КИНЕТИКА ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ

Одним из проявлений жизни является способность живых организмов регулировать химические реакции, подавляя стремление к термодинамическому равновесию. Ферментативная кинетика – это наука, изучающая закономерности влияния природы реагирующих веществ (фермент, субстрат) и сопутствующих факторов (концентрация, рН среды, температура, присутствие активаторов или ингибиторов) на скорость ферментативных реакций.

Общие принципы кинетики химической реакции применимы и к ферментативным реакциям. Скорость ферментативных реакций зависит от: 1. Химической природы реагирующих веществ. 2. Концентрации фермента. 3. Концентрации субстрата. 4. Наличия кофермента или кофактора. 5. Присутствия активаторов или ингибиторов. 6. Температуры реакционной смеси. 7. рН среды.

Активность ферментов от температуры Скорость большинства биохимических реакций повышается в 2 раза при повышении температуры на 10°С (правило Вант-Гоффа). Температурный коэффициент Q 10 = 2. При температуре выше 50°С на скорость реакции большое влияние начинает оказывать тепловая денатурация белка-фермента, приводящая к полному прекращению ферментативного процесса. Для большинства ферментов оптимальная температура равна или выше той температуры, при которой в норме находятся клетки.

Зависимость активности ферментов от рН среды Ферменты обычно наиболее активны в пределах узкой зоны концентрации водородных ионов. Активность ферментов от рН определяется факторами: 1. Денатурация фермента при очень высоких или очень низких рН. 2. Изменение величины заряда молекул субстрата или фермента.

Влияние концентрации фермента на скорость ферментативной реакции. При условии избытка субстрата скорость реакции прямо пропорциональна концентрации фермента. υ = k [E] υ – скорость реакции, k - константа скорости реакции, [E] - концентрация фермента.

Влияние концентрации субстрата на скорость ферментативной реакции. Основные положения были разработаны еще в 1913 г. Л. Михаэлисом и М. Ментен. При низких концентрациях субстрата скорость прямо пропорциональна концентрации субстрата. При высших концентрациях субстрата скорость реакции максимальна и не зависит от концентрации субстрата, так как фермент насыщен. Числовое значение (концентрация) субстрата, при котором скорость реакции равна половине максимальной скорости, называется константой Михаэлиса К М

Зависимость скорости реакции от присутствия активаторов или ингибиторов АКТИВАТОРЫ Это вещества, которые повышают активность фермента, увеличивают скорость реакции Неорганические Органические Ионы металлов,сульфгидрильные соединения, Анионыкоферменты, ферменты, желчные кислоты, гормоны, лекарства Виды активации ферментов. 1. Ограниченный протеолиз (ковалентная модификация), 2. Аллостерическое активирование (нековалентное), 3. Активация ионами.

1. Ограниченный протеолиз Высоко специфичный необратимый процесс превращения профермента в фермент, путем удаления части пептидной цепи. Использование ограниченного протеолиза: 1. Свертывающая система крови, 2. Синтез соединительной ткани, 3. Образование активных ферментов пищеварения, 4. Процессинг ряда гормонов (инсулин, эндорфины). НСl Например: Пепсиноген Пепсин + пептид

2. Аллостерическое активирование Аллостерическая активация характерна для ферментов, имеющих четвертичную структуру строения. При действии активатора на аллостерический центр, изменяется третичная и четвертичная структура фермента, в результате чего формируется активный центр. Роль аллостерических активаторов выполняют гормоны, метаболиты или продукты реакции.

3. Активация ионами Свыше 25% всех ферментов содержат прочно связанные ионы металлов или активны только в их присутствии. Существует четыре схемы трёхкомпонентных комплексов, включающих ион металла (М), субстрат (S) и каталитический центр фермента (Е): 1. Комплекс с мостиковым субстратом Е – S – М, 2. Комплекс с мостиковым ферментом М – Е – S, 3. Простой комплекс с мостиковым металлом Е – М – S, М 4. Циклический комплекс с мостиковым металлом Е --- S

В зависимости от типа связи определяется и роль металлов: 1. Способствуют взаимодействию фермента и субстрата (образование энзим-субстратного комплекса). 2. Связь кофермента с апоферментом (Zn в АлкогольДГ) 3. Окислительно-восстановительные реакции (Мо в нитрат- редуктазе) 4. Поддерживает структуру белка (Са поддерживает 2° и 3° амилазы) 5. Участвует в образовании истинного субстрата (Мg активирует креатинфосфокиназу, благодаря образованию магниевой соли АТФ) 6. Металлы могут быть аллостерическим модулятором Анионы также являются активаторами, но ускоряют второй этап реакции. (Сl – активирует амилазу) E + S ES ES (1) EP E + P

