Одним из главных направлений, в котором генотерапия активно развивается, наряду с наследственными генетическими, инфекционными и сосудистыми заболеваниями, является онкологическая патология.

добавление гена; ингибирование гена; заместительная генная терапия; уничтожение специфических генов.

ex vivo – пораженные клетки выделяют из организма, генетически модифицируют в культуре и снова вводят в организм пациента. in vivo – в случае недоступности клеток или невозможности их эффективно культивировать используют прямое введение ДНК в клетки, находящиеся в организме.

обеспечение эффективной доставки чужеродного гена в клетки–мишени; обеспечение длительного функционирования его в этих клетках; создание условий для полноценной работы гена (его экспрессии).

ретровирусные векторные системы; аденовирусные векторы; векторы на основе аденоассоциированных вирусов (ААВ); векторы на основе вирусов герпеса; вирусные векторы направленного действия; мультифункциональные частицы на основе вирусных векторов (МФЧ).

Только вирусные векторы или генетические конструкции, включающие вирусные последовательности, способны к активной трансдукции, а в некоторых случаях – и к длительной экспрессии чужеродных генов. Из более чем 175 уже одобренных протоколов клинических испытаний по гипнотерапии более 120 предполагают использовать вирусную трансдукцию и около 100 из них основаны на применении ретровирусных векторов.

Преимущества: эффективность (может быть получен высокий титр вируса, очень высока эффективность инфекции); персистенция (стабильная интеграция делает возможной долговременную экспрессию генов). Недостатки: малая емкость (может удерживать чужеродную ДНК размером не более 8 тыс. п.н.). небезопасность (интеграция происходит случайным путем, и возникает опасность инсерционного мутагенеза).

Преимущества: эффективность (могут быть получены высокие титры); емкость (до 35 тыс. п.н. захвата чужеродной ДНК). Недостатки: персистенция (обычно наблюдается кратковременная экспрессия); небезопасность (аденовирусные векторы вызывают воспалительные реакции).

Преимущества: безопасность (вирус требует присутствия аденовируса или вируса герпеса для репликации, т.к. от природы не обладает способностью к ней; может интегрировать в строго определенное место человеческого генома, уменьшая риск инсерционного мутагенеза); персистенция (устойчивая интеграция способствует длительной экспрессии). Недостатки: малая емкость (может удерживать ДНК размером менее 5 тыс. п.н.); сложность и высокая стоимость.

Преимущества: большая емкость (точный верхний предел для встраивания чужеродной ДНК не установлен); персистенция (могут установиться пожизненные латентные инфекции в нейронах).

Концепция МФЧ направлена на то, чтобы терапевтические вирусные векторы осуществляли сразу несколько функций: выполняли адресную доставку генетического материала именно в раковые клетки; давали возможность их визуализации в организме; обладали бы прогрессирующим онколитическийм действием. Концепция МФЧ на основе вирусных векторов открывает широкие возможности применения нанотехнологий. Мониторинг вирусных частиц можно осуществлять с помощью наноразмерных меток, иммобилизованных на оболочках вирусов. Однако вопрос об адресной доставке вирусных МФЧ в клетки опухоли остается открытым.

коррекционное добавление гена; суицидная генотерапия; иммуногенотерапия; генотерапия, направленная на подавление ангиогенеза; технология «молчащих» генов (сайленсинг– генов).

Коррекционное добавление гена основано на замене мутантного гена p53 в раковых клетках геном дикого типа (не содержащим мутаций) с помощью методов гипнотерапии. Это приводит к полному восстановлению функций белка p53 и запускает апоптоз злокачественных клеток.

Суть суицидной гипнотерапии заключается в доставке в злокачественные клетки гена, кодирующего фермент, который конвертирует про лекарство в лекарство – «суицидный токсин», вызывающий гибель зараженных раковых клеток. Основной проблемой, препятствующей применению этой стратегии в клинической практике, является низкая эффективность доставки терапевтических генов.

Еще один механизм гипнотерапии злокачественных новообразований основан на индукции иммунного ответа организма, направленного на разрушение опухолей. В отличие от коррекционной замены гена и суицидной гипнотерапии иммунная генотерапия обладает теоретическим преимуществом, поскольку кроме временного воздействия на опухоль иммунной системы возможен пролонгированный противоопухолевый эффект, связанный с иммунологической памятью.

Злокачественные опухоли характеризуются усиленным ангиогенезом. Данный подход гипнотерапии нацелен на подавление формирования кровеносных сосудов в раковых опухолях. Известно несколько ингибиторов ангиогенеза (например, ангиостатин и эндостатин), вызывающих регрессию опухолей посредством подавления образования кровеносных сосудов. Опухолевый ангиогенез можно подавить также с помощью доставки в сосуды опухоли генов, продукты которых блокируют образование кровеносных сосудов.

