Agilent Technologies Краткий обзор методов пробоподготовки в ВЭЖХ и ВЭЖХ/МС анализе Александра Япарова Специалист по расходным материалам Jan. 27, 2015 Company Profile 1

Тенденции развития Современное соответствие методов пробоподготовки Рост контроля веществ в охране здоровья и окружающей среды Рост количества и объёмов проб Возрастает простота и экономичность методов Растёт список загрязняющих веществ и источников проб Пределы количественного определения снижаются Повышение чувствительности систем ВЭЖХ и ВЭЖХ-МС Необходимость повышать степени очистки образца на стадии пробоподготовки Вещества, требующие новых методов и подходов Широкоупотребимые методы пробоподготовки с высоким выходом и минимальным влиянием Bond Elut Polymeric SPE Bond Elut Plexa Chem Elut QuEChERS Bond Elut SPE QuEChER S

Цели пробоподготовки Избавиться от примесей, концентрация, замена растворителя

Bond Elut Bond Elut Plexa SPEC QuEChERS Captiva Captiva ND Captiva ND Lipids Chem Elut Tox Elut Combilute Hydromatrix ЭКСТРАКЦИЯ ОЧИСТКА ФИЛЬТРАЦИЯ Решения Agilent для пробоподготовки

Осаждение белков: фильтры Captiva Captiva: - очистка от частиц - с органическими растворителями используется самоклеящаяся плёнка Captiva ND: - неподтекающие планшеты для осаждения белков органическими растворителями Captiva ND Lipids : - позволяет избавиться от гидрофобных белков, ответственных за ионную супрессию

Простой метод пробоподготовки: Captiva ND Lipids 2. Добавить образец. 1. Добавить растворитель (ацетонитрил, ACN) 3. Перемешать пипеткой 5 раз для осаждения образца 4. Использовать вакуум, положительное давление для фильтрации 5. Перенести в автосамплер для анализа. Фильтр 0.22 μm и сорбент очищающий от липидов Соли Белки Липиды Аналит простота в использовании возможность автоматизации отсутствие взаимного загрязнения высокая воспроизводимость высокая скорость потока со старыми образцами плазмы

Неподтекающие картриджи Captiva после 5 мин. инкубации с ацетонитрилом отсутствие раствора на выходе не капает Обычный картридж после 5 мин. инкубации с ацетонитрилом капли образуются риск взаимного загрязнения

100µm плазма / 400µL ACN* *ацетонитрил

Преимущества функциональной и механической фильтрации: Снижение ионной супрессии за счёт удаления липидов Образец плазмы – элюция фосфолипидов Ионная супрессия влияет на элюцию фосфолипидов Пробоподготовка с Captiva ND Lipids для удаления белков, липидов, микрочастиц Ионная супрессия практически отсутствует – лучший результат 9 Постколоночная инфузия (PCI) альбутерола до применения Captiva ND lipids Липидный след МС PCI Тот же эксперимент после удаления белков и липидов с помощью Captiva ND lipids PCI Липидный след МС

October 2014 Company Profile 10 Обратное давление в системе / количество ввода образцов Captiva ND: основные преимущества Обратное давление, бар Количество вводов При использовании Captiva NDLipids не наблюдается существенных изменений обратного давления, времени удерживания и формы пиков после 10 и 5010 вводов пробы для биоанализа на ВЭЖХ-МС или ВЭЖХ-МС-МС (верх = УФ-поглощение; низ = МС-ионный ток).

