Университет г. Бари, Италия. Научное отделение фармации и медицины Исследование: Экспериментальное применение Спагириков в микробиологии и гигиене Эффективность воздействия в исследованиях in vitro некоторых натуральных растительных препаратов на возбудителях (Клебсиелла пневмонии, Ацинетобактер) штаммов с характеристиками мультиустойчивости к антибиотикам Апрель 2015, Бари. Италия Rapporteur: Graduate: Chiar.mo Prof. Antonio ROSATO Simona SERRATÌ Chiar.mo Prof. Giuseppe FRACCHIOLLA

Цель Исследования В исследованиях in vitro производилась оценка антимикробной активности некоторых коммерческих продуктов фитотерапии, в частности, против бактериальных штаммов, с отмеченными характеристиками лекарственной устойчивости к антибиотикам. Эксперимент проводился с использованием метода минимальной ингибирующей концентрации (MIC).

Применяемые методы для проведения исследований Минимальные ингибирующие концентрации (MIC). Минимальные бактериальные концентрации 1 (MBC) растительных препаратов а так же бактериальные субстанции, были представлены производственной компанией Erbenobili Srl Corato (BA). 1: Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI) M7-A6 Использовалась 96-ти луночная плата Microtiter® вместимостью каждой лунки 200 μкl. Каждый продукт растворялся двойным разведением с производством посева микрофлорой в отдельных лунках.

Микроразведения Микроразведения Preparation of the plate Microtiter® Берется 200 μL и депонируется в первом столбце. Во второй ряд помещается 100 мкл. раствора. Процесс разведения. Берется 100 μкL из первой колонки и размещается во второй колонке. Из второй колонки берется 100 μкL размещается в третьей колонке, затем из третьей в четвертую и т.д., что бы в каждой было всего по 100 мкл.

Microtiter Plate ® 200 µl Этот метод использует окончательное накопление исследуемого раствора по 100 мкл. на 1 лунку. С возможностью увеличения общего объема 1 лунки до 200 мкл.

Исследуемые коммерческие препараты Путем оценки минимальной ингибирующей концентрации (МИК) можно было определить в количественном выражении антимикробную активность следующих препаратов: Компоненты PropGola водно-спиртовой экстракт прополиса и мед, эфирные масла: чайного дерева, эвкалипта и мануки, витамин С и глюконат цинка. Propoli Fitomater 20% прополис, дистиллированная вода, винный этиловый спирт и красный виноградный сок. FluProp дистиллированная вода, растительный глицерин, мед, экстракт водно-спиртовой прополиса 20%, исландский лишайник, сухой экстракт корня эхинацеи и корня астрагала, витамин С, глюконат цинка. Калия сорбат. Ribes nigrum вымоченных глицерин почки черной смородины, этиловый спирт, растительный глицерин, красный виноградный сок. Baby Gola Водный раствор корицы, чабреца и масла чайного дерева, глюконат цинка и витамина С, растительного глицерина. Калия сорбат.

Состав задекларированный производителем Composition of the tested products towards bacterial microorganisms FluPropBaby gola Fitomater Of Propoli Ribes nigrum PropGola propolis hydroalcoholic extract 30% yes Icelandic lichen hydroalcoholic extract 20% yes dry extract of Echinacea root yes dry extract of astragalus root yes Vit. C yes Zinc gluconateyes cinnamon wateryes thyme wateryes Essential oil of cinnamonyes Essential oil of tea treeyes zincyes macerated glycerine buds of blackcurrant yes red vineyes Propolis 20%yes red grape juice yes honeyyes manukayes eucalyptusyes erisimoyes Содержание эссенций, масел, прополиса и других продуктов... 2 ErbeNobili S.r.L, Corato-Bari

Products analysis of gas mass FluProp Baby gola Baby gola Mirtillo Fitomater Of Propoli Ribes nigrum PropGola Пропановая кислота 43,05%15,98% 4,56%60,41% Сорбат калия 42,27%39,59%17,76% Глицерин растительный 29,49% 39,59% Терпинен – 4 - olo12,35%6,09%12,29% Сукциновая кислота 3,15% Eugenolo21,12% Коффеин 13,03% Borneolo3,31% 9-octadecenamide25,48% 2-Propen-1-one28,03%10,50% Etossiacetaldeide dietilacetato 15,19% Уксусная кислота 14,32% Определение состава газоанализатором. … и консерванты: сорбат калия и этанол.

