Ни а-, ни б-амилазы в отделности не могут полностью гидролизовать крахмал или гликоген с образованием мальтозы. При одновременном действии обеих амилаз крахмал гидролизуется на 95%). а- и б-Амилазы различаются своим отношением к рН б- амилаза может работать при более кислой среде (оптимальный рН 4,8), чем а-амилаза (рН 5,66,3). Вместе с тем б-амилаза более термолабильна (оптимальная I 51 °С), а а-амилаза выдерживает более высокую температуру (оптимальная I = 65 °С). Оказывается, что разные а-амилазы различаются по своей термолабильности. Наиболее быстро при нагревании разрушается грибная а-амилаза. На втором месте стоит зерновая а- амилаза (фермент из проросшего зерна или солода). Наиболее устойчива к нагреванию бактериальная а-амилаза.
Семена растений различаются по содержанию в них а- и б-амилазы. В непроросших семенах пшеницы и ячменя содержится только б- амилаза; а-амилаза образуется при прорастании. Во ржи присутствуют оба фермента а- и б-амилазы, при прорастании количество и активность а-амилазы резко возрастает. В соевых бобах, непроросших и проросших встречается только б- амилаза. В непроросших семенах сорго имеется главным образом а- амилаза. Как и другие ферменты, амилазы могут находиться в клетке в связанном с белками виде, и тогда они лишаются гидролитической активности. Связывание амилаз с белками играет большую роль в регулировании их действия в прорастающем и созревающем зерне. Экзо-1,4-а-глюкозидаза, ее чаще называют глюкоамилазой ( ), имеет систематическое название 1,4-а-О-глюкан глюкогидролаза. Гидролизует крахмал с образованием преимущественно глюкозы и небольшого количества декстринов.
Препараты глюкоамилазы получают из плесневых грибов. С помощью этого фермента получают глюкозную патоку и кристаллическую глюкозу. Ферменты группы амидаз (3.5) уреаза и глютаминаза. Уреаза ( ) содержится в растениях, плесневых грибах и некоторых бактериях. Особенно большие количества уреазы содержатся в семенах сои и канавалии (род из семейства бобовых), из которых ее получают в кристаллическом виде. Активную уреазу содержат также бактерии, разлагающие мочевину при разложении навоза. При этом мочевина расщепляется на аммиак и диоксид углерода. Ферменты четвертого класса лиазы. Некоторые из них катализируют отщепление воды, другие отщепление диоксида углерода или аммиака. Из ферментов этого класса рассмотрим пируватдекарбоксилазу и лизиндекарбоксилазу. Пируватдекарбоксилаза ( ) фермент, содержащийся в растениях и микроорганизмах и расщепляющий пировипоградную кислоту на уксусный альдегид. Активная группа пируватдекарбоксилазы состоит из витамина В1 (тиамина), соединенного с двумя остатками фосфорной кислоты. Ферментативному декарбоксилированию могут также подвергаться аминокислоты, в результате наряду с СОг образуется соответствующий амин или аминокислота.
Ферменты пятого класса изомеразы. Катализируют изомеризацию органических соединений. Некоторые из них принимают участие в брожении теста. Фермент триозофосфат-изомераза ( ) катализирует превращение промежуточных продуктов брожения 3- фосфо- глицеринового альдегида и фосфодиоксиацетона: Фермент глюкозофосфат-изомераза, или оксиизомераза ( ) катализирует обратимое взаимное превращение глю- копиранозо-6-фосфата и фруктофуранозо-6-фосфата Ферменты играют большую роль во всех процессах выращивания зерна в поле, при послеуборочном дозревании, хранении, при его переработке в мукомольном производстве, хлебопечении, производстве круп и макарон, пивоварении, спирто-водочном производстве и в ряде других отраслей пищевой промышленности