ИНГИБИТОРЫ Это вещества, которые вызывают полное или частичное торможение реакций, катализируемых ферментами. Неорганические Органические Ионы тяжелых металлов Лекарства, токсины, яды, (Hg, Pb, Cu, Ag)отравляющие вещества, гормоны, инсектициды, нервные газы, полипептиды Ингибирование ферментов. Специфическое - неспецифическое Обратимое - необратимое Конкурентное - неконкурентное Аллостерическое

Ингибирование ферментов Специфическое ингибирование вызывают соединения, которые препятствуют образованию нормального фермент-субстратного комплекса. Неспецифическое ингибирование вызывают химические вещества, действующие на структуру белка- фермента. Если ингибитор вызывает стойкие изменения пространственной третичной структуры фермента или модификацию функциональных групп фермента, то такой тип ингибирования называется необратимым. Чаще, однако, имеет место обратимое ингибирование. После прекращения действия ингибитора или его удаления фермент вновь становится активным.

Обратимое ингибирование ферментов Конкурентное ингибирование может быть вызвано веществом, имеющим структуру, похожую на структуру субстрата, но несколько отличающуюся от структуры истинного субстрата. Такое ингибирование основано на связывании ингибитора с активным центром. Неконкурентное ингибирование вызывается веществами, не имеющими структурного сходства с субстратом и связываются не с активным центром, а в другом месте молекулы фермента (например с аллостерическим центром).

Конкурентное ингибирование Конкурентами за активный центр являются субстрат и ингибитор, которые сходны по структуре. Конкурентные ингибиторы не изменяют максимальной скорости реакции, но увеличивают Км. Конкурентные ингибиторы – многие соединения. 1. малоновая кислота (ингибитор сукцинатдегидрогеназы) напоминает субстрат этого фермента янтарную кислоту. 2. Глюкоза ингибитор учет глюкозо-6-фосфатазу, которая катализирует гидролиз глюкозо-6-фосфата. 3. Сульфаниламиды тормозят синтез фолиевой кислоты, необходимой для роста микроорганизмов.

Неконкурентное ингибирование Неконкурентые ингибиторы присоединяются к ферменту вне активного центра. В связи с этим они снижают как начальную, так и максимальную скорости реакции, Км не изменяется (не меняется сродство фермента к субстрату). Неконкурентные ингибиторы: 1. Тяжелые металлы (связывают SH-группы ферментов). 2. Фториды (взаимодействующие с ионами марганца). 3. Соли синильной кислоты, окись углерода и др. (присоединяеются к железосодержащим простетическим группам)

Аллостерическое ингибирование Аналогично неконкурентному ингибированию. В связи с этим они снижают как начальную, так и максимальную скорости реакции, Км не изменяется (не меняется сродство фермента к субстрату). На аллостерическом ингибировании основано большое количество реакций в организме: 1. Гем тормозит первое звено в цепи реакций, ведущих в его образованию (регуляция по типу обратной связи). 2. Действие многих лекарственных средств.

Регуляция ферментативной активности Быстрая - изменение рН, температуры (изменяется каталитическая активность фермента). Медленная - изменение синтеза белка-фермента (изменяется концентрация фермента). Типы регуляции: 1. Ковалентная модификация – осуществляется в результате реакций фосфорилирования – дефосфорилирования, аденилирования, ацетилирования, сульфирования, ограниченного протеолиза. 2. Аллостерическая регуляция

Регуляция ферментативной активности Уровни регуляции: 1. Свойства окружающей среды (изменение активности фермента от температуры, рН). 2. Аллостерическая регуляция (эффекторы активируют или ингибируют аллостерический центр). 3. Изменение интенсивности синтеза ферментов («включение» или «выключение» генов). 4. Воздействие гормонов на ферментативный аппарат клетки.

Принципы определения активности ферментов : 1. По скорости убыли субстрата, 2. По скорости образования продукта реакции, 3. По измерению промежуточных продуктов реакции. Методы определения активности ферментов: 1. Химические 2. Поляриметрические 3. Газометрические 4. Хроматографические 5. Флюоресцентные 6. Ультрацитохимические 7.Спектрофотометрические

Единицы активности ферментов 1. Стандартная международная единица активности – то количество фермента, которое превращает 1 микромоль субстрата в 1 минуту. 2. Катал – количество катализатора (фермента), способное превращать 1 моль субстрата за 1 сек. 3. Молярная активность – количество молекул субстрата, превращенных одной молекулой фермента за 1 минуту (число оборотов). 4. Удельная активность фермента равна числу единиц активности в исследуемом образце, отнесенному к массе белка в этом же образце (мкмоль / мин на 1 мг).