Одна из новейших технологий в гипнотерапии рака направлена на сайленсинг (от англ. silence -молчание) генов, отвечающих за рост и деление раковых клеток. «Заглушить» гены можно, например, с помощью механизма РНК- интерференции, при котором связывание коротких двунитевых молекул РНК с регуляторной последовательностью гена- мишени вызывает остановку синтеза продукта этого гена. С помощью РНК-интерференции ученым удалось добиться сайленсинга гена, кодирующего рецептор эпидермального фактора роста (epidermal growth factor receptor EGFR), что вызвало подавление роста клеток НМРЛ

Эффективная генотерапия рака станет возможной при получении такого вектора, который мог бы онколитический воздействовать как на саму опухоль, так и на ее метастазы, находящиеся в разных тканях организма. Этим требованиям отвечают споры клостридий.

Клостридии – строго анаэробные грамположительные бактерии, имеющие палочковидную форму, способные образовывать споры при неблагоприятных условиях. Для роста всех видов клостридий необходимы анаэробные условия, но устойчивость этих бактерий к концентрации кислорода в среде варьирует от вида к виду. Внутривенное введение спор клостридий продемонстрировало значительное преимущество этого метода в лечении рака перед известными методами, поскольку их споры достаточно легко получить и хранить. Прорастание спор происходит только в том случае, если они попадают в анаэробные условия. Для лечения заболеваний человека нельзя использовать патогенные виды бактерий. Одним из первых непатогенныйх штаммов клостридий стал C. butyricum M–55, который впоследствии назвали C. oncolyticum, а затем – C. sporogene (ATCC13732). Этот штамм клостридий обладает онколитическийм действием. Противораковый эффект генетически модифицированных штаммов клостридий представлен в таблице 1.

Сахаролитические клостридии, включая штаммы C. beijerinckii ATCC17778, C. acetobutylicum DSM792 (ATCC824) или C. acetobutylicum NI4082 (реклассифицированный как C. saccharoperbutylacetonicum) и C. butyricum, непатогенный. Разработка этих штаммов для нужд гипнотерапии была профинансирована биотехнологическими компаниями. В эти штаммы вводили терапевтические гены, кодирующие TNF–α, CD и NTR, оценивали уровень продукции клостридиями рекомбинантных белков и анализировали противораковый эффект модифицированных спор. Однако тестирование C. acetobutylicum, модифицированного CD, на моделях солидных опухолей у животных не выявило значительного онколитического действия. Предположительно, низкая эффективность рекомбинантного штамма связана с недостаточной колонизацией опухолей клостридиями. Векторы на основе «супер колонизаторов» опухолей – штаммов клостридий C. sporogenes и C. novyi–NT, рекомбинантных по NTR, продемонстрировали значительный противоопухолевый эффект при их совместном использовании с про лекарством CB1954. Преимущества гипнотерапии на основе спор клостридий перед вирусной генотерапией представлены в таблице 2.

Другим перспективным направлением в лечении злокачественных новообразований является генотерапия, основанная на применении наночастиц. На ежегодной сессии Американской ассоциации анатомов 18 апреля 2009 г. группа ученых под руководством доктора Э. Чанга представила наночастицы, являющиеся сферами из молекул липидов, внутри которых находится полнофункциональная копия гена опухолевого супрессора р 53. Снаружи наночастицы покрыты антителами, специфическими к белкам, типичным для раковых клеток. Это позволяет обеспечить целевую доставку гена–онкосупрессора по кровотоку к клеткам самой опухоли и ее метастазов. В результате работы нормального гена р 53 останавливается рост опухоли. Благодаря тому, что молекулы липидов, попав внутрь клетки, просто растворяются, как любая капелька жира, такая система целевой доставки не имеет собственных побочных эффектов, чем выгодно отличается от ранее использованных для тех же целей наночастиц из материалов, не поддающихся биодеградации. В настоящее время клинические испытания проходят первую стадию. В эксперименте принимают участие 6 пациентов с различными видами рака, всего дали согласие на участие 14 человек. По утверждению д–ра Э. Чанга, уже получены многообещающие результаты. В случае успеха генная терапия онкологических заболеваний может сделать заметный шаг вперед благодаря не только большей эффективности лечения, но и достоверному снижению вероятности развития вторичных опухолей. Реальности гипнотерапии. Несмотря на значительный прогресс этого направления, быстрого успеха генная терапия не достигла: до сих пор ни одна болезнь не побеждена и до настоящего времени в клинике нет ни одного завершенного метода лечения. Терапия находится на самом начальном этапе, т.к. не решена проблема корректировки самого генома, а ее развитие пошло по пути реализации экстра хромосомной экспрессии введенных генетических конструкций.

