Лаборатория эволюционной биоинформатики и теоретической генетики Институт цитологии и генетики СО РАН г.Новосибирск 2014 г. Компьютерное исследование влияния высокого давления и температуры на структуру и функцию РНК-связывающего белка семейства Nip7 архей Медведев К.Е. м.н.с. лаборатории эволюционной биоинформатики и теоретической генетики, ИЦиГ СО РАН Научный руководитель: Афонников Д.А., к.б.н., доцент, зав. лабораторией эволюционной биоинформатики и теоретической генетики, ИЦиГ СО РАН,

Давление Механизмы, обеспечивающие выживание клеток в экстремальных условиях остаются до конца не ясными. Высокая температура Высокое давление Экстремальное значение рН Экстремофилы – обитатели биотопов с экстремальными условиями внешней среды

Влияние давления на структуру белка Олигомер Мономер Частичная денатурация Полная денатурация Расплавленная глобула Давление 0,1 МПа 100 – 200 МПа > 1 ГПа 300 – 500 МПа Ключевым фактором дестабилизации белковых структур под воздействием давления является взаимодействие с растворителем – проникновение молекул воды через поры в ядро (Winter et al, 2006).

Pyrococcus furiosus Глубина 2000 м Поверхность океана Глубина<100 м Pyrococcus abyssi Глубоководный предок (1) Выявлен факт накопления радикальных замен в генах на этапе дивергенции от общего глубоководного предка (предположение о движущем отборе) 1 (2) Среди функциональных групп генов были идентифицированы гены, отвечающие за процессинг РНК 1 (3) У глубоководных организмов происходят замены аминокислот с полярных на неполярные 2 1 Gunbin et al., Afonnikov et al., 2011 В процессе дивергенции мелководных организмов от глубоководных предков: Pyrococcus: гипертермофильные археи, живущие в гидротермальных источниках.

Структура и функции белка Nip7 - Белок Nip7 вовлечён в биогенез рибосом - Участвует в процессинге 27S пре-рРНК и в образовании 60S субъединицы рибосом - Ингибирует процесс полиаденилирования РНК на экзостомах - Ингибирует процесс деградации поли-А и поли-UA участков РНК на экзостомах - Два домена: С-терминальный (PUA домен) – связывает преимущественно U- и AU-богатые участки РНК, N-терминальный – взаимодействует с экзосомой, тем самым контролируя её функционирование. β1β1 α1α1 β2β2 β3β3 β4β4 α2α2 α3α3 β5β5 β6β6 β7β7 α4α4 β8β8 α5α5 α6α6 β9β9 β10 β11 β12 N C N-терминальный доменC-терминальный домен Аминокислоты, связывающие РНК

Задачи: 1. Провести моделирование структуры белка Nip7 мелководных и глубоководных архей рода Pyrococcus при атмосферном и повышенных давлениях, комнатной и высокой температурах с помощью пакета программ GROMACS; 2. Разработать подходы для анализа основных структурных характеристик компьютерных моделей белков Nip7 глубоководных и мелководных архей с целью выявления сходства и различий динамического поведения структур этих белков при разных параметрах температуры и давления на основе многофакторного дисперсионного анализа; 3. На основе анализа результатов моделирования выявить различия во флуктуациях доменов белка Nip7, охарактеризовать наиболее подвижные участки и выдвинуть предположение об их функции; 4. Провести поиск специфичных позиций в последовательностях семейства белков Nip7 архей, к таким параметрам среды местообитания как высокая температура и давление; 5. На основе результатов компьютерного анализа сформулировать гипотезу о возможных механизмах адаптации белков Nip7 к экстремальным условиям высоких давлений и температур Цели и задачи исследования: Цель: изучение влияния высокого давления и температуры на пространственную структуру белка Nip7, участвующего в процессинге РНК у архей методами молекулярной динамики и сравнительного анализа последовательностей и структур

1. Результаты компьютерного моделирования белков Nip7 P.abyssi и P.furiosus согласуются с известными данными о влиянии повышенных температур и давлений на структуру белка, что свидетельствует об их адекватности. 2. Аминокислотные последовательности гомологов белка Nip7 у архей содержат замены, которые в процессе эволюции происходят специфическим образом по отношению к температуре и глубине мест обитания организмов. 3. Механизмы адаптации белков Nip7 к экстремальным условиям высоких давлений и температур основаны на устойчивости и количестве солевых мостиков в структуре белка, а также на мутациях в позициях специфичных к давлению и температуре. Положения выносимые на защиту:

