Московский Государственный Университет имени М. В. Ломоносова Химический факультет Кафедра химии природных соединений Лаборатория им. О.А. Донцовой Матвеев Андрей Максимович Курсовая работа: Поиск новых антибиотиков, замедляющих трансляцию, в культуральных жидкостях почвенных микроорганизмов. Научный руководитель: к.х.н. Остерман И. А. Москва 2015

Доля устойчивых штаммов, % Число новых антибиотиков, введённых в практику

Александр Флеминг обнаружил антибактериальную активность пенициллиновых грибов в 1928 году. (Лекарство создано в 1944) Резистентность к антибиотикам это причина поиска новых действующих веществ.

Модификация существующих антибиотиков Общеклеточный скрининг Культуральных жидкостей Библиотек органических соединений

Недостатки стандартного способа проверки антибактериальной активности (измерения уровня ингибирования клеточного роста): 1. невозможно определить механизм действия антибиотика 2. необходимы большие концентрации антибиотика, чтобы увидеть заметное снижение роста Недостатки прочих методов для определения механизма: большинство из них требует in vitro экспериментов и слишком сложны для широкомасштабного поиска.

Механизмы действия антибиотиков на рибосому могу быть различными: Вызывание ошибок в ходе синтеза белка Замедление скорости трансляции Блокирование рибосомы на различных стадиях её функционального цикла

Готовая плазмида обладает следующими характеристиками: содержит ген устойчивости к ампициллину (Ампициллин был выбран, так как он не затрагивает работу рибосомы.); использует в качестве флуоресцентных белков следующие: Red Fluorescence protein (RFP) (красный флуоресцентный белок) и Cerulean (CER) (зелёный флуоресцентный белок). (Среди всех флуоресцентных белков эти два были выбраны так, чтобы их спектры поглощения и испускания практически не перекрывались между собой, и таким образом уровни их экспрессии можно было бы детектировать независимо.)

Использование двойной репортёр ной системы для анализа механизма действия антибиотиков на чашках с агаром.

Анализ наличия соединений, замедляющих синтез белка в культуральных жидкостях почвенных микроорганизмов. Контрольные антибиотики: Левофлаксацин Эритромицин Антибиотики, воздействующие на синтез белка Антибиотик, НЕ воздействующий на синтез белка

In vitro трансляция.

In vitro проверка эффективности экстракта 654.

С использованием метода определения механизма действия антибиотиков была детектирована антибактериальная активность, замедляющая трансляцию, культуральной жидкости у образцов 126, 578, 592 и 654. Для образца 654 получено подтверждение ингибирования трансляции в системе in vitro.

1) Трансформация компетентных клеток E. coli. Пробирку с компетентными клетками размораживали во льду, добавляли 1–5 мкл раствора плазмидной ДНК (~ 0,01 мкг) в буферном растворе EB (Qiagen) или в дистиллированной воде, инкубировали 30 мин при 0 С. Затем прогревали смесь в течение 40–50 секунд при 42 С, охлаждали до 0 С, добавляли 800 мкл среды LB и инкубировали 1 час при 37 С при постоянном вращении 200 об/мин. Аликвоту 100–200 мкл трансформационной смеси высевали на чашку Петри с твёрдой средой LB, содержавшей ампициллин. Инкубировали чашку при 37 С 16 ч при постоянном вращении 200 об/мин. 2) Приготовление ночной культуры. Добавляли одну колонию с чашки с трансформированными клетками в 2 мл среды LB с ампициллином. Ставили в термостат на 16 часов на 37 С при постоянном вращении 200 об/мин. 3) Использование двойной репортёр ной системы для анализа механизма действия антибиотиков на чашках с агаром. Ночную культуру штамма ΔtolC, трансформированных плазмидами pRFPCER-TrpL2A, разбавляли в два раза свежей средой LB и выливали на чашки с агаром, средой LB и ампициллином (50 мкг/мл). Затем на поверхность высохших чашек делали углубления диаметром 5 мм, потом наносили образцы (50 мкл экстрактов, (ery) эритромицин 50 мкл раствора 0,1 мг/мл, (lev) левофлаксацин 50 мкл 0.1 мкг/мл). После культивирования в течение ночи при 37 С при постоянном вращении 200 об/мин полученные чашки документировались при помощи цифровой камеры при освещении их ультрафиолетом (254 нм). 4) In vitro трансляция. Для in vitro трансляции использовали мРНК люциферазы сверчка, S30 экстракт E. coli. Активность синтезированной люциферазы определяли через 10 минут.

1) Boucher H.W., Talbot G.H., Bradley J.S. et al. Bad bugs, no drugs: no ESKAPE! // Clin. Infect. Dis V. 48. P. 1–12. 2) Остерман И. А. Новая система для широкомасштабного анализа сайтов инициации и реинициации трансляции Escherichia coli. Дис….канд. хим. наук. Москва: МГУ им. М. В. Ломоносова, с. 3) Overbye K.M., Barrett J.F. Today Antibiotics: where did we go wrong? // Drug Discov V. 10. P. 45–52. 4) Bax R.P., Anderson R., Crew J. et al. Antibiotic resistance–what can we do? // Nat. Med V. 4. P. 545–546. 5) Coates A.,Yanmin H., Bax R. et al. The future challenges facing the development of new antimicrobial drugs // Nat. Rev. Drug Discov V. 1. P. 895–910. 6) Osterman I.A., Prokhorova I.V., Sysoev V.O., Boykova YV, Efremenkova O.V., Svetlov M.S., Kolb V.A., Bogdanov A.A., Sergiev P.V., and Dontsova O.A. Attenuation-based dual-fluorescent- protein reporter for screening translation inhibitors. // Antimicrob Agents Chemother , 4, p ) Svetlov, M.S., A. Kommer, V.A. Kolb, and A.S. Spirin, Effective cotranslational folding of firefly luciferase without chaperones of the Hsp70 family. Protein Sci, (2): p Изображения взяты из Яндекс Картинки и Википедии. Источники: