Зиновьева Наталия Анатольевна доктор биологических наук, профессор, академик РАН, Директор, рук. Центра биотехнологии и молекулярной диагностики ВИЖ им. Л.К. Эрнста Гладырь Елена Александровна, кандидат биологический наук Зав. Лаборатории молекулярной генетики животных ВИЖ им. Л.К. Эрнста Соглашение от 27 июня 2014 г. «М ОДЕЛИРОВАНИЕ ПАНЕЛЕЙ МОЛЕКУЛЯРНО - ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ И РАЗРАБОТКА ТЕСТ - СИСТЕМ ИХ ИДЕНТИФИКАЦИИ НА ОСНОВЕ ТЕХНОЛОГИЙ ГЕННОГО И ГЕНОМНОГО АНАЛИЗА ДЛЯ РАННЕГО ОТБОРА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ ПО ХОЗЯЙСТВЕННО - И ЭКОНОМИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫМ ПРИЗНАКАМ » Получатель субсидии: В СЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО - ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЖИВОТНОВОДСТВА ИМЕНИ АКАДЕМИКА Л.К. Э РНСТА (ВИЖ ИМ. Л.К. Э РНСТА ) Вид средств Итого Субсидия, млн. руб.5,79,08,022,7 ВБС, млн. руб.1,472,582,066,11 Итого, млн. руб.7,1711,5810,0628,81

Вызов для России* Потеря биоразнообразия Угроза для России* Низкая эффективность сельскохозяйственного производства Решение Разработка современных методов управления генетическими ресурсами с.-х. животных * Долгосрочный прогноз научно-технологического развития РФ до 2030 г." (2013) Тенденции в воспроизводстве молочного скота: Сервис-период (Washburn, 2002) : 126 дн. 169 дн. Число осеменений на корову (Lucy, 2001) – : 1,8 3,0 Интервал между отелами (Lucy, 2001) – : 13,5 мес. 14,9 мес. Стельность, % (Silvia, 1998) – : 62% 34% Молочная продуктивность (удой за лактацию на 1 корову): Россия – 3,5 тонн (2013), США – 9,8 тонн Приоритетная задача – создание биотехнологий, направленных на повышение эффективности использования биоресурсов для производства продукции животноводства АКТУАЛЬНОСТЬ И ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЙ 2 Цель - методическое и методологическое обеспечение разработки и внедрения в стране технологий генетической селекции молочного скота посредством моделирования панелей молекулярно-генетических маркеров и разработки систем их идентификации для раннего отбора животных по хозяйственно- и экономически значимым признакам

ЭТАПЫ ВЫПОЛНЕНИЯ ПРОЕКТА Формирование экспериментальной популяции быков-производителей (выборка 1, n=96, достоверность EBV>70%) Формирование панелей ДНК-маркеров «Фертильность» и «Продуктивность» по результатам теоретических и экспериментальных исследований LoF-мутации Функциональные гены-кандидатыGWAS Панель «Фертильность» (не менее 5 ДНК-маркеров) Панель «Продуктивность» (не менее 5 ДНК-маркеров) Разработка макетов тест-систем для анализа ДНК-маркеров Разработка комплектов научно-технической документации и рекомендаций по использованию тест-систем Широкая практическая апробация тест-систем (n=1000) и разработка рекомендаций по использованию тест-систем 3 Этапы 2, 3 (2015 г.) Проведение исследовательских испытаний макетов тест-систем Проведение дополнительных экспериментальных исследований по результатам и исследования расширенной экспериментальной популяции (выборка 2, n=240) и проведенных исследовательских испытаний