В белке Nip7 P. furiosus наблюдается высокая доля радикальных замен по сравнению с белком P. abyssi. Большинство из них являются заменами с полярной аминокислоты на гидрофобную, с заряженной на незаряженную полярную и смена знака заряда. Полярные/заряженные Гидрофобные (7 замен) Заряженные незаряженные полярные (5 замен) Смена знака заряда (4 замены) Гидрофобные полярные/заряженные (1 замена) Незаряженные полярные заряженные (1 замена) Сравнение последовательностей белков Nip7 P.furiosus и P.abyssi Всего 47 замен

Модели белка Nip7 P.abyssi : NIP7-ABY (PDB 2P38:A) Nip7 P.furiosus: NIP7-FUR (ModBASE Q8TZP7) Моделирование программой GROMACS траекторий 40 нс при значениях давления 0.1, 50 и 100 MПa и температуры 300, 373 K. Для каждой пары значений рассчитывалось по 5 независимых траекторий. NIP7-FUR NIP7-ABY Время моделирования, нс RMSD (Å) При сравнении с кристаллической структурой белка Nip7 P. abyssi 2p38:A средние значения RMSD по траекториям не превышали 1,94Å (NIP7-ABY ) и 2,41Å (NIP7-FUR) что свидетельствовало об устойчивости полученных моделей Время моделирования, нс Моделирование молекулярной динамики белка Nip7 и анализ результатов Зависимость среднеквадратичного отклонения (RMSD) Сα атомов моделей от начальной структуры в процессе моделирования RMSD (Å)

Двухфакторный дисперсионный анализ Многофакторный анализ зависимости структурных параметров белка от параметров внешней среды и типа белка Давление Температура PT 0,1 МПа 300 К 373 К 50 МПа 300 К 373 К 100 МПа 300 К 373 К Значимость влияния давления и температуры на структуру модели Давление Температура NIP7-ABYNIP7-FUR Трехфакторный дисперсионный анализ 0,1 МПа 50 МПа 100 МПа Давление 300 К 373 К NIP7-ABY NIP7-FUR Зависимость влияния давления и температуры на структуру модели от аминокислотных замен

Rg (Å) 0, Давление, MПa Анализ основных структурных характеристик белковой глобулы : радиус гирации (Rg), поверхность доступная растворителю (SAS) (1) Rg меньше для высоких давлений и температур для обеих моделей (2) Гидрофобная SAS больше у NIP7-FUR, полярная SAS меньше SAS, общая (Å 2 ) 0, Давление, MПa SAS, гидрофильная (Å 2 ) 0, Давление, MПa SAS, гидрофобная (Å 2 ) 0, Давление, MПa Значение F-статистики для SASh ФакторыNIP7-ABYNIP7-FUR Давление, P2, , Температура,T5, , Взаимодействие, PxT1, , Значение F-статистики для SASp ФакторыNIP7-ABYNIP7-FUR Давление, P0, ,03738 Температура,T0, ,27042 Взаимодействие, PxT2, , Значение F-статистики для SASt ФакторыNIP7-ABYNIP7-FUR Давление, P0, , Температура,T1, , Взаимодействие, PxT4, , Значение F-статистики для Rg ФакторыNIP7-ABYNIP7-FUR Давление, P0, , Температура,T0, , Взаимодействие, PxT0, ,063274

Конформации полипептидной цепи для модели NIP7-ABY при разных температурах и давлениях NIP7-ABY 0.1 MПa 300K NIP7-ABY 0.1 MПa 373K NIP7-ABY 300 MПa 373K NIP7-ABY 300 MПa 300K (1) С увеличением температуры флуктуации увеличиваются (2) С увеличением давления флуктуации уменьшаются Увеличение давления Увеличение температуры

Спираль α2 Спираль α3 Анализ района α2-α3 белка Nip7 (1) Наиболее подвижный район и наиболее вариабельный по вторичной структуре в N-терминальном домене (2) Высокая вероятность белок-белкового взаимодействия => функционально важный район · ǀ ···· ǀ ···· ǀ ···· ǀ ···· ǀ ···· ǀ ···· ǀ ···· ǀ ···· ǀ · P.Abyssi FCVVEGKYRDVYAVNEEVWKIIEDINMRPYSLGTFVGTIRVDE P.Abyssi EEEEESSSEEEEE**HHHHHHTTTS***GGGT*EEEEEEEE*T 0,1_300 EEEEESSSEEEEE**HHHHHHTTTS***GGGS*EEEEEEEE*T 0,1_373 EEEEESSSEEEEE**HHHHTTTTTS***GGGS*EEEEEEEE*T 50_300 EEEEESSSEEEEE**HHHHTTTTTS***GGGS*EEEEEEEE*T 50_373 EEEEESSSEEEEE**HHHHTTTTTS***GGGS*EEEEEEEE*T 100_300 EEEEESSSEEEEE**HHHHHHTTT****GGGS*EEEEEEEE*T 100_373 EEEEESSSEEEEE**HHHHTTTTTS***GGGS*EEEEEEEE*T · ǀ ···· ǀ ···· ǀ ···· ǀ ···· ǀ ···· ǀ ···· ǀ ···· ǀ ···· ǀ · P.FuriosusFAIVEGKYRDVYAVNNEVWKIIEDLTVRPFALGTFVGMIKVDE P.FuriosusEEEEESSSEEEEE**HHHHHHHHHS***GGGT*EEEEEEEE*T 0,1_300 EEEEESSSEEEEE**HHHHHHTTTS***GGGS*EEEEEEEE*T 0,1_373 EEEEESSSEEEEE**HHHHTTTTTS****GGT*EEEEEEEE*T 50_300 EEEEESSSEEEEE**HHHHHHTTTS***GGGS*EEEEEEEE*T 50_373 EEEEESSSEEEEE**HHHHTTTTTS***GGG*SEEEEEEEE*T 100_300 EEEEESSSEEEEE**HHHHHHTTTS***GGGS*EEEEEEEE*T 100_373 EEEEESSSEEEEE**HHHHTTTTTS***GGG**EEEEEEEE*T α2α2 α3α3 Красным цветом отмечены спирали α2 и α3. Сиреневым – аминокислоты, для которых вероятность участия в белок-белковых взаимодействиях > 50% по результатам работы сервера SPPIDER (

Чувствительность параметра RMSF моделей NIP7-ABY/NIP7-FUR к температуре и давлению Чувствительность к давлению Среднее(RMSF i при P 50) Среднее(RMSF i при P=0.1) Spi= Spi=1 означает, что флуктуации остатка i не подвержены влиянию повышения давления Треугольными маркерами указаны значимые различия по результатам двухфакторного дисперсионного анализа Температура значимо влияет на флуктуации для 151 остатка NIP7-ABY и для 154 остатков NIP7-FUR Давление значимо влияет на флуктуации для 10 остатков NIP7-ABY и для 32 остатков NIP7-FUR

Сравнение флуктуаций N- и С-терминальных доменов белка Nip7 В C-терминальном домене наблюдаются большие флуктуации, чем в N-терминальном Значение RMSF для двух доменов белка Nip7 NIP7-ABY 300K373K NCNC 0,1 MПa0,86 Å0,92 Å1,17 Å1,25 Å 50 MПa0,86 Å0,95 Å1,12 Å1,17 Å 100 MПa0,80 Å0,93 Å1,06 Å1,18 Å Значение F-статистики для RMSF доменов белка Nip7 Факторы NIP7-ABYNIP7-FUR 300K373K300K373K Давление, P0, ,274234, , Тип домена, D7, ,036115, ,91932 Взаимодействие, PxD0, , , , С-терминальный домен N-терминальный домен (1) С увеличением температуры флуктуации увеличиваются (2) С увеличением давления флуктуации уменьшаются Возможно, большая подвижность С-терминального домена связана с его функцией – неспецифическим связыванием U- и AU- богатых участков РНК.

E75 E10 R37 E33 R2 E51 R5 R4 Крупнейшая сеть солевых мостиков в модели NIP7-ABY, которая стабилизирует N-терминальный домен. Анализ устойчивости солевых мостиков в моделях NIP7-ABY и NIP7-FUR Солевые мостики были разделены на устойчивые (присутствуют в более чем 70% структур) среднеустойчивые (между 70 и 20%) и неустойчивые (менее чем в 20%). Общее количество устойчивых и среднеустойчивых солевых мостиков: NIP7- ABY – 20, NIP7-FUR – 13. В модели NIP7-FUR (мелководный организм) эта сеть значительно меньше из- за замены – ARG2-ILE2 => два солевых мостика не могут быть сформированы. Единственная междоменная сеть модели NIP7-ABY. NIP7-FUR (мелководный организм) не имеет этой сети из-за аминокислотных замен. Единственная сеть, которая состоит только из РНК связывающих остатков. Эта сеть стабилизирует C-терминальный домен и активный центр белка Nip7. K91E90K88E23 K151R148D109

