Подготовили: Гапанюк Анастасия Солохина Евгения Научный руководитель: К.б.н., доцент Мезен Нина Иосифовна УО «Белорусский государственный медицинский университет»

Цель : ознакомиться с понятиями «геномика» и «протеомика». Определить роль этих отраслей в диагностике и лечении заболеваний, использование их в современной фармации.

Геном (от греч. gen(os)- род, рождение и лат. –om(a) – совокупность) – совокупность всех генов организма. Геномика – раздел молекулярной генетики, посвящённый изучению генома и генов живых организмов. Протеома (от франц. prote(ine) – белок и лат. –om(a) - совокупность) - совокупность всех структурных и каталитических белков в клетке эукариота или прокариота. Протеомика – наука, основным предметом изучения которой являются белки и их взаимодействия в живых организмах.

Задачи: установление количества содержащихся в клетке генов и их последовательности установление количества нуклеотидов и их последовательности в каждом гене установление функций каждого гена применительно к метаболизму организма

Для полного знания генома организма надо определить последовательность ( sequence ) миллионов пар нуклеотидов. Провести «секвенированиеие» целого генома можно только при автоматизации соответствующего оборудования. Для хранения полученных данных и их использования служат специальные банки данных.

Структурная Сравнительная Функциональная (метаболическая)

Задача : идентификация генов с помощью специальных компьютерных программ. Ведется поиск открытых рамок считывания со старт- кодонами и терминирующими кодонами, то есть идентифицируются структурные гены. Изучаемый геном характеризуется по : молекулярной массе количеству генов нуклеотидной последовательности в каждом гене

изучает сходства и различия в организации геномов разных организмов с целью выяснения общих закономерностей их строения и функционирования позволяет относительно быстро, связавшись с базой данных, установить, является ли изученный ген уникальным или он уже был идентифицирован в другой лаборатории и сведения о нем поступили в базу данных. дает возможность при систематической работе в этом направлении получить ответ на вопрос об эволюционной близости одного организма другому и на ряд подобных вопросов, относящихся к фундаментальной биологии

В тоже время здесь заложены возможности ответа и на вопросы практического характера: разработка экспресс-методов типирования бактерий и оценка риска бактериальной контаминации; создание лекарств, направленных на специфические мишени, блокирующие работу генов патогенности; более целенаправленное создание вакцин.

Цель : установление связи между геномом и метаболизмом, кластерами генов и многоступенчатыми метаболическими процессами, отдельными генами и конкретными метаболическими реакциями. Особое значение применительно к фармации, функциональная геномика имеет при установлении существенности отдельных генов (необходимость гена для жизнедеятельности клетки). Так при создании антимикробных лекарственных препаратов именно существенные гены должны быть мишенями для практически ценных антимикробных веществ.

Применительно к функциональной гномике надо отнести понятие «модельных» организмов – это некоторые микроорганизмы (прокариоты и низшие эукариоты) с полностью отсеквенированиеным геномом и досконально изученным метаболизмом, то есть микроорганизмы, у которых прослежены связи между генами и кодируемыми этими генами белками - ферментными и структурными.

В настоящее время появилось 2 новых направления в гномике: эволюционная медицинская Цель эволюционной геномики : объяснение пути эволюции геномов, происхождения генетического полиморфизма и биоразнообразия, роли горизонтального переноса генов. Цель медицинской геномики : решение прикладных вопросов клинической и профилактической медицины на основе знания геномов человека и патогенных организмов.

В отличие от геномики дает возможность охарактеризовать клетку именно в данный конкретный момент, зафиксировав все находящиеся в ней белки. Задачи: каталогизация всех белков, синтезируемых различными типами клеток; выяснение характера влияния возраста, условий окружающей среды и заболеваний на синтезируемые клеткой протеины; выяснение функций идентифицированных белков; составление схем связей между повышением или понижением уровня синтеза белков и происходящими в организме процессами, например, при развитии заболевания, инфицировании организма или биохимическими реакциями сельскохозяйственного растения, происходящими в ответ на нападение насекомых; изучение взаимодействий различных белков с другими белками, содержащимися внутри клетки и во внеклеточном пространстве.

Протеомика

Для протеомики основополагающую роль играет техника двухмерного электрофореза - разделение белков в одном направлении по молекулярной массе, а в другом по изоэлектрической точке. Также в протеомике используются следующие методы: метод кругового дихроизма и метод инфракрасной спектроскопии (для изучения вторичной и третичной структуры белка) методы ЯМР и рентгеноструктурный анализ (подробная информация о третичной структуре белка)

Практическая значимость протеомики Прослеживается тесная связь между изменениями в белковом составе и болезненным состоянием человека. Это используется для быстрой разработки новых лекарственных средств и новейших методов лечения болезней. На сегодняшний день 95% всех фармакологических средств воздействуют на белки. Первое практическое применение протеомных исследований состоялось в начале XX в., когда была обнаружена роль инсулина в развитии такого тяжелого заболевания, как диабет. Протеомика вместе с геномикой и био информатикой ориентирована на создание новых лекарственных препаратов, в которых молекулярными мишенями будут служить те или иные белки. Процесс нахождения новых мишеней для действия лекарств решается с помощью биоинформатики, объектом анализа которой является геном. Далее необходимо получить доказательства того, что данный белок интенсивно экспрессируется и находится в клетке в рабочем состоянии. Эту задачу решает протеомика. Таким образом выявляется молекулярная генетическая мишень для лекарства.