2.1. Определение спектра молекулярно- генетических маркеров (не менее 5) для включения в разрабатываемую панель "Продуктивность" Разработка тест-систем для анализа молекулярно-генетических маркеров, включенных в панели "Продуктивность" и "Фертильность" Получение (изготовление) тест-систем для анализа молекулярно-генетических маркеров, включенных в панели "Продуктивность" и "Фертильность". Промежуточный отчет о ПНИ. Акты изготовления тест-систем для анализа молекулярно- генетических маркеров, включенных в панели "Продуктивность" и "Фертильность". Работы, выполняемые за счет ВБС: 2.4. Теоретическое моделирование тест-систем анализа полиморфизма молекулярно-генетических маркеров, включенных в панель "Продуктивность" Проведение аналитических популяционно- генетических исследований быков-производителей экспериментальной популяции (выборка 1) по микросателлитным и SNP-маркерам 2.6. Материально-техническое обеспечение работ этапа. Протоколы популяционно- генетических исследований быков-производителей экспериментальной популяции (выборка 1) по микросателлитным и SNP- маркерам ЭТАП 2: Моделирование панели молекулярно-генетических маркеров "Продуктивность«Разработка макетов тест-систем для анализа молекулярно-генетических маркеров, включенных в панели "Продуктивность" и "Фертильность" 4

3.1. Разработка Программ и методик исследовательских испытаний тест-систем Проведение исследовательских испытаний тест-систем молекулярно-генетических маркеров, включенных в панели "Продуктивность" и "Фертильность" Промежуточный отчет о ПНИ. Программы и методики исследовательских испытаний тест-систем. Протоколы исследовательских испытаний тест-систем анализа молекулярно-генетических маркеров. Работы, выполняемые за счет ВБС: 3.3. Проведение ассоциативных исследований молекулярно-генетических маркеров с хозяйственно- и экономическими значимыми признаками Исследование необходимости и возможности усовершенствования панелей молекулярно- генетических маркеров "Продуктивность" и "Фертильность" Материально-техническое обеспечение работ этапа. Протоколы ассоциативных исследований молекулярно- генетических маркеров с хозяйственно- и экономическими значимыми признаками. ЭТАП 3: Проведение исследовательских испытаний тест-систем на экспериментальной популяции (выборка 1) 5

6 П РОВЕДЕНИЕ ПОЛНОГЕНОМНЫХ АССОЦИАТИВНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ (GWAS) ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЕ СПЕКТРА ДНК- МАРКЕРОВ ДЛЯ ВКЛЮЧЕНИЯ В РАЗРАБАТЫВАЕМУЮ ПАНЕЛЬ «П РОДУКТИВНОСТЬ » 1. Дополнительные полно геномные исследования SNP-профилей быков-производителей (n=144) с использование 50K BeadChip (54609 SNPs); 2. Расчет племенной ценности (EBV) быков-производителей по показателям молочной продуктивности дочерей (n дочерей =28435) 3. Проведение полногеномных ассоциативных исследований Y ijk – показатель продуктивности k-ой первотелки за 305 дней; μ – популяционная константа; HYS i – фиксированный эффект i-го «стада-года-сезона» отела (i=1, …, 1271 факторов); b 1,2 – коэффициенты линейной регрессии; А k – возраст первого отела k-ой первотелки; DO k – продолжительность сервис-периода k-ой первотелки S j – рандомизированный эффект j-го быка-производителя (j=1, …, 96 гол.); e ijk – эффект неучтенных факторов.

7 О ПРЕДЕЛЕНИЕ СПЕКТРА ДНК- МАРКЕРОВ – КАНДИДАТОВ ДЛЯ ВКЛЮЧЕНИЯ В РАЗРАБАТЫВАЕМУЮ ПАНЕЛЬ «П РОДУКТИВНОСТЬ » ПО РЕЗУЛЬТАТАМ GWAS Приз- нак Число SNP R2R2 P (порог <10 -5 ) Хромосомы MY160,075-0,1097,6*10 -8 – 9,4* , 5, 7, 11, 13, 17 FC90,079-0,1134,1*10 -8 – 5,7* , 9, 10, 14 PC50,075-0,0938,0*10 -7 – 9,7* ,20 FY30,075-0,0852,4*10 -6 – 9,9* , 13, 17 PY130,076-0,0974,6*10 -7 – 9,9* , 5, 11, 13, 17, 25 MY - уровень удоя, кг, FC - массовая доля жира, %, FY - выход молочного жира, кг, PC - массовая доля белка, %, PY - выход молочного белка, кг