Анализ устойчивости солевых мостиков в моделях NIP7-ABY и NIP7-FUR Мостик НаличиеРасположениеP.abyssiP.furiosus STST F(T)SpSp F(P)STST F(T)SpSp F(P) 10-4 всеα 1 - α 1 0,942,741,040,830,9911, всеβ 6 - β 4 1,060,521,110,910,991,891,000, всеβ 4 - α 1 1,040,161,140,991,182,870,884, все РНК связывающий - РНК связывающий 0,950,401,090,45 нннн 33-4 всеβ 3 - β 1 0,920,590,940,690,980,101,000, всеα 1 - α 1 0,922,651,020,130,892,960,980, P.a.&P.f.α 1 - α 1 1,143,770,911,681,081,600,892, P.a.&P.f. РНК связывающий - РНК связывающий; α 6 0,980,020,723,18 нннн 33-22p38&P.a.β 3 - N-конец 0,980,010,992, всеC-конец - β 9 1,9312,230,940,490,980,720,990, P.a.&P.f.α2 - β11,251,501,030,030,881,111,180, P.a.&P.f.β6 - N-конец 1,206,590,843,420,838,190,951, P.a. РНК связывающий - C-конец 1,844,120,950, P.a.&P.f.α 2 - α 2 1,060,140,921,420,990,000,881, P.a.β 7 - β 2 1,265,910,871, все РНК связывающий; β 12 - РНК связывающий 0,930,090,751,490,862,740,920, P.a.β 9 - β 9 0,980,041,262, p38&P.a.α 2 - α 2 0,990,000,980, всеC-конец - α 5 нннн 1,010,001,110, P.a.&P.f.β 6 - α 1 нннн 0,831,070,950,56 Происходит стабилизация структуры с помощью солевых мостиков при повышении P и Т

Поиск мутаций, связанных с адаптацией к экстремальным условиям в белках Nip7 архей - Глубоководный организм - Мелководный организм - Термофильный организм - Мезофильный организм Анализ филогении показывает, что представители одного и того же рода обитают, преимущественно, в схожих условиях. В отношении к термофильности эта тенденция выражена в большей степени, чем в отношении глубин местообитаний. 35 организмов Четыре физиологических фенотипа: Глубоководные Мелководные

Позиции специфичные к давлению Позиции специфичные к температуре Поиск позиций специфичных к температуре и давлению (SDP) Позиции считались специфическими по отношению к температуре/давлению, если: А) Z-статистика метода multi-Relief был меньше -3 Б) Индекс специфичности GroupSim был больше 0,7 Выявлено двумя методами одновременно: Позиции специфичные к давлению и температуре - 17 позиций Позиции специфичные только к температуре - 47 позиций Число позиций специфичных к температуре является более сильным эволюционным фактором, чем давление при тех условиях, при которых живут рассматриваемые организмы.

Позиции специфичные к давлению (желтый цвет) Позиции специфичные к температуре (красный цвет) Возможный регион связывания с экзосомой Меньшее число SDP позиций; расположены в возможном регионе связывания с экзосомой; возможная роль: стабилизация белок-белковых взаимодействий Большее число SDP позиций; расположены в структурных элементах; возможная роль: стабилизация структуры. Эффект влияния температуры больше. Поиск позиций специфичных к температуре и давлению (SDP) Зеленый цвет - остатки для которых вероятность участия в белок- белковых взаимодействиях > 50% Синий цвет – остатки специфичные к давлению, для которых вероятность участия в белок-белковых взаимодействиях > 50% Зеленый цвет - остатки для которых вероятность участия в белок- белковых взаимодействиях > 50% Синий цвет – остатки специфичные к температуре, для которых вероятность участия в белок- белковых взаимодействиях > 50%

23 SDP в значимых позициях 6 SDP в значимых позициях Влияние типа белка на динамику белковой структуры Повышение температуры значимо влияет на увеличение RMSF для всех без исключения аминокислотных остатков белка NIP7. Давление значимо влияет на изменение RMSF у 26 аминокислотных остатков (16%). Тип модели влияет на изменение флуктуаций для 56 (36%) аминокислотных остатков.

Выводы 1. Проведенный анализ молекулярной динамики моделей белков Nip7 P.abyssi и P.furiosus продемонстрировал устойчивость их структур в пределах гидростатических давлений от 0.1 до 100 МПа при температурах 300 и 373 К. Анализ также показал, что повышение температуры приводит к увеличению флуктуаций, а увеличение давления приводит к их снижению. 2. Предложен подход для оценки влияния нескольких факторов внешней среды, а также аминокислотных замен в белках, на структурные параметры их компьютерных моделей на основе многофакторного дисперсионного анализа.