Шприцевые фильтры Captiva большой ассортимент размеров, форматов и типов мембран, для работы с любыми образцами все фильтры Captiva поставляются сертификатом для ВЭЖХ или ВЭЖХ/МС, который подтверждает экстремально низкий уровень примесей экстрагируемых из фильтров отличная скоростью пропускания и максимальной ёмкостью загрузки образцов высокое качество: корпус каждого фильтра изготовлен из высококачественного полипропилена

October 2014 Company Profile 12 Жидкостная экстракция на субстрате: Chem Elut Chem Elut -это экономичный многоцелевой сорбент для быстрой универсальной пробоподготовки биологических проб, таких как плазма крови, сыворотка, кровь и моча -забуференные патроны можно использовать для простой очистки в органических реакциях -патрон с буферными свойствами основания может удалить остатки кислых соединений из различных образцов Hydromatrix это инертный сорбент на основе диатомовых земель высокой чистоты, обеспечивает гибкость методик и возможность применения в разнообразных областях

Механизм субстратной жидкостной экстракции Перед нанесением Нанесение образца Экстракция 2 аликвотами органического растворителя гидрофобный слой гидрофильный слой сухой сорбент Водный образец Твердый носитель Образец адсорбируется на поверхности твердого носителя (3-5 мин.) Соли и полярные примеси не будут экстрагироваться Аналиты экстрагируются в растворитель

Выбрать патрон Chem Elute в зависимости от общего объёма образца Нанести пробу. Инкубация 3-5 мин. Нанести растворитель для экстракции. Дихлорметан, этилацетат, метил-трет- бутиловый эфир (МТБЭ), метилэтилкетон (МЭК) и бутилацетат. Собрать экстракт Нанести растворитель для экстракции Собрать экстракт ГХ, ГХ/МС или ВЭЖХ анализ Выбрать патрон Chem Elute в зависимости от общего объёма образца Разбавить образец равным объемом основного буфера. Для аминов и других слабоосновных анализов – 1М аммиачный раствор с pH Нанести растворитель для экстракции. Первую али квоту. Собрать экстракт Нанести растворитель для экстракции. Вторую али квоту. Собрать экстракт Нейтральные анализы Основные анализы Кислотные анализы Механизм субстратной жидкостной экстракции Высушить и растворить в подвижной фазе ЖХ или растворителе для ГХ ГХ, ГХ/МС или ВЭЖХ анализ Высушить и растворить в подвижной фазе ЖХ или растворителе для ГХ Выбрать патрон Chem Elute в зависимости от общего объёма образца Разбавить образец равным объемом кислого буфера. Для карбоновых кислот и других слабокислых анализов – 1М фосфатные растворы с pH 2-3. Нанести растворитель для экстракции. Первую али квоту. Собрать экстракт Нанести растворитель для экстракции. Вторую али квоту. Собрать экстракт ГХ, ГХ/МС или ВЭЖХ анализ Высушить и растворить в подвижной фазе ЖХ или растворителе для ГХ

Твердофазная экстракция (ТФЭ) ТФЭ на силикагелевых сорбентах селективность определяется химически специфичными связями концепция «ящик с инструментом» необходима разработка метода метод-специфичные фазы >40 различных фаз Полимерная ТФЭ стабильность на разных уровнях pH для широкого спектра веществ смешанная функциональность универсальность и простота минимальная оптимизация высокая ёмкость

October 2014 Company Profile 16 Блок-схема анализа проб с помощью ТФЭ Первым этапом разработки методики ТФЭ изучение характеристик целевого соединения Максимально полное удаление мешающих компонентов при сохранении оптимальной степени извлечения целевого соединения является ключом к успешной разработке методик ТФЭ Кондиционирование Уравновешивание Внесение пробы Промывка Элюирование В отходы Сбор Выпаривание Повторное растворение

Комбинированные сорбенты для ТФЭ на основе силикагеля Bond Elut Certify -содержит комбинированный сорбент с неполярным механизмом удерживания и возможностями сильного катионообменника C8 -экстракция основных (катионных) препаратов из мочи и крови, не менее эффективен при экстракции широкого спектра соединений из разнообразных водных образцов Уравновешивание Нанесение подготовленной пробы Промывка 1 Промывка 2 Элюирование Испарить и реконструировать * * Восстановить в 0.5 мл 30:70 ACN:H2O + 0.1% муравьиной кислоты для LC/MS/MS; в 0.5 мл гексана для GC/MS. Матрица: моча, плазма крови, слюна, кровь, биологические жидкости, волосы Вещества: амфетамины, кодеин, фенциклидин, проксифен, ЛСД, оксикодон, опиаты До После Кондиционирование 1 мл 1 мл 100 mM KH 2 PO 4 1 мл 5% уксусной кислоты 2 мл 2 мл ACN + 2% NH 4 OH