8 2. Выбор функциональных генов-кандидатов по результатам анализа научно-информационных источников DGAT1_K232A - диацилглицерол О-ацилтрансфераза 1 (BTA14); GHR_F279Y - рецептор гормона роста (BTA20). SLC2A13 – 13-й член семейства растворенных веществ 2, OSR1 - непарно-связанный фактор транскрипции 1, PAX8 - содержащий парный домен фактор транскрипции 8, DGAT1 - диацилглицерол О-ацилтрансфераза 1 ГенBTAДостоверность ассоциаций (p) MY, кгFY, кгPY, кгFC, % SLC2A1350, ,000060,00009 OSR1110, ,000030,00001 PAX8110, ,000020,00004 DGAT1140, В ЫБОР ДНК- МАРКЕРОВ ( ПО ТЗ - НЕ МЕНЕЕ 5) ДЛЯ ВКЛЮЧЕНИЯ В РАЗРАБАТЫВАЕМУЮ ПАНЕЛЬ "П РОДУКТИВНОСТЬ ". 1. Выбор ДНК-маркеров по результатам полногеномных ассоциативных исследований с племенной ценностью быков- производителей

п/п ДНК- маркер ВТР Краткое описание метода, лежащего в основе тест-системы 1 SLC2A1 3 1ПЦР-ПДРФ анализ 2 пиросеквенирование 2PAX81ПЦР-ПДРФ анализ 2Пиросеквенирование 3OSR11ПЦР-ПДРФ анализ 2Пиросеквенирование 4DGAT11ПЦР-ПДРФ анализ 2Пиросеквенирование 5 DGAT1- K232A 1ПЦР-ПДРФ анализ 2Пиросеквенирование 6 GHR- F279Y 1 ПЦР-ПДРФ анализ с созданием специфического сайта рестрикции посредством введения нуклеотидной замены в праймер 2Пиросеквенирование ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ТЕСТ-СИСТЕМ АНАЛИЗА ДНК- МАРКЕРОВ, ВКЛЮЧЕННЫХ В ПАНЕЛЬ «ПРОДУКТИВНОСТЬ" 9 Пример: теоретическая модель тест-системы для анализа GHR-F279Y методом про секвенирования (PR6_ВТР2)

10 РАЗРАБОТКА И ИЗГОТОВЛЕНИЕ МАКЕТОВ ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ АНАЛИЗА МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ, ВКЛЮЧЕННЫХ В ПАНЕЛИ "ПРОДУКТИВНОСТЬ" И "ФЕРТИЛЬНОСТЬ" п/п ДНК-маркер Лока- лизация Полиморфизм ГенотипыМетод ВТР1ВТР2 Панель «Продуктивность» 1 SLC2A13 BTA5 СTСTCC, CT, TT PSQPCR_RFLP 2 PAX8 BTA11 AGAA, AG, GG PSQPCR_RFLP 3 OSR1 BTA11 ACAA, AC, CC PSQPCR_RFLP 4 DGAT1 BTA14 AGAA, AG, GG PSQPCR_RFLP 5 DGAT1_K232A BTA14 GСAA (A232K)AA, AK, KK PSQPCR_RFLP 6 GHR_F279Y BTA20 TA (F279Y)FF, FY, YY PSQPCR_RFLP Панель «Фертильность» 1FANCIBTA21Del (V877Lfs27X)++, +Del, DelDel-PCR 2APAF1BTA5СT (Q579X)CC, CT, TTPSQPCR_RFLP 3SMC2BTA8TC (F1135S)TT, TC, CCPSQSTAS-PCR 4GARTBTA1AC (N290T)AA, AC, CCPSQPCR_RFLP 5SLC35A3BTA3GT (V180F)GG, GT, TTPSQPCR_RFLP 6ITGB2BTA1AGAA, AG, GGPSQPCR_RFLP 7GPR161BTA3GAGG, GA, AAPSQPCR_RFLP 8MAP1BBTA20GAGG, GA, AAPSQPCR_RFLP PSQ – пиросеквенирование; PCR – полимеразная цепная реакция, STAS-PCR – аллелеспецифическая PCR; RFLP – полиморфизм длин рестрикционных фрагментов

