Цитогенетические методы Цитогенетические методы диагностики наследственных заболеваний Выполнила: Черикбаева К.Ш. МББ Проверила: Омирбекова Н.Ж.

Цитогенетика - раздел генетики, изучающий закономерности наследственности и изменчивости на уровне клетки и субклеточных структур Основным предметом исследования в цитогенетике являются хромосомы Цитогенетика

ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ КЛИНИЧЕСКОЙ ЦИТОГЕНЕТИКИ

-Анализ полового хроматина -FISH Кариотипиро звание Метод про фазных хромосом Метод прометафазных хромосом Ано- тело фазный метод Цитогенетические методы

анализ полового хроматина в клетках буккального эпителия. Скринирующий метод. Основан на регистрации неактивной Х- хромосомы (Х-хроматин) или гетерохроматинового участка Y- хромосомы (Y-хроматин); анализ численных и структурных аномалий, затрагивающих конкретные участки хромосом методом FISH Интерфаза

Исследозвание про фазных хромосом (сперматоциты на стадии пахитены) Используется при установлении причин мужского бесплодия Профаза

Высокий уровень разрешения ( 850 сегментов) Диагностика синдромов, обусловленных микроперестройками хромосом. Прометафаза

Исследозвание метафазных хромосом используется для установления хромосомного статуса пациента в клинической и пренатальной цитогенетике Метафаза

Исследозвание анафазы-телофазы используется для регистрации специфического воздействия различных мутагенов. Анафаза- телофаза

Кариотипирозвание (основной метод!!!) Молекулярно-цитогенетические методы (FISH) Определение полового хроматина Клинически значимые методы

Материал – буккальный эпителий Материал распределяется по предметному стеклу и без предварительной обработки окрашивается ацетоарсеином. При микроскопии наличие в ядрах клеток одного тельца Барра означает, что клетки содержат две Х – хромосомы, 2-х телец Барра – три Х-хромосомы, отсутствие телец Барра означает содержание в каждой клетке одной Х- хромосомы. Время исследования ~30 минут Половой хроматин

-Клиническая картина синдрома Тернера и синдрома Клайнфельтера -Отстазвание в росте, физическом и половом развитии у девочек -Нарушение половой дифференцировки: гипогонадизм, микроорхидизм, двусторонний крипторхизм, ВПР наружных половых органов, ложный гермафродитизм -Первичная или вторичная аменорея -Бесплодие у мужчин -Нарушение психосексуальной ориентации -Асоциальное поведение у мальчиков Показания к определению полового хроматина

Множественные врождённые пороки развития, сопровождаемые клинически анормальным фенотипом или диморфизмом. Умственная отсталость или отстазвание в развитии. Нарушение половой дифференцировки или аномалии полового развития. Первичная или вторичная аменорея. Аномалии спермограммы - азооспермия или тяжелая олигоспермия. Бесплодие неясной этиологии. Привычное невынашизвание, Родители пациента со структурными хромосомными аномалиями. Рождение или прерызвание беременности ребенком с множественными пороками развития при отсутствии возможности кариотипа ребенка. Повторное рождение детей с хромосомными аномалиями Показания к кариотипированию

Получение популяции активно делящихся клеток Приготовление хромосомных препаратов Окраска Микроскопия Этапы кариотипирования

Методы приготовления хромосомных препаратов Прямой метод (костный мозг, лимфатические узлы, любые ткани эмбриона на ранних стадиях развития и хорион/плацента до 20-й недели беременности) Непрямой метод (Любая ткань, обычно это лимфоциты крови)

Кровь (2 мл) Питательная среда (RPMI 1640) Сыворотка (эмбриональная сыворотка, IV группы) Фитогемгглютинин (ФГА) Инкубация 72 часа Колхицин Фиксация смесью спирта и уксусной кислоты (3:1) Распластызвание хромосом на стекле Окрашизвание Микроскопия, анализ Время исследования ~14 дней Непрямой метод

Окрашизвание хромосом СЕЛЕКТИВНОЕ ОКРАШИВАНИЕ конститутивный гетерохроматин, активные ядрышко-образующие районы, центромерные и тело мерные районы. ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЕ ОКРАШИВАНИЕ выявление чередующихся сегментов, окрашивающихся с различной интенсивностью

Бенд (band- полоска)=сегмент Черный бенд – гетерохроматин (неактивный хроматин) Белый бенд – эухроматин Бендинг или «полосатость» хромосом

Классификация хромосомных аномалий Числовые Структурные Регулярные полиплоидия Триплоидия Полиплоидия Моносомия Трисомия Полисомия Нулесомия Мозаицизм Сбалансированные Несбалансированные Инверсии Транслокации робертсоновская инсерция Делеции, кольцевые хр, дериватные, Дупликации, изохромосома, изодицентрики

Триплоидия (3n) 69,XXY, 69,XXX, 69,XYY Полиплоидия (4n) 92,XXYY Моносомия (2n-1) 45,Х Трисомия (2n+1) 47,XY,+21 Полисомия (тетрасомия (2n+2) 48,XXXY пентасомия (2n+3) 49,XXXXX) Числовые аномалии