Генотерапия злокачественных новообразований с помощью генов цитокинов, генов самоубийства клеток, генов, контролирующих апоптоз, и ряда других генетических конструкций не гарантирует полного излечения, т.к. если в результате лечения остаются единичные трансформированные клетки, то опухоль может дать рецидив.

НЦССХ им. А.Н.Бакулева и Институтом биологии гена РАН был разработан генный препарат Ангиостимулин на основе плазмидной конструкции, содержащей ген VEGF165 человека. Доклинические исследования были выполнены на модели ишемии задних конечностей крыс. Достоверный прирост количества капилляров был обнаружен исследователями через 1 месяц после внутримышечного введения суспензии плазмиды (250 мкг плазмиды на одно животное). В 2002 г. в НЦССХ им. А.Н.Бакулева было начато клиническое исследование эффективности Ангиостимулина у больных с ишемической болезнью сердца. Препарат вводили интромиокардиально в ишемизированную зону в общей дозе мкг на одно введение. У всех больных в течение 2 лет было отмечено значимое клиническое улучшение в сравнении с дооперационной картиной. В 2008 г. в ФГУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс МЗСР РФ» проведены I и IIа фазы клинического исследования препарата Корвиан у больных с критической ишемией нижних конечностей (20 человек) [8]. Корвиан представляет собой суспензию плазмиды, несущей кДНК фактора VEGF165, в физиологическом растворе (1 доза – 4 мл суспензии). Плазмида разработана в Институте экспериментальной кардиологии (ФГУ РКНПК Росздрава, Москва). В доклинических исследованиях было показано, что препарат стимулирует неоангиогенез и не токсичен. В случае получения положительных результатов испытаний I/IIa фаз планируется применение препарата при других патологиях, связанных с нарушением трофики тканей. В 2009 г. ОАО «Институт стволовых клеток человека» получило официальное разрешение Росздравнадзора на проведение клинических исследований Неоваскулгена - генно-терапевтического препарата с геном VEGF 165 для лечения критической ишемии нижних конечностей. В том же году МГУ им. М.В.Ломоносова совместно с НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН представили проект «Создание генно-терапевтических лекарственных препаратов для лечения заболеваний, обусловленных недостаточным кровоснабжением тканей и органов», рассчитанный на 3 года. В данном проекте использованы конструкции с генами шести факторов: фактор роста эндотелия сосудов (VEGF-А165), фактор роста гепатоцитов (HGF), ангиопоэтин-1, тромбоцитарный фактор роста (PDGF-BB), урокиназа, а также ген, кодирующий синтез белка нейрегулина-1 (NRG1). Выбор генов обусловлен свойствами кодируемых ими белков, которые взаимно дополняют друг друга во влиянии на ангиогенез и могут обеспечить достижение необходимых терапевтических эффектов. Авторы проекта надеются, что в результате будет создано опытно-промышленное производство по международным стандартам GMP. В рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007–2012 гг.» планируется разработка и выпуск опытных партий новых эффективных направленно-модифицированных терапевтических и диагностических средств постгеномной генерации для лечения рака легкого и пищевода. Проект объединяет крупнейшие научные центры страны: Институт молекулярной генетики РАН, Российский онкологический научный центр им. Н.Н.Блохина РАМН, Институт биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова, Новосибирский государственный университет, Институт биологии гена РАН, Институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН, а также биотехнологические компании ЗАО «Евроген» и ЗАО «Биннофарм». В рамках проекта созданы конструкции, позволяющие осуществлять специфическую экспрессию терапевтических генов в раковых клетках, а также системы доставки терапевтических генов в опухоли. В Новосибирском институте биоорганической химии разрабатываются подходы к созданию на основе олигонуклеотидов ген-направленных биологически активных веществ и терапевтических препаратов, открывающих возможность инактивации геномов инфекционных агентов и избирательного подавления экспрессии генов, ответственных за злокачественное перерождение клетки. Одним из разработчиков этой программы является академик РАН Евгений Свердлов, который 3 года назад возглавил проект по созданию первого в России противоракового препарата на основе методов генной терапии.