Выводы 3. Анализ результатов моделирования белков Nip7 P.abyssi и P.furiosus с помощью предложенного подхода показал, что флуктуации полипептидной цепи у С-терминального (РНК-связывающего) домена белка больше, чем у чем N-терминального, в силу стабилизации последнего за счет сети солевых мостиков. На основе анализа молекулярной динамики охарактеризован район α 2 -α 3 (позиции 49-58) белка Nip7, как наиболее подвижный участок N- терминального домена, функция которого может быть связана с белок- белковыми взаимодействиями. 4. На основе анализа гомологичных последовательностей белка Nip7 архей, выявлены позиции, замены в которых происходят специфическим образом по отношению к температуре и давлениям в местообитаниях этих организмов. 5. На основе результатов компьютерного анализа выдвинуто предположение о важной роли солевых мостиков и аминокислотных замен в позициях специфичных к температуре и давлению в возможном механизме адаптации белков Nip7 к экстремальным условиям.

Спасибо за внимание!

Публикации Публикации: 1. Медведев К.Е., Афонников Д.А., Воробьев Ю.Н. Изучение методами молекулярной динамики структур белков NIP7 глубоководных и мелководных архей в условиях повышенного давления // Вестник Томского государственного университета. Биология 4 (16), с 136, Афонников Д.А., Медведев К.Е., Гунбин К.В., Колчанов Н.А. Важная роль гидрофобных взаимодействий при адаптации белков к высоким давлениям // Доклады Академии Наук 438(3):412– 415, Медведев К.Е., Афонников Д.А. Анализ структур белков архей-пьезофилов под влиянием высокого давления с помощью компьютерных методов // Труды Томского государственного университета, сер. Биологическая. Т. 275, С , Kirill E. Medvedev, Nikolay A. Alemasov, Yuri N. Vorobjev, Elena V. Boldyreva, Nikolay A. Kolchanov, Dmitry A. Afonnikov. Molecular dynamics simulations of the Nip7 proteins from the marine deep- and shallow-water Pyrococcus species // BMC Structural Biology 2014 (отправлена в печать).

Тезисы на конференциях 1. XLVIII Международная студенческая конференция «Студент и научно-технический прогресс», Новосибирск, 10 – 14 апреля 2010 г., с.4, устный доклад 2. Первая Всероссийская молодёжная научная конференция, посвящённая 125-летию биологических исследований в Томском государственном университете «Фундаментальные и прикладные аспекты современной биологии», Томск, 6 – 9 октября 2010 г., с.132, устный доклад. 3.Русско-Индийский семинар "Предсказательная биология, интегративный анализ и методы", ноября 2010 г., Чандигар, Индия, с. 8-9, устный доклад. 4. Международная Московская Конференция Вычислительной Молекулярной Биологии (MCCMB- 11), Москва, 2011 г., с , постер. 5. Третья школа молодых ученых "Биоинформатика и системная биология", Новосибирск, 2011 г., устный доклад. 6. II международная научно практическая конференция Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине: геномика, протеомика, биоинформатика, ноября 2011, Новосибирск, c. 175, постер. 7. II международная научно практическая конференция Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине: геномика, протеомика, биоинформатика, ноября 2011, Новосибирск, c. 114, устный доклад.

8. Восьмая Международная Конференция по Биоинформатике Регуляции Генома и Структурной/Системной Биологии (BGRS/SB2012), Новосибирск, 2012 г., с. 203, постер. 9. IV Международная конференция «Математическая биология и биоинформатика» (ICMBB-2012), Пущино, 2012 г., с , устный доклад. 10. Пятая Международная школа молодых ученых «Системная Биология и Биоинформатика» (SBB- 2013), Новосибирск, 2013 г., с. 34, устный доклад. 11. Международная Московская Конференция Вычислительной Молекулярной Биологии (MCCMB- 2013), Москва, 2013 г., постер. 12. Девятая Международная Конференция по Биоинформатике Регуляции Генома и Структурной/Системной Биологии (BGRS\SB-2014), Новосибирск, 2014 г., с. 105, устный доклад. Тезисы на конференциях

Методы GROMACS (Van der Spoel et al, 2005): - Минимизация энергии в вакууме. - Ячейка моделирования с ребром 20 нм, содержащая молекулы воды модели SPCE. - Уравновешение зарядов. - Минимизации энергии с растворителем (2 000 шагов). - При температуре 300 K делалось два подготовительных этапа при заданных значениях давления/температуры по 200 пс каждый с постепенным снятием ограничений; при температуре 373 K, количество подготовительных этапов – девять, с постепенным увеличением температуры на 8К на каждом этапе. Давление в системе было заданно постоянное. - Алгоритм LINCS - Поле amber99sb-ildn (Berhanu and Hansmann, 2012). - Электростатические взаимодействия - Partial Mesh Ewald (PME) - Продолжительность моделирования 40 нс.