Серии разведения тестируемых препаратов Препарат Разведение Диапазон(% v/v) PropGola1:50,50 – 0,01 Propoli Fitomater 1:50,50 - 0,01 FluProp1:53,70 – 0,11 Ribes Nigrum1:56,80 – 0,21 Baby Gola1:56,80 – 0,21 Препарат Разведение Диапазон (%v/v) PropGola1:100,50 – 0,01 Propoli Fitomater 1:100,50 – 0,01 FluProp1:43,70 - 0,11 Ribes Nigrum1:46,80 - 0,21 Baby Gola1:412,50 - 0,19 Растворы с первоначальным добавлением 1,5 мл. этанола Мультирезистентные штаммыIsolation and ATCC

Serial dilutions of the tested products SampleDilution Range (%v/v) PropGola1:100,50 – 0,01 Propoli Fitomater 1:53,70 – 0,05 FluProp1:53,70 - 0,05 Ribes Nigrum1:2,513,6 - 0,21 Baby Gola1: ,39 Dilution without initial addition of ethanol. Isolation and ATCC SampleDilution Range (%v/v) PropGola1:50,50 – 0,01 FluProp1:58,5 – 1,06 Ribes Nigrum1:57,00 – 0,87 Baby Gola1:510 – 1,25 Multiresistant strains

MYCETE Candida glabrata ATTCC 6260 Candida glabrata 18A19 Candida parapsilosis 1A1 Candida albicans ATTCC Candida albicans ATTCC Candida tropicalis ATCC 750 Candida parapsilosis 11A13 Candida parapsilosis Candida albicans A18 Candida Kefyr 6258 Gram negative bacteria Acinetobacter baumannii ATCC Escherichia coli ATCC Klebsiella pneumoniae ATCC Pseudomonas aeruginosa ATCC Citrobacter freundii Ig1 Serratia marcescens Ig1 Используемые микроорганизмы Gram positive bacteria Bacillus subtilis ATCC 6633 Bacillus cereus ATCC Staphylococcus epidermidis Ig4 Staphylococcus epidermidis Ig1 Staphylococcus epidermidis Ig6 Staphylococcus aureus Ig5 Staphylococcus aureus Ig23 Staphylococcus aureus Ig24 Staphylococcus aureus Ig22 Staphylococcus aureus ATCC Staphylococcus aureus ATCC Staphylococcus aureus ATCC 6538p Enterococcus faecalis ATCC Микробные штаммы получены ATCC (American Type Culture Collection) и клинические изоляты (Департамент биомедицинских наук и онкологии человека - Университета Бари-лаборатории бактериологии и микологии).

Multi-Resistant Bacteria Acinetobacter baumannii BS1 Klebsiella pneumoniae BS1 Acinetobacter baumannii BS2 Klebsiella pneumoniae BS2 Acinetobacter baumannii BS3 Мы также использовали полирезистентные бактериальные культуры strains4. 4 Laboratorio Analisi Opera Don Uva di Bisceglie.

Mультирезистентность Устойчивость к антибиотикам, или устойчивости к нескольким антибиотикам, представляет собой явление, при котором бактериальная популяция устойчива к антимикробной активности противомикробных препаратов. Хромосомный тип, имеет способность к одной или нескольким мутациям. Становиться устойчивым к одному классу антибиотиков; Внехромосомный тип, из-за присутствия плазмид, кодирующих факторы, связанные с резистентностью. В результате чего возникает отсутствие чувствительности к переменным числам антибиотиков по различным механизмам; Передача информации устойчивости с помощью транспозонов (конъюгативная явления), способных перемещаться из одной точки в другие хромосом и плазмид.