СОСТАВ КОМПЛЕКТА РЕАГЕНТОВ ТЕСТ-СИСТЕМЫ (НА ПРИМЕРЕ ТЕСТ-СИСТЕМЫ PR1_ВТР2) 11 Наименование реагента Маркиро вка Фасовка Условия хранения Специальные реагенты: олигонуклеотиды разработаны Oligo1 Oligo2 2 пробирки по 0,055 см 3 (мл) минус 20ºC Реагент для ПРЦ 1 (10 х буфер для ПЦР) разработан ПЦР 11 пробирки, 0,165 см 3 (мл) минус 20ºC Реагент для ПЦР 2 (2 мМ дНТФ) заимствован ПЦР 21 пробирки, 0,165 см 3 (мл) минус 20ºC Реагент для ПЦР 3 (Taq-полимераза) заимствован ПЦР 31 пробирки, 0,022 см 3 (мл) минус 20ºC Вода для ПЦР заимствован H 2 O bidest 1 пробирки, 1,5 см 3 (мл) плюс 2-8ºС Контрольный образец 1 (ДНК с известным генотипом концентрацией 50 нг/мкл) разработан K11 пробирка по 0,05 см 3 (мл) минус 20ºC Контрольный образец 2 (ДНК с известным генотипом концентрацией 50 нг/мкл) разработан K21 пробирка по 0,05 см 3 (мл) минус 20ºC Реагент GenTest1 (эндонуклеаза рестрикции BstMAI) заимствован GenTest11 пробирки по 0,015 см 3 (мл) минус 20ºC Буфер W+BSA заимствован Buf11 пробирки, 0,120 см 3 (мл) минус 20ºC

12 РАЗРАБОТКА ПРОГРАММ И МЕТОДИК ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИХ ИСПЫТАНИЙ ТЕСТ-СИСТЕМ АНАЛИЗА ДНК-МАРКЕРОВ, ВКЛЮЧЕННЫХ В ПАНЕЛИ "ПРОДУКТИВНОСТЬ" И "ФЕРТИЛЬНОСТЬ" Пункт программы испытаний Наименование показателя Ед. изм. Номинальное значение 3.1. Проверка на соответствие комплектности объекта испытаний 3.2. Проверка комплектности объекта испытаний 3.3Проверка показателей назначения Возможность идентификации обоих аллелей молекулярно- генетических маркеров число аллелей Возможность использования ДНК, выделенной различными методами число методов выделения ДНК Возможность использования ДНК, выделенной из различных типов биологического материала кол-во типов материала Аналитическое количество геномной ДНК нг

13 СОЗДАНИЕ СЕРИИ РЕФЕРЕНТНЫХ ОБРАЗЦОВ С ИЗВЕСТНЫМИ ГЕНОТИПАМИ ПО ДНК-МАРКЕРАМ ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИХ ИСПЫТАНИЙ ТЕСТ-СИСТЕМ Группа Биологический материал Метод выделения ДНК Количество образцов Номера образцов IТкань (выщип)DIAtomTM DNA Prep10010R1-R10 IIТкань (выщип)NextTech10R11-R20 IIIТкань (выщип)Перхлорат 10R21-R30 IVСпермаDIAtomTM DNA Prep10010R31-R40 VСпермаNextTech10R41-R50 VIСперма Перхлорат 10R51-R60 Итого 60R1-R60 Создание серии референтых образцов (на примере ДНК-маркера SMC2) А - теоретически смоделированные гистограммы в зависимости от генотипа по SMC2, Б, В - результирующие пикограммы последовательности SMC2 в области исследуемой мутации: генотип ТТ (Б) и генотип СТ (В)