October 2014 Company Profile 18 Комбинированные сорбенты для ТФЭ на основе силикагеля Bond Elut Certify II -создан специально для быстрой и эффективной экстракции кислых препаратов и метаболитов из мочи и других биологических образцов в судебно-медицинской экспертизе -оптимизирован для кислых препаратов Кондиционирование Уравновешивание Нанесение Промывка 1 Промывка 2 Элюирование ТГК 2 мл Подготовленного образца 2 мл 0.1 М ацетата натрия, pH6 с 5%MeOH 2 мл ацетата натрия, pH6,высушить патрон 1 мл гексана 2 мл 95:5 гексан:этил ацетат Промывка 1 5 мл 1:1 MeOH: DI вода, высушить 5 минут 2 мл 1%уксусной кислоты в 75:5 гексан:этил ацетат Элюция THC-COOH, 11-OH-THC Матрица: моча, плазма крови, слюна, кровь, биологические жидкости Вещества: 11-нор-Δ9-тетрагидроканнабинол- карбоновая кислота, салициловая кислота, ибупрофен, ацетаминофен, барбитураты и другие соединения с неполярными и анионными свойствами Высушивание и Промывка 2 Отчет о количественном анализе пробы с 0,1 нг/мл ТГК в крови. Среднеквадратичное значение соотношения «сигнал шум» составляет 175:1, измерение шума осуществляли в промежутке от 3,6 до 3,9 мин.

Сорбенты Bond Elut Plexa Bond Elut Plexa - неполярный полимерный сорбент с гидроксилированной поверхностью – для широкого спектра кислых, нейтральных и основных веществ Bond Elut Plexa PCX - катионообменная функциональность, специально разработан для повышения эффективности для широкого спектра основных веществ Bond Elut Plexa PAX - анионообменная функциональность, специально разработан для повышения эффективности для широкого спектра кислых веществ силикагель полимер

Принцип действия Bond Elut Plexa гидрофильный компонент обеспечивает попадание веществ внутрь полимерных частиц чистый экстракт с высоким выходом особая структура пор обеспечивает перенос веществ из частиц белки не связываются с поверхностью и слишком велики, они не проникают в структуру пор вещества остаются прочно связанными внутри гидрофобной сердцевины загрязняющие вещества (липиды и белки) смываются без взаимодействия с анализируемыми веществами вещества поры гидрофобная сердцевина нанесение образца промывка элюция

Морфология частиц сорбента Гидрофильный OH Гидрофобный DVB Исключение белков Полярные препараты в гидрофобном окончании структуры пор Изменение полярности Частота уменьшение олигомеров ОН

Улучшение точности – уменьшение ионной супрессии PCX Другой полимер

October 2014 Company Profile 23 Кондиционирование Уравновешивание Нанесение Промывка 1 Промывка 2 0,5 мл Подготовленного образца Пропитать, дать стечь каплям 1 мл 2% муравьиной кислоты 1 мл метанола, 5-10 мин в вакууме 1 мл смеси этилацетат, метанол и гидроксид аммония (50:50:20) Собрать элюат Установить низкий вакуум (50-75 мм рт.ст.) Выпарить в потоке азота Сорбенты Bond Elut Plexa PCX Разделение амфетаминов и потенциальных мешающих компонентов на колонке Agilent Poroshell 120 EC-C18, 3 х 50 мм, 2,7 мкм наложенные хроматограммы MRM по выделенному иону. Концентрация каждого аналита соответствует 50 нг/мл. Порядок элюирования пиков: 1. фенилпропаноламин; 2. эфедрин; 3. псевдоэфедрин; 4. амфетамин, 5. метамфетамин 6. МДА; 7. МДМА; 8. МДЭА; 9. фентермин Элюирование До 0,2 мл при Т 37 ºС Добавить 100 мкл 0,025 Н раствора соляной кислоты в метаноле, перемешать Выпарить Растворить в 0,5 мл исходной подвижной фазы (15% метанола, 85% воды, 0,1% муравьиной кислоты)

