Лекции по курсу «Микробиология». Лектор доцент Лысак В.В. 1 ЗАКОНОМЕРНОСТИ МИКРОБНОГО РОСТА Различают понятия рост микробной клетки и рост микробной популяции. Под ростом микробной клетки понимают согласованное увеличение количества всех химических компонентов, формирующих клеточные структуры. Рост клеток обычно сопровождается увеличением их массы и размеров. Однако эта закономерность наблюдается не всегда, так как в некоторых условиях клетки способны просто накапливать запасные или резервные вещества, т. е. масса может увеличиваться, но роста при этом не наблюдается.

Лекции по курсу «Микробиология». Лектор доцент Лысак В.В. 2 У большинства микроорганизмов не наблюдается полярности клеток и рост их идет равномерно вдоль одной из осей клетки (обычно длинной). Когда клетка бактерии достигает характерного для данного вида размера, она делится. В некоторых случаях данное свойство может быть нарушено. При определенных условиях клетки могут делиться, не достигая своих максимальных размеров (образуются мини- клетки), либо удлинятся без деления с формированием нитевидных структур (филаментов). Эти явления могут быть связаны с мутацией или нарушением метаболизма при некоторых условиях культивирования, кроме того нехватка питательных веществ и избыток продуктов метаболизма могут приводить к утрате способности клеток к размножению и образованию вместо этого покоящихся форм или к гибели.

Лекции по курсу «Микробиология». Лектор доцент Лысак В.В. 3 Рост микробной популяции – это увеличение количества клеток в популяции. В подходящей среде, к которой бактерии полностью адаптированы, они находятся в состоянии сбалансированного роста. В период сбалансированного роста удвоение биомассы сопровождается удвоением всех других учитываемых параметров популяции, например количества белка, ДНК, РНК и внутриклеточной воды. В условиях сбалансированного роста легко определить величину скорости роста бактериальной популяции в каждый момент времени, если измерить прирост любого компонента клеток по отношению к его исходному количеству.

Лекции по курсу «Микробиология». Лектор доцент Лысак В.В. 4 Таким образом, в растущей сбалансированно культуре скорость прироста вещества клеток в любой данный момент пропорциональна числу или массе имеющихся в это время бактерий. Коэффициент пропорциональности называют удельной скоростью роста (μ). Данная величина отличается для разных культур, и даже для одной культуры в зависимости от условий выращивания она меняется. Удельную скорость роста можно рассчитать по следующим формулам: где N – число клеток в единице объема; Х – масса клеток в единице объема; t – время.

Лекции по курсу «Микробиология». Лектор доцент Лысак В.В. 5 После интегрирования и перехода к десятичным логарифмам получим формулу для определения удельной скорости роста (ч –1 ): и Зная удельную скорость роста, можно определить время генерации (g – время, необходимое для удвоения числа клеток популяции в часах или минутах):

Лекции по курсу «Микробиология». Лектор доцент Лысак В.В. 6 Если рост клеток в культуре ограничен количеством внесенного в питательную среду компонента, то между его начальной концентрацией и полученной биомассой клеток существует постоянная линейная зависимость (при условии ограничения роста только по одному параметру). Масса клеток, образованная на единицу использованного компонента среды, представляет собой величину Y, которую называют экономическим коэффициентом (или выходом биомассы).

Лекции по курсу «Микробиология». Лектор доцент Лысак В.В. 7 Экономический коэффициент определяют по уравнению где Х – масса сухого вещества клеток (г/мл культуры), вступившей в стационарную фазу роста; Х 0 – масса сухого вещества клеток в 1 мл среды сразу после инокуляции среды; (Х – Х 0 ) – урожай бактериальной культуры (урожай зависит от количества и природы используемых питательных веществ, а также от условий культивирования); (S 0 – S) – количество потребленного субстрата (компонента среды).

Лекции по курсу «Микробиология». Лектор доцент Лысак В.В. 8 СПОСОБЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ В лабораторных и промышленных условиях используют два основных способа культивирования микроорганизмов: периодическое (статическое) и непрерывное (проточное). Зависимость концентрации жизнеспособных клеток при периодическом культивировании от длительности инкубирования описывается характерной кривой, которая имеет S-образную форму и называется кривой роста клеточной популяции. На кривой можно различить несколько фаз роста, сменяющих друг друга в определенной последовательности: начальную (или лаг-) фазу; экспоненциальную, или логарифмическую, фазу; стационарную фазу; фазу отмирания.

Лекции по курсу «Микробиология». Лектор доцент Лысак В.В. 9 Кривая роста бактериальной культуры

Лекции по курсу «Микробиология». Лектор доцент Лысак В.В. 10 В условиях непрерывного (проточного) культивирования в сосуд, содержащий популяцию бактерий, подается свежая питательная среда и из него одновременно удаляется часть среды с клетками микроорганизмов. Это позволяет на длительное время задержать культуру в состоянии экспоненциального роста. Существуют два основных, принципиально различающихся способа непрерывного культивирования, подчиняющихся автоматическому регулированию: с использованием хемостатов, с использованием турбидостатов.