14 ПРОВЕДЕНИЕ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИХ ИСПЫТАНИЙ ТЕСТ-СИСТЕМ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ, ВКЛЮЧЕННЫХ В ПАНЕЛИ "ПРОДУКТИВНОСТЬ" И "ФЕРТИЛЬНОСТЬ" (на примере ДНК-маркера SMC2) Б. Результаты генотипирования референтных образцов М А. Теоретическая модель тест-системы определения полиморфизма SMC2 на основе STAS-PCR 219 п.о. 155 п.о. 112 п.о. 500 п.о. 400 п.о. 300 п.о. 200 п.о. 100 п.о. Завершены испытания 10 из 13 разработанных макетов тест-систем

15 п/п ДНК-маркерВТР1ВТР2Примечание Панель «Продуктивность» 1 SLC2A испытания не завершены 2 PAX8 + + прошел испытания 3 OSR1 + + прошел испытания 4 DGAT1 + - испытания не завершены 5 DGAT1_K232A + + прошел испытания 6 GHR_F279Y + + прошел испытания Панель «Фертильность» 1FANCIн.о.+ВТР1 не разрабатывался, прошел испытания 2APAF1++прошел испытания 3SMC2++прошел испытания 4GART++мономорфный (доп. исследования) 5SLC35A3++прошел испытания 6ITGB2++прошел испытания 7GPR161+-испытания не завершены 8MAP1B++мономорфный (исключен из панели) АКУТАЛЬНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИХ ИСПЫТАНИЙ ТЕСТ- СИСТЕМ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ, ВКЛЮЧЕННЫХ В ПАНЕЛИ "ПРОДУКТИВНОСТЬ" И "ФЕРТИЛЬНОСТЬ" Завершены испытания 11 из 13 разработанных макетов тест-систем

ПОКАЗАТЕЛИ РЕЗУЛЬТАТИВНОСТИ (1) Публикация по результатам исследований – 4 (индикатор - 2) 1Способ диагностики полиморфизма SMC2, ассоциированного с гаплотипом фертильности HH3 крупного рогатого скота Рег Дата подачи: Зиновьева Н.А., Гладырь Е.А., Багиров В.А., Брем Г. Динамика биоразнообразия отечественного черно-пестрого скота под воздействием кроссбридинга // Вестник ВОГиС, 2015, 2, с Sermyagin A.A., Gladyr E.A., Kharitonov S.N., Ermilov A.N., Yanchukov I.N., Strekozov N.I., Zinovieva N.A. Genome-wide association study for milk production traits in Russian dairy cattle // J. Anim. Sci., 2015, V. 93, Suppl. s3, Sermyagin A.A., Gladyr E.A., Kharitonov S.N., Ermilov A.N., Yanchukov I.N., Strekozov N.I., Zinovieva N.A. Genome-wide association study for reproduction traits in Russian Holsteins // Reprod. Dom. Anim., 2015, V. 50, Suppl. 3, p Сермягин А.А., Гладырь Е.А., С.Н. Харитонов С.Н., Ермилов А.Н., Стрекозов Н.И., Брем Г., Зиновьева Н.А. Полногеномный анализ ассоциаций по хозяйственно- полезным признакам скота в российской популяции голштинской породы // Сельскохозяйственная биология, 2015, 6, в печати 16 Патентные заявки, поданные по результатам исследований и разработок – 1 (индикатор – 1)