Разве- дение ЖЭЖЭСQuEChERS ТФЭ силика ТФЭ полимер Степень очистки Селективность Расходы Сложность разработки методики Пропускная способность Простота в использовании Повышение концентрации Подходы в пробоподготовке

Принадлежности Bond Elut 96-луночные коллекторы Bond Elut герметизирующая клейкая пленка пустые патроны для создания индивидуальных патронов коллектор на 96 лунок, набор регулировочных подставок полиэтиленовые пористые вкладыши для патронов ТФЭ цилиндрические патроны объемом от 1 до 150 мл патронами с соединением Люэра Bond Elut Jr патроны LRS воронкой и разнообразными массами слоя сорбента планшеты VersaPlate, позволяющие разработать нестандартную конфигурацию можно приобрести в виде готового к использованию 96-луночного планшета или с пустыми пробирками Коллектор Vac Elut 12 Коллектор Vac Elut 20 со штативом для пробирок Коллектор Vac Elut 20 со штативом для пробирок 16 х 15 мм с высоким стеклянным резервыаром Коллектор Vac Elut SPS 24 с воронкой для отвода отходов RU QuEChERS Карты для получения сухой матрицы

Решения компании Agilent Technologies для токсикологии на базе хромато-масс-спектрометрических систем Марина Дегтярева, Agilent Technologies

Возможности масс-спектрометрического оборудования. Круг решаемых задач Подготовка пробы Качественный и количественный анализ этанола и суррогатов алкаголя в биожидкостях Идентификация органических токсичных соединений в крови, слюне и других препаратах Целевой скрининг наркотических и сильнодействующих лекарственных веществ в биологических жидкостях Установление и доказательство долговременного употребления наркотических средств на основании анализа накопления их в волосах Определение элементного состава биологических препаратов с целью выявления случаев отравления неорганическими ядами Обнаружение следов использования огнестрельного оружия Исследование идентичности партий наркотических веществ Исследование вещественных доказательств (осколки стекла, подделка подписей и т.д.)

ГХ/МС 7890B/ с функцией автоматической обратной продувки колонки Токсикологическая библиотека на 723 соединения Программа автоматической деконволюции спектров Метод количественного определения на основе заводской калибровки Библиотека масс-спектров NIST RTL-AMDIS библиотека 723 наркотических и сильнодействующих веществ и их метаболитов Возможность подключать дополнительные библиотеки веществ и создавать собственные Анализатор наркотических и сильнодействующих веществ в сложных матрицах

Коммерчески доступные базы RTL

Разработка метода определения наркотических веществ в волосах методом тандемной хромато-масс-спектрометрии Подготовка к проведению исследования Промывка волос от загрязнений Измельчение волос Проверка прибора на возможные загрязнения (BSTFA+1% TMCS) 30 Метод исследования наркотических веществ в волосах с помощью GC-QQQ на основывается на: экстракции наркотических веществ из волос метанолом с УЗ обработкой и последующим проведением реакции дериватизации с реагентом BSTFA +1%TMCS использовании метода внутреннего стандарта

Газовый хроматограф с масс-спектрометром типа тройной квадруполь Agilent 7010 – возможности технологии МС-МС Точное и надежное определение целевого вещества в сложных матрицах Высокочувствительная система для определения следовых количеств наркотических соединений и их метаболитов в биологических объектах, в том числе в волосах Выявление факта употребления наркотиков за последние 90 дней