Оценка минимальной ингибирующей концентрации

MIC prodotti: 1^prova Propoli FitomaterFluPropPropGolaRibes nigrumBaby GolaBaby Gola mirtillo Bacillus subtilis ATCC 66330,250,230,25R6,25 Bacillus cereus ATCC ,120,230,121,726,25 Staphylococcus epidermidis Ig40,120,110,011,7212,50 Staphylococcus epidermidis Ig10,120,460,016,8012,50 Staphylococcus epidermidis Ig60,120,110,011,726,25 Staphylococcus aureus Ig50,250,230,251,726,25 Staphylococcus aureus Ig230,250,110,250,86R12,50 Staphylococcus aureus Ig240,250,110,251,72R12,50 Staphylococcus aureus Ig220,250,110,251,7212,50 Staphylococcus aureus ATCC ,250,110,251,7212,506,25 Staphylococcus aureus ATCC ,120,110,010,866,25 Staphylococcus aureus ATCC 6538p0,120,230,120,8612,50 Enterococcus faecalis ATCC ,060,110,010,8612,50 Грамположительные бактерии с добавлением этанола.

Propoli Fitomater FluProp PropGolaRibes nigrumBaby GolaBaby Gola mirtillo Acinetobacter baumannii ATCC ,250,460,256,801,56 Escherichia coli ATCC ,120,460,126,8012,50 Klebsiella pneumoniae ATCC ,120,230,250,8612,50 Pseudomonas aeruginosa ATCC RRRR12,50 Citrobacter freundii Ig1 R0,460,030,4212,50 Serratia marcescens Ig1 R1,80RR12,50 Грамм отрицательные бактерии с добавлением этанола. MIC prodotti: 1^prova

Propoli FitomaterFluPropPropGolaRibes nigrumBaby GolaBaby Gola mirtillo Candida glabrata ATTCC ,501,85RRRR Candida glabrata 18A19 0,503,70RRRR Candida parapsilosis 1A1 0,120,460,250,126,25 Candida albicans ATCC R3,70R12,5R Candida albicans ATCC RRRRRR Candida tropicalis ATCC 750 0,121,850,5RRR Candida parapsilosis 11A13 0,120,920,12 RR Candida parapsilosis ,123,700,12 Candida albicans A18 0,121,850,25R Candida kefyr 6258 R3,70RRRR MIC prodotti: 1^prova Грибы с добавлением этанола.

Propoli FitomaterFluPropPropGolaRibes nigrumBaby Gola Baby Gola mirtillo Acinetobacter baumannii BS1 R3,70R6,80 Klebsiella pneumoniae BS1 R1,85R3,406,80 Acinetobacter baumannii BS2 R3,70R6,80 Klebsiella pneumoniae BS2 R1,85R3,406,80 Acinetobacter baumannii BS3 R1,85R6,80 Mультирезистентные бактерии с добавлением этанола. MIC prodotti: 1^prova

Propoli FitomaterFluPropPropGolaRibes nigrumBaby GolaBaby Gola mirtillo Bacillus subtilis ATCC 66330,23 0,25R6,25 Bacillus cereus ATCC ,110,230,253,406,25 Staphylococcus epidermidis Ig40,110,920,253,4012,50 Staphylococcus epidermidis Ig10,111,850,253,4012,50 Staphylococcus epidermidis Ig60,110,920,253,406,25 Staphylococcus aureus Ig50,110,920,061,706,25 Staphylococcus aureus Ig230,230,110,251,70R12,50 Staphylococcus aureus Ig240,23 0,251,70R12,50 Staphylococcus aureus Ig220,230,050,251,7012,50 Staphylococcus aureus ATCC ,230,920,061,7012,506,25 Staphylococcus aureus ATCC ,460,920,256,806,25 Staphylococcus aureus ATCC 6538p0,110,050,250,2112,50 Enterococcus faecalis ATCC ,11 0,253,4012,50 MIC prodotti: 2 ^prova Грамм положительные бактерии без добавления этанола.

Propoli FitomaterFluPropPropGolaRibes nigrumBaby GolaBaby Gola mirtillo Acinetobacter baumannii ATCC ,230,460,256,801,56 Escherichia coli ATCC ,230,920,126,8012,50 Klebsiella pneumoniae ATCC ,460,230,250,8512,50 Pseudomonas aeruginosa ATCC RRR13,6012,50 Citrobacter freundii Ig1 R 1,85 0,500,4212,50 Serratia marcescens Ig1 0,92RR13,6012,50 MIC prodotti: 2 ^prova Грамм отрицательные бактерии без добавления этанола.