Лекции по курсу «Микробиология». Лектор доцент Лысак В.В. 11 Непрерывное культивирование микроорганизмов в хемостате

Лекции по курсу «Микробиология». Лектор доцент Лысак В.В. 12 А – хемостат; Б – турбидостат с автоматической регуляцией оптической плотности; 1 – поступление среды, 2 – мешалка, 3 – сток культуры, 4 – насос, 5 – фотоэлемент, 6 – источник света

Лекции по курсу «Микробиология». Лектор доцент Лысак В.В. 13 Для глубинного культивирования бактерий с аэрацией в промышленных и лабораторных условиях применяют биореакторы, или ферментеры. Они представляют собой герметичные котлы, в которые заливается жидкая питательная среда. Ферментеры снабжены автоматическими приспособлениями, позволяющими поддерживать постоянную температуру, оптимальное значение рН и редокс-потенциал, дозированное поступление необходимых питательных веществ. Кроме того, они снабжены системами перемешивания, аэрирования, охлаждения, пеногашения.

Лекции по курсу «Микробиология». Лектор доцент Лысак В.В. 14

Лекции по курсу «Микробиология». Лектор доцент Лысак В.В. 15

Лекции по курсу «Микробиология». Лектор доцент Лысак В.В. 16 Непрерывное культивирование широко используется в промышленной микробиологии и биотехнологии, а также при проведении физиологических, биохимических и генетических исследований, так как в данных условиях наблюдается константная плотность популяции и концентрация всех компонентов питательной среды. В связи с тем, что микроорганизмы имеют малые размеры, изучить физиологию и биохимию отдельно взятой клетки невозможно. Поэтому в подавляющем большинстве исследуют поведение клеточных популяций.

Лекции по курсу «Микробиология». Лектор доцент Лысак В.В. 17 В обычных популяциях микроорганизмы в каждый конкретный момент времени находятся на разных стадиях клеточного цикла. Такие культуры называются асинхронными. И соответственно метаболические процессы в этих клетках будут различаться своими фазами. Таким образом, в асинхронной культуре можно определить только усредненные характеристики популяции. Для изучения процессов обмена веществ на протяжении цикла клеточного деления необходимо, чтобы все клетки в популяции делились в одно и то же время (синхронно). Культуры, в которых все клетки находятся на одной стадии клеточного цикла и делятся одновременно, называют синхронными.

Лекции по курсу «Микробиология». Лектор доцент Лысак В.В. 18 Синхронизировать рост и деление клеток в какой-либо популяции можно с помощью различных искусственных приемов, таких как: быстрое изменение температуры, интенсивности освещения (для фототрофных микроорганизмов), лимитированием количества питательных веществ, фильтрованием суспензии клеток микроорганизмов через специальный фильтр, позволяющий отобрать клетки одного размера. Однако в синхронизированном состоянии культура не может находиться длительное время и после двух-трех генераций процесс деления клеток асинхронизируется.

Лекции по курсу «Микробиология». Лектор доцент Лысак В.В. 19 Культивирование иммобилизованных клеток микроорганизмов Иммобилизованные клетки микроорганизмов можно использовать практически во всех биотехнологических процессах для получения ценных продуктов (спиртов, кетонов, органических кислот, аминокислот, витаминов, антибиотиков, углеводов, ферментов и др.). Их также применяют для очистки сточных вод, для биодеградации токсичных природных и неприродных соединений (ксенобиотиков), извлечения металлов из руд, горных пород, для удаления серы из угля, для увеличения добычи нефти из нефтескважин и др. Иммобилизованные клетки сохраняют высокую ферментативную активность, что позволяет их использовать в непрерывно действующих технологических процессах.

Лекции по курсу «Микробиология». Лектор доцент Лысак В.В. 20 Иммобилизация – это процесс фиксации клеток микроорганизмов с помощью физико-химических сил на носителе или в носителе. Методы иммобилизации подразделяются на химические и физические. Химические методы иммобилизации предполагают образование ковалентных связей между какими-либо из функциональных групп на поверхности клетки микроорганизма и материалом носителя. Однако, химическая иммобилизация микробных клеток может привести к нежелательным изменениям их каталитических и других свойств.

Лекции по курсу «Микробиология». Лектор доцент Лысак В.В. 21 При физической иммобилизации микроорганизм удерживается на носителе или в нем без образования ковалентных связей. Методы физической иммобилизации микроорганизмов делят на три группы: 1)адсорбция на поверхности нерастворимых носителей; 2)включение в поры геля; 3)иммобилизация в полимерных мембранах. В качестве носителей для иммобилизации микроорганизмов используют как органические, так и неорганические материалы. Органические носители делят на: природные полимеры, синтетические полимеры.

Лекции по курсу «Микробиология». Лектор доцент Лысак В.В. 22 Для иммобилизации микроорганизмов чаще используют синтетические полимеры, так как природные полимеры (полисахариды, белки, липиды) могут ими использоваться в качестве источников углерода и энергии. К синтетическим органическим носителям относятся: полимеры на основе стирола; полиакриламид; полиуретановые полимеры; полиамиды и др. Из неорганических носителей для иммобилизации микроорганизмов используют макропористые кремнеземы (чаще всего силикагели).