СРС НА ТЕМУ : МЕТОДЫ МИКРОСКОПИИ. ПРОСТЫЕ И СЛОЖНЫЕ МЕТОДЫ ОКРАСКИ. ПОДГОТОВИЛА: КАСЫМОВА Д. ГРУППА: 205 «Б» ФР Южно-Казахстанская государственная фармацевтическая академия. Кафедра биохимии, биологии и микробиологии

П ЛАН : Введение 1. Устройство светового микроскопа. 2. Иммерсионная микроскопиия. 3. Темнопольная микроскопиия. 4. Фазова – контрастная микроскопиия. 5. Люминесцентная микроскопиия. 6. Электронная микроскопиия. Заключение Список использованной литературы

В ВЕДЕНИЕ Микроскопические методы исследования - способы изучения различных объектов с помощью микроскопа. В биологии и медицине эти методы позволяют изучать строение микроскопиических объектов, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности глаза человека. Основу микроскопиических методов исследования (М.м.и.) составляет световая и электронная микроскопиия. В практической и научной деятельности врачи различных специальностей вирусологи, микробиологи, цитологи, морфологи, гематологи и др. помимо обычной световой микроскопиии используют фазово-контрастную, интерференционную, люминесцентную, поляризационную, стереоскопическую, ультрафиолетовую, инфракрасную микроскопиию. В основе этих методов лежат различные свойства света.

С ВЕТОВАЯ МИКРОСКОПИЯ Для обнаружения и исследования микроорганизмов применяют микроскопы. Световые микроскопы предназначены для изучения микроорганизмов, которые имеют размеры не менее 0,2 мкм (бактерии, простейшие и т. п.) a электронные для изучения более мелких микроорганизмов (вирусы) и мельчайших структур бактерий. Современные световые микроскопы - это сложные оптические приборы, обращение с которыми требует определенных знаний, навыков и большой аккуратности. Световые микроскопы подразделяются на студенческие, рабочие, лабораторные и исследовательские, различающиеся по конструкции и комплектации оптикой. Отечественные микроскопы (Биолам", "Бимам", "Микмед") имеют обозначения, указывающие, к какой группе они относятся (С - студенческие, Р - рабочие, Л - лабораторные, И - исследовательские), комплектация обозначается цифрой.

В ИДЫ СВЕТОВЫХ МИКРОСКОПОВ

В микроскопе различают механическую и оптическую части. К механической части относятся: штатив (состоящий из основания и тубусодержателя) и укрепленные на нем тубус с револьвером для крепления и смены объективов, предметный столик для препарата, приспособления для крепления конденсора и светофильтров, а также встроенные в штатив механизмы для грубого (макро механизм, макро винт) и тонкого (микро механизм, микровинт) перемещения предметного столика или тубусодержателя. Оптическая часть микроскопа представлена объективами, окулярами и осветительной системой, которая в свою очередь состоит из расположенных под предметным столиком конденсора Аббе, зеркала, имеющего плоскую и вогнутую сторону, а также отдельного или встроенного осветителя. Объективы ввинчиваются в револьвер, а соответствующий окуляр, через который наблюдают изображение, устанавливают с противоположной стороны тубуса. Различают монокулярный (имеющий один окуляр) и бинокулярный (имеющий два одинаковых окуляра) тубусы.

П РИНЦИПИАЛЬНАЯ СХЕМА МИКРОСКОПА И ОСВЕТИТЕЛЬНОЙ СИСТЕМЫ 1. Источник света; 2. Коллектор; 3. Ирисовая полевая диафрагма; 4. Зеркало; 5. Ирисовая апертурная диафрагма; 6. Конденбсор; 7. Препарат; 7'. Увеличенное действительное промежуточное изображение препарата, образуемое ; объективом; 7''. Увеличенное мнимое окончательное изображение препарата, наблюдаемое в окуляре; 8. Объектив; 9. выходной значок объектива; 10. Полевая диафрагма окуляра; 11. Окуляр; 12. Глаз.

Различают полезное и бесполезное увеличение. Полезное увеличение обычно равно числовой апертуре объектива, увеличенной в раз. Более высокое окулярное увеличение не выявляет новых деталей и является бесполезным. В зависимости от среды, которая находится между объективом и препаратом, различают «сухие» объективы малого и среднего увеличения (до 40 х) и иммерсионные с максимальной апертурой и увеличением (90100 х). «Сухой» объектив - это такой объектив, между фронтальной линзой которого и препаратом, находится воздух.

Темнопольная микроскопиия основана на способности микроорганизмов сильно рассеивать свет. Для темнопольной микроскопии пользуются обычными объективами и специальными темнопольными параболоид-конденсорами, центральная часть которых затемнена, так что прямые лучи от осветителя в объектив микроскопа не попадают. В объектив попадают только те лучи, которые отклоняются частицами препарата. Поэтому в темнопольном микроскопе микроорганизмы видны бесцветными на темном фоне. Метод темнопольной микроскопиии используется для изучения живых бактерий и их подвижности. При помощи этого метода могут быть обнаружены мельчайшие микроорганизмы, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности микроскопа. С помощью темнопольной микроскопиии изучают нативные препараты типа "раздавленной" или "висячей капли".

