Науки о жизни Соглашение на период гг. Тема: Получение бифункциональных терапевтических антител для профилактики вирусных заболеваний при мукозальном применении Федеральная целевая программа «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на годы» Получатель субсидии: Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова Руководитель проекта: Кирпичников М.П., декан биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова Цель проекта - создание эффективного, доступного и безопасного средства профилактики инфекции различными серотипами вируса гриппа А на основе бифункциональных IgG/IgA – гибридных антител к гемагглютинину, обеспечивающих направленную активацию системы врожденного иммунитета слизистых оболочек человека Основные задачи 1) конструирование системы экспрессии бифункциональных IgG/IgA-гибридных антител различного биоинженерного формата; проекта 2) получение клеточных линий-продуцентов и экспериментальных образцов бифункциональных IgG/IgA-гибридных антител ; 3) проведение иммунохимического анализа и биологических испытаний IgG/IgA-гибридных антител на клеточных и животных моделях Цели и задачи проекта Ожидаемые результаты проекта 1. Будут разработаны генетические конструкции для экспрессии бифункциональных IgG/IgA- гибридных антител различного биоинженерного формата (мономерные и димерные формы человеческого иммуноглобулина А). 2. Будут созданы клеточные линии СНО - продуценты бифункциональных IgG/IgA-гибридных антител различного биоинженерного формата. 3. Будет проведена оптимизация биосинтеза, разработаны эффективные методы выделения и очистки бифункциональных IgG/IgA-гибридных антител. 4. Будут получены 4 экспериментальных образца бифункциональных IgG/IgA-гибридных антител, проведен их биохимический и иммунохимический анализ. 5. Будут проведены биологические испытания эффективности и безопасности экспериментальных образцов бифункциональных IgG/IgA-гибридных антител на модельных животных, летально инфицированных различными коллекционными штаммами вируса гриппа А.; 6. Будет проведен отбор наиболее эффективного биоинженерного формата терапевтического антитела для мукозальной профилактики и лечения. Перспективы практического использования Иммунопрепарат на основе бифункциональных IgG/IgA- гибридных антител широкой специфичности в отношении серотипов вируса гриппа А может быть рекомендован для специфической профилактики пациентов групп риска (дети, пожилые люди, беременные женщины, люди с ослабленной иммунной системой), а также для профилактики и лечения населения в целом. Разработка препарата уменьшит затраты системы здравоохранения на получение сезонных вакцин и борьбу с возможными пандемиями. В 2017 г. планируется проведение ОТР по масштабированию процесса биосинтеза бифункциональных IgG/IgA-гибридных антител, будет получен опытный образец для проведения доклинических исследований. Доклинические исследования препарата будут осуществляться с учетом особенностей его мукозального использования. Результаты исследовательской работы, полученные в 2015 г. Партнеры проекта Разработка системы экспрессии IgG/IgA-гибридных антител Осуществлен биосинтез и клонирование константных доменов тяжелой цепи иммуноглобулина А IgA1 и IgA2m1-изотипов, а также J-цепи Для получения IgG/IgA-гибридных антител IgA1 и IgA2m1-изотипов получены двух векторная (pOpti-L и pcDNA3.3-H) и бипромоторная (легкая и тяжелая цепи антитела в одной плазмиде) система экспрессии Сравнительный анализ уровня продукции антител после трансфекции и проведения первичной селекции продемонстрировал преимущество бипромоторной системы экспрессии Рисунок 1 – Сравнительный анализ уровня продукции рекомбинантных контрольных антител IgG-изотипа в 2-х векторной и бипромоторной системе экспрессии после культивирования в селективной среде Получение клеточных линий – продуцентов IgG/IgA-гибридных антител Получены 4 линии СНО – продуценты мономеров и димеров IgA1 и IgA2, а также продуцент контрольных антител IgG-изотипа Для повышения продуктивности использовали DHFR/MTX селекцию и автоматический отбор клонов на оборудовании ClonePix FL Рисунок 2 – Схема получения клеточных линий- продуцентов 4-х бифункциональных IgG/IgA – гибридных антител. pIgA1, pIgA2, pJ – экспрессионные вектора. Иммунохимический анализ IgG/IgA- гибридных антител Экспериментальные образцы бифункциональных IgG/IgA-гибридных антител IgA1 и IgA2m1-изотипов, а также контрольный образец IgG-изотипа эффективно взаимодействуют со штаммами H1N1 и H3N2 вируса гриппа А Профиль взаимодействия IgG/IgA-гибридных антител не отличается от контрольных антител. Сродство к H1N1 выше, чем к H3N2 Наномолярная аффинность всех антител Рисунок 3 – Диаграмма кросс-реактивности IgG/IgA- гибридного антитела IgA2m1-изотипа при концентрации 0,3 мкг/мл по отношению к штаммам вируса гриппа А H1N1 и H3N2 серотипов ФГУП НПО «МИКРОГЕН» Минздрава РФ Крупнейший национальный производитель иммунобиологических препаратов: вакцин, сывороток, специфических иммуноглобулинов. Осуществляет внебюджетное финансирование в размере 16,5 млн. руб. (разработка и валидация аналитических методов контроля качества, маркетинговые исследования, разработка технических требований и по производству и эксплуатации продукции и др.) Всероссийский научный центр молекулярной диагностики и лечения Современное научно-производственное учреждение, специализирующееся на разработке новых молекулярных методов диагностики и терапии. В проекте проводит работы по выделению и иммунохимическому анализу IgG/IgA – гибридных антител. pIgA1 СНО - IgА1СНО - IgА2 pJ СНО - IgА1 мономер СНО - IgА1 димер СНО - IgА2 димер СНО - IgА2 мономер Клеточные линии - продуценты pIgA2 Индустриальный партнер Соисполнители НИИ гриппа РАМН Обладает многолетним уникальным опытом и совершенной методологией в области испытания средств профилактики и лечения гриппа. В проекте проводит работы по исследованию биологической активности и безопасности IgG/IgA – гибридных антител на клеточных моделях и животных. DHFR/MTX селекция ClonePix FL Штаммы H3N2