Актуальность проблемы обусловлена тем, что от гипнотерапии, как и любой другой методики лечения, не стоит ожидать абсолютной безопасности. Зачастую нежелательные побочные эффекты оказываются намного более значимыми, чем польза от лечения. Поэтому американское Управление по контролю пищевых продуктов и лекарственных средств (Food and Drug Administration - FDA) в 2009 г. запретило проведение многих видов гипнотерапии, если в противном случае больному не грозит скорая гибель. Существующая сегодня система контроля в США «Система разрешительных мероприятий для процедур генной терапии в Соединенных Штатах» является наиболее строгой и многоступенчатой в мире. Каждый протокол будущей процедуры сначала рассматривается комитетом по биологической безопасности данного учреждения. Если протокол одобрен, он переправляется в консультативный комитет по рекомбинантным молекулам при Национальном институте здоровья. Потом он рассматривается национальной службой, контролирующей безопасность пищевых продуктов и лекарственных веществ. После соответствующего одобрения протокол публикуется в журнале Human Gene Therapy, причем каждый протокол - это приблизительно от 30 до 50 страниц мельчайшего шрифта, где отражены все детали, все вопросы безопасности. На настоящий момент FDA не выдало ни одного разрешения на широкое клиническое применение генно-терапевтических лекарственных препаратов. При этом Национальным институтом здоровья США официально опубликованы данные о проведении почти 2 тыс. клинических исследований с использованием генно-терапевтических препаратов на уровне от первой до третьей фаз. Развитие гипнотерапии в США, а также Японии и Австралии является примером того, как регулирование идет с помощью динамичных руководств и правил, по которым готовятся протоколы и разрешаются те или иные манипуляции. Активную деятельность в обозначенной сфере проводит Европейское агентство по лекарственным средствам (European Medicines Agency - EMEA). Этим органом по контролю за качеством лекарственных средств опубликован ряд руководств и рекомендаций, касающихся генно-терапевтических препаратов, из которых следует отметить Руководство по доклиническому изучению, Руководство по клиническому мониторингу, а также еще не утвержденное Руководство по качеству, доклиническим и клиническим аспектам медицинской продукции, содержащей генетически модифицированные клетки. В отдельных странах Европы, например в Австрии, Швеции, Норвегии и Франции, уже действующие законы по генно-инженерной деятельности дополнены разделами по генной терапии. В работе Международной конференции по гармонизации требований к лекарственным препаратам (ICH) высокую активность проявляет специальная группа по гипнотерапии. В Российской Федерации регуляторные аспекты, относящиеся к изучению и применению генно-терапевтических препаратов, значительно менее развиты, чем в Европе и США. Недавно Государственная дума Российской Федерации приняла в первом чтении законопроект, устанавливающий систему безопасности генно-инженерной деятельности, которая будет включать в себя защиту от риска негативного воздействия результатов такой деятельности (лицензирование, госрегистрация и регламентация изготовления продукции, содержащей генно-инженерно-модифицированные организмы). Порядок госрегистрации генно-инженерно-модифицированных организмов, согласно законопроекту, будет утверждаться Правительством Российской Федерации. Однако к препаратам для гипнотерапии данный законопроект имеет только косвенное отношение. В настоящее время действует Федеральный закон «О государственном регулировании в области генно- инженерной деятельности» в ред. от , который дает следующее определение генной терапии: генная терапия (генотерапия) - совокупность генно-инженерных (биотехнологических) и медицинских методов, направленных на внесение изменений в генетический аппарат соматических клеток человека в целях лечения заболеваний. Ст. 5 и 6 этого закона были дополнены абзацами о безопасности клинических испытаний методов генодиагностики и генной терапии (гипнотерапии) на уровне соматических клеток и лицензировании генетических манипуляций на молекулярном, клеточном уровнях с участием рекомбинантных рибонуклеиновых и дезоксирибонуклеиновых кислот для целей генодиагностики и генной терапии (введены Федеральным законом от ФЗ). Однако в этом законе есть оговорка, что он не распространяется на работы, связанные с человеком. В связи с этим в нашей стране актуальной задачей является создание адекватной настоящему моменту законодательной базы в области гипнотерапии с учетом опыта других стран. Без выполнения этого условия проводить исследования по гипнотерапии затруднительно зарубежные партнеры с нами сотрудничать не будут.

Существующий нормативно-правовой «вакуум» в области гипнотерапии в России в начале ее становления был ей на благо, так как не становился преградой для новаторских исследований. Однако развитие и все более широкое овладение методами генной инженерии, возможность заниматься генотерапией в негосударственных структурах, общее нарастание криминальных тенденций в биомедицине настойчиво и безотлагательно требуют разработки механизмов контроля научной и клинической деятельности в области гипнотерапии.