Инверсии Транслокации Инсерции Делеции Дупликации Кольцевые хромосомы Изохросомы Структурные аномалии

слияние акроцентрических хромосом с полной или частичной утратой материала коротких плеч Робертсоновская транслокация Негомологичная роб.транслокация Гомологичная роб.транслокация

Вставка интерстициального фрагмента одной хромосомы в точку разрыва, расположенную в другой хромосоме Инсерция

Потеря участка хромосомы Делеция

Дублирозвание участка хромосомы Дупликация

При потере концевых сегментов обоих плеч хромосома может замкнуться в кольцо. Кольцевая хромосома

Формула кариотипа 46,XY Нормальный результат:

Формула кариотипа 46,XXНормальный результат:

Изменение числа хромосом: 47,XY,+21

Изменение числа хромосом: 45,X

Fluorescent In Situ Hybridisation FISH - метод флуоресцентного окрашивания отдельных участков хромосом (или целых хромосом) основанный на способности хромосомной ДНК образовывать устойчивые гибридные молекулы с ДНК(РНК)-зондами на препаратах фиксированных клеток. Метод позволяет определить местоположение последовательности ДНК или РНК в клетке, клеточном ядре или на хромосомах.

При определении количества отдельных хромосом в клетке, когда кариотипирозвание невозможно из- за малого количества материала Определение несбалансированных структурных перестроек Когда следует использовать FISH?

Концевые делеции Делеция 3q

Достоверный высокая разрешающая способность Возможность исследования генетического материала в интерфазных ядрах получение объективных результатов по принципу "да/нет" - это количественный метод относительно простая интерпретация результатов Преимущества FISH-метода

Дорогостоящий Флуоресцентные красители быстро "выцветают" Для анализа результатов необходим высококачественный флуоресцентный микроскоп Недостатки

«Третьей революцией» в цитогенетике стал метод, получивший наззвание Эрре-ПГГ (array CGH). Сущность метода заключается в дифференциальном флуоресцентном мечении геномной ДНК пациента и референс-контроля с последующей гибридизацией на специальных чипах с пресинтезированными фрагментами ДНК-матриц в кол-ве, достаточном для репрезентативного представления всего генома (5 т. - 1 млн матриц на чип). Метод array CGH снимает ограничения интерфазного FISH-, КФ-, ПЦР- и МЛЦР-методов, так как позволяет проводить полногеномную идентификацию хромосомных аберраций, включая анеуплоидии, делеции и дупликации. Нет необходимости культивирования плодного материала и приготовления из него цитогенетических препаратов. В дальнейшем микрочип сканируется, а изображение обрабатывается специальным программным обеспечением.

ПРЕИМУЩЕСТВА МЕТОДА СРАВНИТЕЛЬНОЙ ГЕНОМНОЙ ГИБРИДИЗАЦИИ (Comparative genome hybridization - CGH Array): 1. исследозвание одновременно всего генома. 2. возможность детекции вариаций числа копий отдельных участков генома. 3. возможность определения дисомий (удвоение хромосомы в гаплоидном наборе). 4. автоматизация исследования (снижение ошибок в рутинной работе). 5. объективность и высокая информативность полученных результатов (о наличии или нет более 150 генетических заболеваний). 6. условно короткие сроки получения результата по сравнению с обычными цитогенетическими методами (1-3 суток, отсутствует период культивирования).

ОГРАНИЧЕНИЯ МЕТОДА СРАВНИТЕЛЬНОЙ ГЕНОМНОЙ ГИБРИДИЗАЦИИ (Comparative genome hybridization - CGH Array): РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ НЕ ИСКЛЮЧАЮТ НАЛИЧИЯ: 1. сбалансированных хромосомных аберраций. 2. точечных мутаций генов (SNP). 3. мелких дупликаций, делеций в участках, находящихся за пределами исследуемой области (неспецифические участки хромосом). 4. низкого уровня мозаицизма (<15%).

ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА СРАВНИТЕЛЬНОЙ ГЕНОМНОЙ ГИБРИДИЗАЦИИ (Comparative genome hybridization - CGH Array): 1. пренатальная диагностика (клетки ворсин хориона, амниотическая жидкость, кордовая кровь и т.д.). 2. диагностика аборт усов при замершей беременности. 3. постнатальная диагностика (склонность к мульти факторным заболеваниям, онкопатология, дифференциация умственной отсталости и т.д.). 4. до имплантационная генетическая диагностика (ДГД)

ВЫВОДЫ Метод CGH Array, основной задачей которого является установление четкого и конкретного генетического диагноза в кратчайшие сроки позволяет не только дифференцировать ед лиственную и спорадическую патологию, но и способствует квалифицированному медико-генетическому консультированию семьи в отношении особенностей лечения ребенка, прогноза течения заболевания и планирования последующих беременностей. CGH Array имеет четкие показания для проведения диагностики и углубляет (а не заменяет!) результаты молекулярно-генетической и цитогенетической диагностики. Диагностическая тактика может проходить двумя принципиальными путями, где CGH Array применяется как дополнительный метод исследования и как основной, то есть может применяться как для углубленного исследования, так и в качестве основного метода диагностики.