Однако протеомика может и самостоятельно решать проблему нахождения мишени. Если получить протеомные карты нормальных и патологических тканей, то по различиям в них можно установить, какие белки важны для развития того или иного патологического состояния, и выбрать их в качестве мишеней или использовать эти знания для диагностики.

К настоящему времени полностью секвенирование геном нескольких десятков видов бактерий, в том числе патогенных. Размер - несколько тысяч генов. Большинство генов – существенные, следовательно, они используются как мишени для антибактериальных веществ. Мишень - фермент или рибосомальный белок.

Является методом избирательного выбивания гена из генома (knockout) с проверкой выживания организма после такой процедуры. Цель: доказательство «существенности» генов. Методика: в клетку вводятся синтетические фрагменты - последовательности ДНК выбиваемого гена, похожие на природный ген, но слегка химически модифицированные. В результате синтетический участок испорченной ДНК внедряется в хромосому на место нормальной ДНК. Новый испорченный ген в клетке уже не работает. Метод позволяет исследовать роль каждого конкретного гена в развитии организма и его нормальном и патологическом функционировании и изучать различные человеческие болезни, используя нокаут-мышей в качестве модельных объектов.

3.2. Технология таргетного скрининга Создаётся на основе знания полностью секвенированиеного генома патогена и «существенных» генов в геноме. 1. Выбирается ген, который будет использован для их испытания как таргет и выделяется из генома. 2. Фрагмент ДНК амплифицируется с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) 3. Конструируются: бесклеточная система, где наработанная матрица служит для получения информационной РНК, специфичной для гена; бесклеточная рибосомная система, где эта информационная РНК служит для наработки белкового продукта, кодируемого данным геном.

4. Определяется функция этого белка - если наработанный белок схож с белком из «модельного» организма, используется бесклеточная система «субстрат 75»; - если сходство есть, но не очень близкое, то прибегают к анализу «мотивов» - коротких участков аминокислотной последовательности, которые распределены по всей длине белковой цепи и могут оказаться сходными у двух белков; - если сходства не существует, то устанавливают, с какими белками он (наработанный белок) контранскрибируется (переписывается в последовательность матричной информационной РНК).

Достоинство : любой ген становится доступен для ингибиторов его функций. Недостаток : у патогенных микроорганизмов открыты гены, «существенные» для протекания инфекционного процесса, но не «существенные» при росте in vitro. Следовательно, они не поддаются идентификации и не могут быть использованы как таргеты при поиске лекарств.

3.3. Ivi гены «Молчащие" in vitro гены патогенных микроорганизмов получили название ivi генов (генов вирулентности). К ним относятся: -гены, кодирующие образование токсинов, адгезинов и других факторов вирулентности; -гены ферментов; -гены транспортных белков Подавление функций молчащих генов отобранными ингибиторами приведет к подавлению роста (размножения) патогена именно в условиях in vivo, т.е. в инфицированном организме. Это и есть цель исследователей, создающих новые лекарственные препараты. Гены, становящиеся «существенными» для патогена in vivo - гены, кодирующие оптимальный компонентный состав системы или недостаток в пуринах и их предшественниках.

Гены, которые экспрессируются и in vivo и in vitro. Их продукты необходимы клетке всегда. Эти гены экспрессируются в любых условиях, поскольку без них клетка просто не может существовать. Поскольку ингибиторы house keeping gens обнаруживаются при поиске на питательных средах in vitro, практически все применяемые в клинике антибиотики и синтетические антибактериальные препараты являются ингибиторами функций именно этих генов.

Цель: выделение и выявление ivi генов с последующим их использованием в бесклеточных системах отбора ингибиторов. 1) Геном патогенной бактерии с помощью большого набора рестриктаз делится на сотни фрагментов. 2) Каждый отдельный фрагмент (x) генно-инженерными методами соединяется с лишенным промотора геном хлорамфеникол-ацетилтрансферазы (cat). 3) К фрагменту x-cat присоединяется также лишенный промотора лактозный оперон (lac Z), который нужен для системы окисления лактозы. 4) Фрагмент, состоящий из трех разнородных частей (x-cat-lac Z) включается в плазмиду. 5) Введение x-cat-lac Z в клетку Е. Coli. Получился набор разных штаммов Е. coli с разными частями генома салмонеллы. 6) Внедрение каждого штамма Е. coli в организм лабораторного животного и введении животному хлорамфеникола. Спустя сутки из ткани животного высевают бактериальную культуру на твердую индикаторную среду с лактозой. 7) Анализ колоний

Колонии красного цвета house keeping gens Бесцветные колонии ivi гены

ВЫВОД : Успехи генетики, молекулярной биологии и биохимии привели к формированию в девяностых годах прошлого века двух новых фундаментальных дисциплин - геномики и протеомики. Протеомика, базируясь на гномике, является следующим после нее этапом познания живого уже на белковом уровне. Бурное развитие этих дисциплин обеспечивает в наше время прогресс в ряде разделов биотехнологии,в том числе фармацевтической.

1. «Биотехнология на службе безопасности», Т. Зимина, «Что за геномикой? – Протеомика», А.И. Арчаков, «Биохимия и медицина – новые подходы и достижения», С.Е. Северин, «Биотехнология лекарственных средств» под ред. В.А. Быкова, М.В. Данилина, 1991