32 Q1 SIM Выделение прекурсора перед ячейкой столкновений Удаление химического фона Интенсивность вторичных ионов зачастую снижается, но снижение интенсивности фона более значительное особенно в сложных образцах, что приводит к улучшению соотношения сигнал/шум и снижению пределов обнаружения Продукт 1 Продукт 3 Продукт 2 CID + Q2 SIM Целевые ионы измеряются при полном отсутствии химического фона Почему МС/МС для исследования волос? Низкие пределы обнаружения за счет удаления фона EI: огромное количество ионов из источника

Быстрое определение ТГК и его метаболитов за 7 минут

Быстрое определение ТГК 0,31 m 150 мкм рестриктор LTM-2 неполярная колонка LTM-2 полярная колонка с другой селективностью (12A м DB-1MS) 1 м предколонка в качестве ловушки тяжелых компонентов 10 фг/мкл для всех MRM 1 фг/мкл для целевых MRM Возможность определения метаболитов Анализ нативных форм, привнесенных поверхностным загрязнением Анализ волос для выявления фактов долгосрочного употребления препаратов

Высокочувствительный скрининг биологических образцов на известные наркотические вещества МС/МС детектор для ВЭЖХ Тройной квадруполь Agilent 6420, 6460, 6490, 6495 Предел обнаружения на уровне аттограммов ( ) Зептомольная чувствительность ( ) Библиотечный поиск

Еще выше достоверность идентификации с новым алгоритмом triggered MRM В методе tMRM для каждого аналита определяется вплоть до 10 переходов MRM (первичных и вторичных). Первичные переходы определяются для всех анализов, но когда сигнал одного из первичных переходов превышает заданное пороговое значение, это служит «триггером» для получения вторичных переходов. Порог Первичные МRM переходы Вторичные MRM переходы

Triggered MRM В методе tMRM вторичные MRM переходы, полученные в ходе эксперимента, соединяют с первичными MRM для получения спектра дочерних ионов. Спектр из 10 MRM переходов менее чем за 30 мс!!!

Triggered MRM Полученный спектр затем используется для поиска по библиотеке и подтверждения исследуемого вещества.

Высокоскоростной скрининг и количественное определение наркотических средств (4.5 мин ТГК и менее 1.5 мин остальные) Возможность сканирования до 16 MRM переходов одновременно с соблюдением достаточного уровня чувствительности LCMS исключает необходимость дериватизации, обязательной при GCMS анализе Отсутствие эффекта матрицы Блок количественной оценки автоматически формирует файлы отчетов по веществам Блок качественной оценки позволяет быстро определять подтверждающий ион Преимущества использования ВЭЖХ-QQQ

Пример. Новый набор для токсикологического анализа Тип препарата Cannabinoids Benzodiazepines Barbituates Hallucinogens Hypnotics Antidepressants Stimulants Neuroleptics Antiepileptics Opioids New Designer Drug Более 2500 соединений в базе данных Колонки для ультрабыстрой ВЭЖХ Библиотека triggered MRM New Готовые настройки для приборов

Решение: ГХ или ВЭЖХ с квадруполь-времяпролётным масс-спектрометром нецелевой скрининг маркеров употребления синтетических каннабиноидов, основанный на постоянстве базовой структуры анализов поиск метаболитов известного соединения с использованием масс-спектра высокого разрешения второго поколения протонированных молекулярных ионов вероятных метаболитов, который обеспечивает высокую надежность определения целевой поиск ионов-продуктов, характерных для наиболее распространенных классов психоактивных соединений Возможность достоверного установления структуры неизвестных соединений Идентификация и установление структуры новых и неизвестных наркотических веществ

Квадруполь-времяпролетный МС/МС детектор для ВЭЖХ Agilent 6540 Возможность применения масс- спектрометрии высокого разрешения для идентификации метаболитов в реальных образцах, содержащих метаболиты AM-2201 (JWH-018) и MDMB-CHM

Алгоритм интерпретации данных, полученных методом ВЭЖХ-МС-МС 1. поиск на хромато-масс-спектрограмме образца с помощью программного обеспечения прибора осколочных ионов в мс-мс спектрах, соответствующим наиболее распространенным фрагментам известных психоактивных соединений. 2. поиск на хромато-масс-спектрограмме образца с помощью программного обеспечения прибора ионов, которые соответствуют по массе протонированным ионам метаболитов наиболее известных (искомых) психоактивных соединений, в том числе входящих в Перечень наркотических средств. При этом молекулярная масса возможного метаболита определяется исходя из наиболее распространенных путей метаболизма, описанных в литературе 3. вторичные масс-спектры молекулярных ионов (МН+) обнаруженных в п.2 должны содержать ионы, соответствующие по брутто формуле ионам (при расхождении по мол. массе не более 20 ррм), образующимся в ходе мс-мс эксперимента с нативными веществами (как с учетом метаболитических изменений массы приведенный в п.2 так и без них), либо каким-либо ионам, приведенным в таблице 1, либо иным, известным из литературных данных. 4. вторичные масс-спектры осколочных ионов, образующихся в ионном источнике при повышенном напряжении на фрагментаторе от нативных соединений и от метаболитов, должны содержать аналогичные фрагментные ионы (при расхождении по массе не более 20 ррм).

Возможные пути метаболизма психоактивных веществ в организме -моногидроксилирование (изменение массы на а.е.м), -дигидроксилирование (изменение массы на а.е.м), -замещение фтора на гидроксил (изменение массы на а.е.м), -карбоксилирование (изменение массы на а.е.м, и а.е.м для фторалкилированных психоактивных веществ), -карбоксилирование с укорачиванием углеродной цепи на 2 атома углерода (изменение массы на а.е.м, и а.е.м для фторалкилированных психоактивных веществ). -дезметилирование (изменение массы на а.е.м) -гидролиз сложноэфирной связи и гидролиз терминальных амидных групп (молекулярная масса метаболита определяется исходя из структуры соединения, находящегося в незаконном обороте, метаболиты которого требуется определить в биосредах). -комбинации указанных метаболитических превращений, приводящие к соответствующем продуктам, отличающимся на определенную величину массы а.е.м от первоначального вещества

Хромато-масс-спектрометр высокого разрешения Agilent 7200 GCQTOF Разрешающая способность: > (m/z ) Mass Accuracy: < 5 ppm (m/z ), < 1 ppm с IRM Чувствительность: SN >2000:1 при вводе 1 пг OFN (m/z= ) Линейный динамический диапазон: 3-5 порядков Диапазон масс квадруполя: Da Диапазон масс TOF: Da Скорость сканирования: до 50 спектров/сек + = New

Наличие библиотек точных масс (7 509 психоактивных соединений ) Каннабиноиды Галлюциногены Стимулляторы Опиаты Бензодиазепины Гипнотики Нейролептики Барбитураты Антидепрессанты Противоэпилептические средства

Постановка методик Методика обнаружения более 900 психотропных веществ методом ГХ- МС Методика идентификации наркотических и психотропных веществ в нетрадиционных биологических объектах (волосы, ногти) методом газовой хроматографии и масс-спектрометрии. В перечень обнаруживаемых веществ входят опиаты, амфетамины, каннабиноиды и многие другие. Идентификация проходит при единой пробоподготовке. Проведение идентификации МС спектров этих различных веществ стало возможно благодаря разработанной методике получения комбинированных производных TMS-TFA. Методика обнаружения новых препаратов, появляющихся на рынке незаконного оборота психотропных веществ (производные триптамина, катинона, синтетические каннабиноиды). Методика идентификации летучих токсических веществ, суррогатов этанола методом анализа равновесной парогазовой фазы (ГХ-ПИД)