Propoli FitomaterFluPropPropGolaRibes nigrumBaby GolaBaby Gola mirtillo Acinetobacter baumannii BS1 R8,50R7,0010 Klebsiella pneumoniae BS1 R8,50R3,5010 Acinetobacter baumannii BS2 R8,50R7,0010 Klebsiella pneumoniae BS2 R8,50R3,5010 Acinetobacter baumannii BS3 R8,50R7,0010 MIC prodotti: 2 ^prova Мультирезистентная микрофлора без добавления алкоголя.

Multi-resistant Gram-negative bacteria Ethanol Acinetobacter baumannii BS1R Klebsiella pneumoniae BS1R Acinetobacter baumannii BS2R Klebsiella pneumoniae BS2R Acinetobacter baumannii BS3R Дальнейшее испытание на нескольких штаммах устойчивых бактерий для оценки действия этанола (7,5 до 0,11% об.) и сорбата калия (1,00 до 0,03% об.) Этанол является эффективным средством против грамположительных, отрицательных бактерий и грибов, но неэффективным для мультирезистентных.

Multi-resistant Gram-negative bacteriaPotassium sorbate Acinetobacter baumannii BS1R Klebsiella pneumoniae BS1R Acinetobacter baumannii BS2R Klebsiella pneumoniae BS2R Acinetobacter baumannii BS3R Оценка с сорбатом калия.

Рейтинг бактерицидной активности Strain: Klebsiella pneumoniae BS2 Total inhibition Product tested: Baby gola Strain: Klebsiella pneumoniae BS1 No inhibition Product tested: FluProp

Мы можем сделать вывод, что результаты исследования обусловлены : Синергическим действием Наличием пропионовой кислоты Многоцелевым действием

Результаты исследования PropGola: Препарат PropGola: Препарат активен для бактериальных штаммов и грибков, кроме двух грамотрицательных штаммов. На мультирезистентные штаммы действия не оказывает. Propoli Fitomate: Propoli Fitomate: за исключением трех случаев грамотрицательных бактерий, Citrobacter freundii IG1, синегнойной палочки, Serratia marcescens IG1, оказался активным. Препарат имеет мягкий эффект на грибы и активен по отношению к мульти-резистентным штаммам бактерий. PropGola: Препарат PropGola: Препарат активен для бактериальных штаммов и грибков, кроме двух грамотрицательных штаммов. На мультирезистентные штаммы действия не оказывает. Propoli Fitomate: Propoli Fitomate: за исключением трех случаев грамотрицательных бактерий, Citrobacter freundii IG1, синегнойной палочки, Serratia marcescens IG1, оказался активным. Препарат имеет мягкий эффект на грибы и активен по отношению к мульти-резистентным штаммам бактерий.

FluProp: FluProp: Он имеет антимикробное и противогрибковое действия. Имеет активность только для грамотрицательной синегнойной палочки. Оказывает бактериостатическое действие на мультирезистентные штаммы бактерий. Ribes nigrum: Ribes nigrum: активен для бактерий и грибов и некоторых грамотрицательных бактерий, кроме: синегнойной палочки Serratia marcescens. Оказывает сильный бактериостатическое действие на мультирезистентные штаммы бактерий. Baby Gola : Baby Gola :компоненты солюбилизируют в отсутствие этанола. Препарат имеет заметную антибактериальную активностью и эффективность против грибковых штаммов. А так же показывает, мощное бактерицидное действие против полирезистентных штаммов бактерий.

Это экспериментальное исследование еще раз показывает, определенным образом, способность к выраженному и мощному противомикробному действию Спагириков от Erbenobili. Бактериостатическое и бактерицидное действие обнаружено к бактериальным штаммам с необычным для последних особым биологическим арсеналом, способным оказывать антимикробное действие недоступное большим количествам классических антибиотиков. Так как это исследование ограничивается опытом в in vitro, это еще более увеличивает ценность применения данных препаратов в тяжелых случаях лечения бактериальных инфекций связанных с бактериальной резистентностью.

Thanks for your attention Thanks to: Doctor Vincenzo Corrado MD (Hospital Don Uva – Bisceglie (BA) for the multi-resistant bacterial strains. Erbenobili srl di Corato (BA) for the provided products.