17 1VIII Московский межд. конг. "Биотехнология: состояние и перспективы развития" г. Москва, марта 2015 г. Пригл. доклад Зиновьева Н.А. 2XXII Межд. науч. конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» г. Москва, 15 апреля 2015 г. Постер Сермягин А.А. 3V Международный ветеринарный конгрессг. Москва, 23 апреля 2015 г. Пригл. доклад Зиновьева Н.А. 4Международная конференция: "Молочное животноводство: повышение инвестиционной привлекательности" Г. Сочи, 30 июня-2 июля 2015 г. Пригл. доклад Сермягин А.А. 515th Joint Ann. Meeting of the American Dairy Scie. Assoc. and American Society of Animal Science Florida, USA of July, 2015 Постер Сермягин А.А. 6Выездное совещание Минсельхоза РФ "О результатах и основных направлениях совершенствования селекционно-племенной работы в молочном скотоводстве РФ" Московская обл., 12 августа 2015 г. Пригл. доклад Зиновьева Н.А. 766th annual meeting of the European Federation of animal science Poland, 31 Aug. - 4 Sept., 2015 Постер Сермягин А.А. 819th Annual Conference of Europe Society for Domestic Animal Reproduction Bulgaria, Sept., 2015 Постер Сермягин А.А. 9Областной семинар-совещание "Состояние и перспективы развития племенного и товарного животноводства" Московская обл., 23 сентября 2015 г. Пригл. доклад Гладырь Е.А., Сермягин А.А. 10Международный научно-практический семинар "Особенности европейской и отечественной трансплантации эмбрионов" Московская обл., 6-7 октября 2015 г. Пригл. доклад Зиновьева Н.А. Мероприятия по демонстрации и популяризации результатов и достижений науки – 10 (индикатор – 3) ПОКАЗАТЕЛИ РЕЗУЛЬТАТИВНОСТИ (2)

ДОСТИЖЕНИЕ ЗАДАННЫХ ЗНАЧЕНИЙ ПОКАЗАТЕЛЕЙ РЕЗУЛЬТАТИВНОСТИ (ИНДИКАТОРЫ) п/ п Наименование Еди- ница изме- рения Значения по проекту ВСЕГО Значения на текущий год Заплани- ровано достиг- нуть Факти- чески достиг- нуто Заплани- ровано на текущий год Достиг- нуто за отчетный период Достиг- нуто итого за текущий год 1Число публикаций по результатам исследований и разработок в научных журналах, индексируемых в базе данных Scopus или в базе данных "Сеть науки" (WEB of Science), не менее еди- ниц Число патентных заявок, поданных по результатам исследований и разработок, не менее еди- ниц Доля исследователей в возрасте до 39 лет в общей численности исследователей - участников проекта, не менее про- цен- тов 3966,73966,7 4Объем привлеченных внебюджетных средств млн. руб. 6,114,602,581,402,95 18

ДОСТИЖЕНИЕ ЗАДАННЫХ ЗНАЧЕНИЙ ПОКАЗАТЕЛЕЙ РЕЗУЛЬТАТИВНОСТИ (ПОКАЗАТЕЛИ) п/п Наименование Еди- ница изме- рения Значения по проекту ВСЕГО Значения на текущий год Заплани- ровано достиг- нуть Факти- чески достиг- нуто Заплани- ровано на текущий год Достиг- нуто за отчетный период Достиг- нуто итого за текущий год 1Средний возраст исследователей – участников проекта, не более лет 4639,34739,3 2Количество мероприятий по демонстрации и популяризации результатов и достижений науки, в которых приняла участие и представила результаты проекта организация - исполнитель проекта, не менее еди- ниц Число диссертаций на соискание ученых степеней, защищенных по результатам исследований и разработок еди- ниц Использование при выполнении ПНИ научного оборудования центров коллективного пользования научным оборудованием еди- ниц

СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ 20