Э ЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ ПРИ БОЛЕЗНИ МИНИМАЛЬНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ, МЕМБРАНОЗНОЙ НЕФРОПАТИИ И МЕЗАНГИОКАПИЛЛЯРНОМ ГЛОМЕРУЛОНЕФРИТЕ

М ЕТОДЫ ОКРАСКИ. Окраску мазка производят простыми или сложными методами. Простые заключаются в окраске препарата одним красителем; сложные методы (по Граму, Цилю Нильсену и др.) включают последовательное использование нескольких красителей и имеют дифференциально-диагностическое значение. Отношение микроорганизмов к красителям расценивают как тинкториальные свойства. Существуют специальные методы окраски, которые используют для выявления жгутиков, клеточной стенки, нуклеоида и разных цитоплазматических включений.

При простых методах мазок окрашивают каким-либо одним красителем, используя красители анилинового ряда (основные или кислые). Если красящий ион (хромофор) катион, то краситель обладает основными свойствами, если хромофор - анион, то краситель имеет кислые свойства. Кислые красители эритрозин, кислый фуксин, эозин. Основные красители генциановый фиолетовый, кристаллический фиолетовый, метиленовый синий, основной фуксин. Преимущественно для окраски микроорганизмов используют основные красители, которые более интенсивно связываются кислыми компонентами клетки. Из сухих красителей, продающихся в виде порошков, готовят насыщенные спиртовые растворы, а из них водно- спиртовые, которые и служат для окрашивания микробных клеток. Микроорганизмы окрашивают, наливая краситель на поверхность мазка на определенное время. Окраску основным фуксином ведут в течение 2 мин, метиленовым синим 57 мин. Затем мазок промывают водой до тех пор, пока стекающие струи воды не станут бесцветными, высушивают осторожным промоканием фильтровальной бумагой и микроскопиируют в иммерсионной системе. Если мазок правильно окрашен и промыт, то поле зрения совершенно прозрачно, а клетки интенсивно окрашены

Сложные методы окраски применяют для изучения структуры клетки и дифференциации микроорганизмов. Окрашенные мазки микроскопиируют в иммерсионной системе. Последовательно нанести на препарат определенные красители, различающиеся по химическому составу и цвету, протравы, спирты, кислоту и др. Существуют несколько основных окрасок: по Граму, по Цилю-Нельсону, по Ауески, Нейссера, Бури-Гинса. Сложные методы окраски применяют для изучения структуры клетки и дифференциации микроорганизмов. Окрашенные мазки микроскопиируют в иммерсионной системе. Последовательно нанести на препарат определенные красители, различающиеся по химическому составу и цвету, протравы, спирты, кислоту и др. Существуют несколько основных окрасок: по Граму, по Цилю-Нельсону, по Ауески, Нейссера, Бури-Гинса.

М ЕХАНИЗМ И ЭТАПЫ ОКРАСКИ ПО Г РАМУ 1. На фиксированный мазок нанести карболовойй-спиртовой раствор генцианового фиолетового через полоску фильтровальной бумаги. Через 1-2 мин снять ее, а краситель слить. 2. Нанести раствор люголя на 1-2 мин (йод) 3. Обесцветить этиловым спиртом в течении с до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя. 4. Промыть водой 5. Докрасить водным р-ом фуксина в течении 1-2 мин, промыть водой, высушить и микроскопиировать. * Грамположительные бактерии окрашиваются в темно- фиолетовый цвет, грамотрицательные - в красный. Механизм и этапы окраски по Цилю-Нельсону 1. На фиксированный мазок нанести карболовый р-р фуксина через полоску фильтровальной бумаги и подогреть до появления паров в течении 3-5 мин 2. Снять бумагу, провыть мазок водой 3. Нанести 5% р-р серной кислоты или 3% р-р смеси спирта с хлороводородной кислотой на 1-2 мин для обесцвечивания. 4. Промыть водой 5. Докрасить мазок водным р-ом метиленового синего в течении 3- 5 мин 6. Промыть водой, высушить и микроскопиировать 1. На фиксированный мазок нанести карболовойй-спиртовой раствор генцианового фиолетового через полоску фильтровальной бумаги. Через 1-2 мин снять ее, а краситель слить. 2. Нанести раствор люголя на 1-2 мин (йод) 3. Обесцветить этиловым спиртом в течении с до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя. 4. Промыть водой 5. Докрасить водным р-ом фуксина в течении 1-2 мин, промыть водой, высушить и микроскопиировать. * Грамположительные бактерии окрашиваются в темно- фиолетовый цвет, грамотрицательные - в красный. Механизм и этапы окраски по Цилю-Нельсону 1. На фиксированный мазок нанести карболовый р-р фуксина через полоску фильтровальной бумаги и подогреть до появления паров в течении 3-5 мин 2. Снять бумагу, провыть мазок водой 3. Нанести 5% р-р серной кислоты или 3% р-р смеси спирта с хлороводородной кислотой на 1-2 мин для обесцвечивания. 4. Промыть водой 5. Докрасить мазок водным р-ом метиленового синего в течении 3- 5 мин 6. Промыть водой, высушить и микроскопиировать

З АКЛЮЧЕНИЕ Для световой микроскопиии и основанных на ней других М.м.и. определяющее значение помимо разрешающей способности микроскопа имеет характер и направленность светового луча, а также особенности изучаемого объекта, который может быть прозрачным и непрозрачным. В зависимости от свойств объекта изменяются физические свойства света - его цвет и яркость, связанные с длиной и амплитудой волны, фаза, плоскость и направление распространения волны. На использовании этих свойств света и строятся различные М. м. и. Для световой микроскопиии биологические. объекты обычно окрашивают с целью выявления тех или иных их свойств. При этом ткани должны быть фиксированы, т. к. окраска выявляет определенные структуры только убитых клеток.

С ПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ !