ИНСУЛЬТ, КАК МЕЖДИСЦИПЛИНАРНАЯ ПРОБЛЕМА НОВЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ ЭПИГЕНЕТИЧЕСКОГО ВЛИЯНИЯ НА ПРОЦЕССЫ НЕЙРОПРОТЕКЦИИ И НЕЙРОРЕПАРАЦИИ В ТЕРАПИИ ОСТРОГО НАРУШЕНИЯ МОЗГОВОГО КРОВООБРАЩЕНИЯ НАРУШЕНИЯ МОЗГОВОГО КРОВООБРАЩЕНИЯ Зав.лаб. АО «Фарм-Синтез» М.Соколов Москва, 2016

«Инсульт, как междисциплинарная проблема» Инсульт – полиэтиологическое заболевание Комобидность - ( со - вместе + morbus – болезнь, лат.) Пациенты с наличием одновременно нескольких заболеваний являются скорее правилом, чем исключением Отсутствие единого комплексного научного подхода к оценке коморбидности влечет за собой пробелы в клинической практике В большинстве проведенных рандомизированных клинических исследований включаются пациенты с отдельно выделенной патологией, делая коморбидную патологию критерием исключения, особенно в стадии декомпенсации. «… Не может остаться незамеченным отсутствие коморбидности в систематике заболеваний, представленных в Международной классификации Болезней X пересмотра …» (ВикипедиЯ)

ПРЕДИКТИВНАЯ И ПРЕЦИЗИОННАЯ МЕДИЦИНА Предективная медицина Медицина, использующая информацию, предоставляемую персональной гендомикой при выборе медицинских процедур, необходимых для конкретного человека. Концептуальную основу составляют представления о генетическом полиморфизме Прецизионная медицина Прецизионная медицина основана на «новой систематике человеческих болезней, базирующейся на молекулярной биологии»

Факторы влияющие на течение и тактику терапии инсульта Возраст, Пол, Профессия Генетика и эпигенетика Сопутствующая патология и терапия Непосредственная причина Индивидуальные особенности пациента Возможность визуализации очага Время от появления первых симптомов Очаг (объем, характер поражения, локализация) Уровень нарушения гомеостаза и декомпенсации сопутствующей патологии Диагностические мероприятия Возможность этиологического лечения Поддержание гомеостаза Нейропротекция Нейрепарация Нейропластичность (аксон-, синапто-, дендритовгенез ) Лечение и реабилитация

Потеря нейронов Увеличение дендритного дерева Снижение нейрогенеза Количество нейронов и возраст к 30 годам количество нейронов – 85 млрд., глиальных клеток – в 10 – 50 раз больше после 50 лет теряется % нейронов за каждое 10-летие (до 350 тыс. в месяц) увеличивается количество связей оставшихся нейронов затрудняются процессы репарации и пластичности снижается нейрогенез и возможность встраивания нейробластов в нейронную сеть растет количество многоплоидных нейрональных клеток

Сосуды мозга извозчика (слева) и профессора математики (справа) « Клинический архив гениальности и одарённости» индивидуальная адаптация мозга к реализации когнитивных процессов

Проблемные аспекты современной парадигмы нейропротекции и нейрорепарации - основная настроенность специалистов на внутриклеточных механизмах с креном в сторону молекулярной биологии и генетики - ущербными остаются топологические и геометрические аспекты пространственной организации тканей и организация морфогенеза - во многом остается неизвестной суть – природа и механизмы перестроек клеточной упаковки в патологии - невозможно прогнозирование процессов репарации тканей

Причинами затруднений являются: - слабый учет клеточных взаимодействий - игнорирование структуры клеточных решеток - недостаточное развитие формализованных теорий морфогенеза - трудность эмпирической реконструкции 3-D структуры

ПРЕДИКТИВНАЯ И ПРЕЦИЗИОННАЯ МЕДИЦИНА через парадигмы «- домик» Современные представления о молекулярном внеклеточном сигналинге: Генддомика (Genomics, DNA genes) Цель: составление генной сети для каждого мультифакториального заболевания, идентификация в ней центральных генов и генов – модификаторов, анализ ассоциации их полиморфизма с конкретным заболеванием для использования персональной гендомики в предиктивной и прецизионной медицине

Транскриптддомика (Transcriptomics, RNA 100,000 mRNAs) - идентификация всех матричных РНК, кодирующих белки - определение количества каждой индивидуальной мРНК - определение закономерностей экспрессии всех генов, кодирующих белки Задачи транскриптдомики: - реконструировать коды, заключенные в геноме (совместно с гендомикой) - выявлять информацию в виде сигналов и кодов, необходимую для формирования протеома (совместно с протедомикой)

транскриптом, лежит в основе формирования второго уровня фенотипа – протеома клеток, тканей и органов микроРНК – ддомика (mi-RNA > 700 miRNAs) одна из самых «горячих» тем в молекулярной биологии - поиск микроРНК, которые выступают альтернативными регуляторами известных физиологических процессов выступают основными небелковыми регуляторами онтогенеза дополняют «классическую» схему регуляцию генов ( индукторы, супрессоры, компактизация хроматина и т. д. ) mi-RNA регулируют активность около 30% всех генов, причём существуют как повсеместно распространённые, так и тканеспецифичные молекулы

mi-RNA играет критически важную роль в управлении ростом и выживанием клетки let-7, обладает контролем над аутофагией через сигнальный путь аминокислот, что может оказаться главным активатором функции комплекса mTORC 1 Начались разработки использования mi-RNA для перепрограммирования соматических клеток С помощью mi-RNA мужчины могут передавать реакцию на стресс по наследству Экзогенная mi-RNA из пищи матери способна проходить через плаценту и регулировать экспрессию генов плода

Протеддомика Proteomics (Proteins 1,000,000 proteins) Метаболддомика Metabolomics (molecules) 2500 метаболитов, 1200 лекарств, 3500 веществ пищи ( The "Human Metabolome Project" Database (HMDB), David Wishart, University of Alberta, 2007 г.) систематическое изучение уникальных химических отпечатков пальцев специфичных для процессов, протекающих в живых клетках» изучение низкомолекулярных метаболических профилей метаболические профили дают мгновенный снимок физиологических процессов в клетках, тканях и органах

Геном - это русло реки, проложенное поколениями потоков, проносившихся по нему. Протеом - это бурление и плеск миллиона капель, мчащихся по реке в данную секунду. Т.А.Воронцова « … по инструкциям, хранящимся в 20 тысячах наших генов, синтезируется от до белковых молекул…»

Протеддомика Банк данных "Human Protein Index" калифорнийской фирмы "Large Scale Proteomics" - располагает сведениями о 115 тысячах белков в образцах 157 тканей. Банк данных SWISS PROT содержит сведения о 8500 хорошо исследованных белков. Анализ структуры белка обходится сейчас в тыс. $ 7 американских лабораторий объединились в организацию "Protein Structure Initiative" Цель - снизить стоимость анализа до 20 тыс. $ и исследовать в ближайшие десять лет структуру 10 тысяч новых белковых молекул

Пример: В составе постсинаптического уплотнения обнаружено около 620 белков: - 9 из них связаны с AMP-рецепторами - более кластеризуются с NMDA-рецепторами В синаптической терминали мозга мыши выделено более 1100 белков, взаимодействия которых определяют функциональное равновесие между пластичностью и стабильностью эффективности синаптических связей (Collins et al., 2006)

Парадигмы белково-пептидной регуляции г. Гюнтер Блобель удостоен Нобелевской премии по физиологии и медицине за открытие органеллоспецифичности вновь синтезированных белков ("признаки адреса", или "почтового индекса") применимы к белкам других внутриклеточных органелл г. Шинью Яманаку (Shinya Yamanaka) удалось превратить фиброциты кожи человека в фибробласты, а затем в IP – клетки (индуцированные плюрипотентные стволовые клетки - Induced Pluripotent Stem Cell) - перепрограммирование в состояние плюрипотентности г. Хуан Карлос Бельмонте (Juan Carlos Belmonte) получил IP-клетки из кератиноцитов, их дифференцировку в клетки всех трёх зародышевых листков, включая дофаминергические нейроны и кардиомиоциты, совершающие коллективные биения в культуре

Новые данные молекулярной биологии и биохимии белков в частности: - открытие явления белкового автосплайсинга (процесса аналогичного сплайсингу нуклеотидов) - выделение белковых интернов и их роуминг - описание явления транс-сплайсинга со сшиванием белков, кодируемых различными генами - доказательство эндонуклеазой активности интернов с возможностью амплификации генов, обеспечением передачи интернового гена другим особям данного вида или другим видам ( т. н. горизонтальный и вертикальный перенос соответственно ) кардинально меняют многие взгляды на основы фундаментальной науки

Опровержением «незыблемой» догмы и постулата структурированности белков послужило описание: - «функционально неупорядоченных белков» (intrinsically unstructured proteins), с отсутствием фиксированной пространственной структурой - белков, чья основная цепь «завязана» в узлы (protein knotos) - белков, которые вообще никогда не сворачиваются, даже связавшись со своими функциональными белками-партнерами 1. Эти белки не являются «клеточным мусором» 2. Повышенная пластичность, является обязательным условием для выполнения функций позволяет им связываться с большим числом уникальных белков-партнеров 3. Роль белков, не имеющих фиксированного пространственного строения до конца непонятна

Основные задачи терапии острого ишемического инсульта: 1. Реперфузия ишемического очага - тромболизис - тромбоэкстракция - моделирование сосудистого русла 2. Нейропротекция - защита нервной ткани области нарушенного кровоснабжения от пота биохимических каскадов сопровождающих ишемию и некроз 3. Активация процессов репаративной регенерации - нейрорепарация ( синапто-, дендритов-, аксонгенез ) - моделирование сосудистого русла

Нейропротекция ( защита нервной ткани от повреждения) - любая стратегия или комбинация стратегий, которая препятствует, замедляет или уменьшает повреждение ткани мозга Органный уровень - сохранение возможности выполнения определенных функций для обеспечения жизнедеятельности организма Тканевой уровень - поддержание гомеостаза и сохранение межклеточных взаимодействий, снижение метаболизма, контроль за клиренсом продуктов распада Клеточный уровень - поддержание целостности клеточных мембран, своевременная перестройка метаболизма, рациональная регуляция процессов жизнедеятельности, синтеза цитокинов и жирорастворимых эндогенных антиоксидантов ( токоферол, убихинон, ретинол, мелатонин ) Молекулярный уровень - регуляция сигналинга процессов апоптоза и аутофагии

Нейропротекция (органный, тканевой, клеточный и внутриклеточный уровень) Цели нейропротективной терапии острого периода инсульта: - ограничение зоны некроза и связанного с ним воспаления - обеспечение выживания нервной ткани зоны пенумбры Задачи: - устранение нейротрансмиттерного дисбаланса и блок глутаматной эксайтотоксичности - блокировка сигналов танатогенной программы некроза - усиление и/или замещение «естественной» антиоксидантной - защиты (связывание свободных радикалов и Fe 2+ и нивелирование каскадов вторичного оксидантного стресса при реперфузии) - торможение апоптоза клеток нервной ткани зоны пенумбры - тканевая иммунорегуляция с торможением иммуногенной цитотоксичности макрофагов - восстановление внутриклеточного, экстрацеллюлярного и тканевого гомеостаза (водно-солевой, буферный и энергетический баланс, молекулярный сигналинг)

Механизмы защиты нервной ткани (нейропротекция): 1. Антигипоксантная и антиоксидантная система: первая группа - жирорастворимые эндогенные антиоксиданты ( токоферолы, убихиноны, ретинолы, мелатонин ) вторая группа - антиоксидантные ферменты ( Zn-Cu-СОД, каталаза, глутатионредуктаза ) - соединения, содержащие тиоловые и селено-группы ( цистеин, метионин и цистин ) - гистидинсодержащие дипептиды ( карнозин, анзерин, гомокарнозин ) третья группа - антиоксидантные ферменты восстановления гидроперикесей до спиртов ( глутатионпероксидаза и глутатионтрансфераза ) четвертая группа - детоксикация Fe2+ ( церулоплазмин, трансферрин, ферритин и лактоферрин )

Механизмы защиты нервной ткани (нейропротекция): 2. Торможение сигналов апоптоза, за счет: - экспрессии пула нейрональных белков группы Bcl-2 - сигналинга факторов роста и нейротрофинов - активации программы аутофагии аутофагия может служить программой выживания клетки «Если вслед за активацией апоптоза в клетке будет запущен процесс аутофагии, то происходит отмена программируемой гибели» ( Kondo et al., 2005 ) - стимуляции шапероновых каскадов активизации протеасом с убиквитированием краудинговых белков острой фазы - активации глиальных и нейрональных транспортеров эксайтотоксических аминокислот глутамата и аспартата (GLAST, GLT и EAAC1,EAAT4 и EAAT5)

Семейство белков bcl-2 (B cell lymphoma gene-2 – ген В-клеточной лимфомы ) Антиапоптотические белки: Bcl-XL, Bcl-w, ced- 9, Mcl-1, Al, KSHV-Bcl-2 Проапоптотические белки: Bax (Bak, Bok (Mtd)) Bcl-xL, Регуляторные анти- и про- апоптотические белки pBCL2-типа-III или BH3-only (гомологичны белку Bcl-2 лишь по одному домену BH3) - Bid (BH3 interacting domain death agonist) - Bim (Bcl-2 nteracting mediator of cell death) - Bmf (Bcl-2 modifying factor) - Puma (p kDa promoter-upregulated modulator of apoptosis) - Bad (Bcl-2 antagonist of cell death) - Hrk (hara-kiri) - Noxa

Аутофагия индуцируется: -активными формами кислорода и ионизирующей радиацией -некоторыми противоопухолевыми препаратами -прекращением действия или дефицитом факторов роста -снижением содержания аминокислот и АТФ в цитозоле клетки Регуляция аутофагии осуществляется при помощи: С-Myc, mTOR, Atg 1, ГТФаза, Beclin-1, PTEN, E2F-киназа, LAMP-2, ферменты класса 1PI-3K/PKB ( PI3K, PtdIns4P, PtdIns(4,5)P2, PtdIns(3,4)P2, PtdIns(3,4,5)P3 ), и др.

Диффузная передача сигнала г. Луиджи Агнати и Кжел Фуксе дают определение объемной передачи (диффузия нейропередатчиков через объем нервной ткани) г. Дмитрий Кульман описывает «спиловер» глутамата: часть нейротрансмиттера, не смотря на обратный захват, покидает синаптическую щель и активирует рецепторы на соседних синапсах г. Владимир Парпура экспериментально продемонстрировал, что глутамат высвобождаемый астроцитами активирует нейроны г. Мария Усович с соавт., демонстрируют тоническую (постоянную) активацию внесинаптических ГАМК А рецепторов за счет внеклеточной ГАМК г. Алексей Семьянов описывает спиловер ГАМК, и ее возбуждающее действие ( как в эмбриогенезе )

Спиловер Спиловер ( spill – разливаться, over – через: перелив ) вытекание нейротрансмиттера из синаптической щели и распространение его во внеклеточном пространстве на некоторое расстояние Критическим событием запуска каспазного каскада апоптоза внутриклеточным кальциевым током через канал, сопряженный с NMDA-рецептором, является снятие Mg 2+ блока за счет K + / Na + тока, обусловленного активацией внесинаптических ионотропных рецепторов спиловерным GLU и/или ASP Апоптоз, обусловленный каспазным каскадом запускается: - для GLU – при концентрации в синапсе более 1 м Моль - для ASP – не определено ( 90% ASP переаминируется в митохондриях )

Транспортеры аспартата и глутамата Эпигенетическая активация глиальных и нейрональных транспортеров аспартата и глутамата значительно уменьшает объем поражения мозговой ткани при ишемическом инсульте за счет пресинаптического торможения выброса нейротрансмиттеров и их метаболической утилизации Астроглиальные: - глиальный транспортер глутамата и аспартата – GLAST (EAAT1) - глиальный транспортер глутамата – GLT-1 - транспортеры возбуждающих аминокислот EAAТ2 Нейрональные: - транспортеры возбуждающих аминокислот EAAТ2 - EAAT5 EAAT (excitatory amino acid transporter) Транспортеры Na+ зависимы, градиент Na+ и K+ является источником энергии для этого транспорта

Нейрогенез 1962 г. - Джохев Альтман описал пролиферацию нейронов в зрелом мозге ( Science 1962; 135, 1127 – 1128 ) 1989 г. - Фернандо Ноттеба показал резкое возрастание числа нейронов в ядрах мозга, связанных с вокализацией и обучением у канареек в период спаривания ( Scienti fic American : 74 – 9 ) 1998 г. - Р.Eriksson и соавт. впервые продемонстрировали образование новых нейронов в гиппокампе человека ( Nat. Med. 1998;4: 1313 – 1317 ) 1999 г. - Элизабет Гоулд с соавт. показали мозг высших приматов производит от 20 до 40 тысяч новых нейронов в день в течение всей жизни ( Science. 1999; 286(5439): ) В зубчатой извилине гиппокампа взрослого мозга образуется 9000 нейронов в сутоки (около 250 тысяч в мес.) Число новых нейронов, образующихся ежемесячно, составляет 6 % от общей популяции гранулярных клеток. (Н.Cameron и соавт.)

НЕЙРОГЕНЕЗ у взрослых организмов - важнейший механизм пластичности мозга: увеличение количества нейронов аксон- и дендритов- генез образование новых синапсов структурная перестройка нейрональных сетей изменение синаптической передачи

С наибольшей активностью делятся клетки лобных отделов боковых желудочков После деления дочерняя клетка растет и делится вновь на месте, вторая мигрирует, встраиваясь в сети нейронов При запуске нейрогенеза, клетки активно делятся в течение 24 часов ( Маркеры: CRAP, Nestin, Sox-2), затем в течение 7 дней процесс затухает (Маркеры:DSX, PSA-NSAM) Новые нейроны функционально встраиваются в сеть в течение 1 месяца, они меньше зрелых (Маркеры: Neu-N, Calbindin) Окончательно нейроны созревают спустя 4 мес.

Нейрогенез взрослого мозга регулируется: клетками нейрогенной ниши ( микроокружение – клетки сосудов глии ) факторами роста факторами дифференцировки гормонами нейромедиаторами цитокинами mi-RNA

Вещества влияющие на нейрогенез: Подавление: - глюкокортикоиды и вещества адреналовой группы ( реакция на стресс ) - опиаты - серотонин и дофамин (на нейрогенез в гиппокампе) Стимуляция: - факторы роста (опосредованно) - глутамат - дофамин, серотонин (в меньшей степени) - антидепрессанты (в гиппокампе) - пролактин (в субвентрикулярной зоне) - физические упражнения (двигательная активность) - обучение новым умениям

Современные подходы к патогенетической терапии острых нарушений мозгового кровообращения Нейропротекция: - антиооксиданты и ловушки свободных радикалов - ускорение утилизации внесинаптического глутамата - активация аутофагии Нейрорепарация: Нейрогенез Нейропластичность - торможение апоптоза нейробластов - активация аксон-, синапто- и дендритовгенеза - многоплоидность

Ежедневно: - мозг теряет до 30 – 50 тысяч нервных клеток (после достижения возраста 30 лет) - в мозге образуется около - 40 тыс. новых нейробластов из которых дифференцируются в нейроны – не более 9 тыс. для сравнения: ежедневно у человека гибнет около 2% клеток и столько же образуется вновь средний срок жизни клеток в тканях ( физиологическая регенерация ): - эритроциты (кровь) месяца - эпидермоциты (кожа) суток - гранулоциты (кровь) суток - энтероциты (тонкий кишечник) суток

Эмбриогенез - дифференцировка - апоптоз - пролиферация Репаративная регенерация - апоптоз поврежденных клеток - дедифференцировка - пролиферация и дифференцировка Канцерогенез - нарушение дифференцировки и апоптоза - пролиферация

ОРИГИНАЛЬНЫЙ ПРЕПАРАТ ЦЕЛЛЕКС белково-полипептидный комплекс, гидрофильная, слабо-анионная фракция эмбрионального головного мозга сельскохозяйственных животных (свиней) НОВЫЕ ПЕРСПЕКТИВЫ НЕЙРОФАРМАКОЛОГИИ НЕЙРОРЕПАРАНТ НЕЙРОПРОТЕКТОР

Фармакологическая группа: Код АХТ (Anatomical Therapeutic Chemical Classification System): - N06BX - психостимуляторы и ноотропные препараты - N07XX - прочие препараты для лечения заболеваний нервной системы - нейротропные средства - нейропротектор, ноотроп ( нейрометаболический стимулятор ) - органотропные средства - церебропротектор - регенеранты и репаранты - нейрорепарант Целлекс

Показания к применению Цереброваскулярные болезни: - нарушения мозгового кровообращения ишемического и геморрагического характера в остром и раннем реабилитационном периодах течения заболевания Противопоказания - эпилепсия, - маниакальный психоз, - продуктивный бред, - делирий - применение в период беременности и лактации (отсутствие исследований не позволяют примерять препарат у данного контингента пациентов )

Состав и физико-химические характеристики Состав: - нейтральные и слабо-отрицательные водорастворимые протеины и полипептиды с молекулярной массой к Да, - 50 мМ глициново-фосфатный буферный раствор, рН – 7,8 Действующее вещество: тканеспецифические белки и полипептиды - факторы роста, дифференцировки эмбриональной нервной ткани, сигнальные молекулы клеточных ядер, цитоплазмы и межклеточного матрикса, цитокины и шапероны Лекарственная форма: раствор для инъекций в концентрации 0,1 мг/мл

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ПРЕПАРАТ ЦЕЛЛЕКС группа: «модификатор биологических реакций» Факторы, регуляторы апоптоза: Проапоптозные белки - BH3-interacting domain death agonist Антиапоптозные белки - Bax inhibitor 1 Clusterin - мощное шапероноподобное и антиапоптотическое действие, защита белков от денатурации Putative inhibitor of apoptosis - белок группы ингибиторов апоптоза, регулируется NF-каппа В Beta-neoendorphin-dynorphin - антиапоптозный эффект, антиангинальное, антистрессовое действия

Регуляторы апоптоза - Apoptosis regulator Bcl-X WD repeat-containing protein 62 - трансдукция внутриклеточного сигнала и регуляция транскрипции в контроле клеточного цикла, аутофагии и апоптоза Protein quaking - усиление сигнала и активация РНК, РНК- связывающий белок, регулятор миелинизации, и провильной закладки сосудов, регулятор - подавитель апоптоза, датчик для жизни и смерти клетки NADH-ubiquinone oxidoreductase - регуляция апоптоза, запуск ферментов митохондрий электрон-транспортной цепи Cellular tumor antigen p53 - основоной белок-регулятор, активизирующийся при повреждении мембран, окислительном стрессе, осмотическом шоке, тепловом шоке, повреждение ДНК

Регуляторы аутофагии («ассенизации» клетки) Активаторы аутофагии - Bax inhibitor 1 Beclin-1 белок инициирующий аутофагию Блокаторы аутофагии - NF-kappa-B inhibitor-like protein 1 - ингибитор активности протеасом, Scavenger receptor class B member 1 - активация фагоцитоза апоптотических клеток Plasminogen activator inhibitor 1 - основной регулятор деградации фибрина и оборота внеклеточного матрикса Scavenger receptor class B member 1 - участие в фагоцитозе апоптотических клеток Clusterin - регулирование, опосредованное комплементом, лизиса клеток, утилизации мембран, межклеточной адгезии и SRC индуцированной трансформации, ингибитор комплемента.

Регуляторные цитокины: Иммунорегуляторы - Интерлейкины:- IL-6; IL-8; IL-12; IL-18 Регуляторы Са 2+ обмена: р 94 (эндоплазмин) - Са 2+ -связывающий белок эндоплазматического ретикулума Calpastatin - ингибитор Са 2+ -зависимых цистеинпротеаз Ficolin-1, -2 - взаимодействие с эластином, фибрином, в Са 2+ -связывании, фагоцитозе

Регуляторы стрессовых реакций и белков острой фазы NKG2-D type II integral membrane protein - активирует и стимулирует рецепторы, участвующих в иммунном связывании клеточные стресс-индуцируемых лигандов, регулирующая роль в дифференциации и выживания киллеров Kelch-like ECH-associated protein 1 - облегчает убиквитинирование и протеолиз Nrf2 ( главный регулятор антиоксидантного ответа ), активация - координированние антиоксидант и антивоспалительного ответа Desmin- регулятор аэробной интенсивности дыхания клетки Metallothionein-1A, 1E- активаторы глюкокортикоидов Beta-crystallin B1- регулятор клеточной архитектуры

Bestrophin-1 - регулятор внутриклеточной сигнализации кальция, бикарбоната, глутамата и ГАМК, регуляция торможения в гранулярных клеток мозжечка Beta-neoendorphin-dynorphin - антиангинальное, антистрессовое действие, антиапоптозный эффект A-Raf proto-oncogene serine/threonine-protein kinase - регулятор внутриклеточных сигнальных путей участвующие в трансдукции митогенных сигналов от клеточной мембраны к ядру Annexin A4 - антикоагулянтная активность и ингибирует активность фосфолипазы А2 Heat shock 70 kDa protein 1B, 6, Heat shock protein HSP 90-alpha

ШАПЕРОНЫ Классы (семейства) шаперонов: - Hsp ( малые шапероны ) - Hsp-32 ( появляющиеся на ответ клетки на тяжелые металлы ) - Hsp-40 ( кошаперон Hsp-70 и Hdj1 ) - Hsp-70 - Hsp-90 - Hsp-100 За 27 лет выпущено монографий и диссертаций Белки, поддерживающие существование других белков в оптимально-конформационной форме и участвующие в белковом транспорте Н.Pelham – unfoldase; J.Ellins (1987) – шаперон (от франц. – shaperoner)

Антиоксиданты Cytochrome P450 2E1, 3A29, 11B1, 17A1, 19 type I – III - катализаторы как монооксигеназных так и оксигеназных реакций, омега-окисление и перекисное окисление насыщенные жирные кислот, гидроксилирование стероидных гормонов, желчных кислот, холестерина, биосинтез простагландинов, ловушка АФК с окислением супероксидом Glutathione transferase omega-1 - антиоксидант, регулятор окислительно-восстановительного гомеостаза, функционирования глутатион- аскорбатного цикла

Ростовые факторы и нейротрофины Angiopoietin-1, -2 Glia-activating factor - дифференцировка олигодендроцитов Mast/stem cell growth factor receptor - регуляция выживания, пролиферации клеток, миграции и функции, активизирует путь Akt1, сигнализация с фосфорилированием PIK3R1, передача сигналов через GRB2 и активации РАН, RAF1 и МАР-киназ MAPK1/ERK2 и / или MAPK3/ERK1, активизация членов STAT семьи STAT1, STAT3, STAT5A и STAT5B, активация PLCG1, производства сигнальных молекул диацилглицерина и инозитол 1,4,5 – трифосфата NT-3 growth factor receptor - обеспечивает дифференцировку и выживание существующих нейронов, а также поддерживает рост и дифференцировку новых нейронов и синапсов, стимулирует и контролирует нейрогенез

Ростовые факторы и нейротрофины Transforming growth factor beta-3, - beta regulator 4, -beta-induced protein ig-h3 - TGF-beta - инициируют апоптоз в большинстве типов клеток, активируя сигнальные пути: SMAD или DAXX, регулируют работу иммунной системы блокируя активацию лимфоцитов и макрофагов mTOR Complex - белковый комплекс, который функционирует в качестве питательного вещества / энергии / датчик окислительно- восстановительного и контролирует синтез белка. mTOR 1 - raptor, mLST8, Sec13, GβL, и PRAS40 mTORC2 - GβL, rictor, mSin1 и protor Активируются факторами роста и аминокислотами, Регулируют синтез белка, пролиферацию клеток, организицию актинового цитоскелета, выживание клеток, метаболизм липидов

Нейроактивные стероиды и их рецепторные белки Нейростероиды вовлекаются в регуляцию роста нейронов, процессы миелинизации, регенерации и синаптогенеза -Глюкокортикоиды и их рецепторные белки (экспрессия ключевых генов синтеза моноаминов, определяющих активность нейромедиатрных систем дофаминергических, норадренергических и серотонинергических нейронов мозга) -половые стероиды и их рецепторные белки (действуют на мозг как нейротрофические факторы, стимулируя процессы формирования новых синапсов в гипоталамусе, гиппокампе и лобной коре Транспортеры эксайтотоксических аминокослот, глутамата и аспартата (GLAST, GLT и EAAC1,EAAT4 и EAAT5) Аквапорины-4 - мембранные белки, формирующие мембранные водные поры

первичное нейропротективное действие -регуляция нейромедиации с торможением возбуждающих нейротрансмиттеров вторичное нейропротективное действие - регуляция сигналов каспаз-зависимого и метаболического каскадов апоптоза - восстановление энергетического метаболизма, белкового и нуклеотидного синтеза в условиях ишемии - улучшение тканевой иммунорегуляции с торможением иммуногенной цитотоксичности макрофагов - активация аутофагии ( убиквитин-шаперонового каскада клиренса поврежденных молекул ) - МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ

восстановление регенеративного потенциала клеток мозга - прерывание апоптоза в зоне пенумбры, с уменьшением перифокального отека и очага некроза мозговой ткани - восстановление межклеточных взаимодействий - системное воздействие эмбриональных белково- полипептидных факторов с уменьшением диашизальной дизрегуляции - эпигенетическая стимуляцией экспрессии нейрональных генов - стимуляция нейрогенеза - обеспечение векторной миграции нейробластов к очагу повреждения и запуск дифференцировки после их роуминга - репрограммирование нейронов, астроцитов с образованием многоплоидных клеток

ИСТОРИЯ СОЗДАНИЯ 2006 г. - анализ материалов и принятие решения о начале работ 2007 г. - создании лаборатории репаративной медицины ЗАО «Фарм-Синтез» г. Москва 2007–2008 г.г. - доклинические исследования препарата «Целлекс» 2008 –2010 г.г. - клиничекие исследования I – III фазы 2011 г. - регистрация фармакологического препарата «Целлекс» ( регистрационное удостоверение ЛП от г.)

НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН Центр государственного санитарно-эпидемиологического надзора (г. Люберцы)

Аналитика полученной субстанции ЦЕЛЛЕКС фореграмма субстанции Целлекс 5%-ный полиакриламидный гель 2-я и 9-я дорожки – маркеры молекулярных масс (начиная сверху): к Да к Да - 95 к Да - 72 к Да - 55 к Да - 36 к Да - 28 к Да - 17 к Да -10 к Да

Технические предпосылки к проведению фармакокинетических исследований многокомпонентных белково-пептидных комплексов Флуоресцентное мечение белков и полипептидов препарата Целлекс активированным эфиром красителя Cy5 производства BioDye

Спектры флуоресценции Cy5-меченых белков и полипептидов препарата Целлекс Синяя линия – спектр возбуждения флуоресценции, регистрируемой при 695 нм. Красная линия – спектр эмиссии, возбуждаемой при 630 нм.

Исследование препарата белков Целлекса, меченых красителем Cy5, методом SDS гельэлектрофореза

Исследование основных фармакокинетических параметров Целлекса

а- натуральная шкала Кинетические кривые Целекса в органах животных после его внутрибрюшинного введения в дозе 1 мг/кг б - шкала полулогарифмическая

Фармакокинетические параметры Целлекса Внутрибрюшноное введение Целлекса лаб.животным: -очень быстрое всасывание препарата из брюшной полости Т max - 0,25 часа и С max в плазме крови - 7,24 нг/мл -препарат определяется в плазме крови на протяжении 32 ч -период полуэлиминации (t 1\2el ) составляет - 30,34 ч -среднее время удерживания вещества в организме (MRT) - 18,4 ч (относится к классу в-в средней продолжительности действия) Основные фармакокинетические параметры, рассчитаны модельно-независимым методом (программа «PK-SOLVER»)

В е л и ч и н ы т к а н е в о й д о с т у п н о с т и и и н т е н с и в н о с т ь п р о н и к н о в е н и я хорошо васкуляризированные ткани – печень, почки, вилочковая железа и легкие умеренно васкуляризированные ткани – кишечник и мозг Целекс регистрируется во всех исследуемых органах и тканях Снижение концентраций препарата носит моно- экспоненциальный характер

Тканевая доступность Целекса зависит от механизма тканевой специфичности и не связана с липофильностью исследуемого соединения Время достижения максимальной концентрации (T max ) Целекса практически во всех органах составляет 4 часа в мозге и печени T max составило – 0,25 и 2 часа, соответств. Отношения значений AUC 0-t к параметру AUC o- для органов и ткани составляет более 99 процентов, что свидетельствует полноту описания фармакокинетических процессов Целекса в исследуемых органах и тканях

Биодоступность Целекса несколько правильных, «каверзных» вопросов: - подкожное введение средних и тяжелых по массе белков белков сохранность целостности и активности молекул - сохранность целостности и активности молекул во время транспортировки и прохождения во время транспортировки и прохождения ферметативно-актиивной среды легких ферметативно-актиивной среды легких проницаемость гемато-энцефалического - проницаемость гемато-энцефалического барьера для крупных белковых молекул барьера для крупных белковых молекул Только на неправильные вопросы есть ответ, на правильные вопросы ответа нет. Кришнамурти

подкожное введение средних и тяжелых по массе белков: -во многом вынужденная мера из-за наличия в гидрозоле коагулята - более «плавное» действие препарата - относительно неплохая комплаентность по сравнению с другими лек. формами (п/к + фильтр) - широкие возможности по выбору места «укол прямо в голову» инъекции (возможен «укол прямо в голову»)

сохранность целостности и биологической активности во время транспортировки: -фармакокинетические параметры распределения и связывания белков показывают, что их большая часть транспортируется на клетках крови - лимфоцитах ( всегда в очаге воспаления или аутоиммунной реакции ) - многие тканеспецифические «забарьерные» белки, если не являются иммуногенами, не подвергаются протеолизу или активации вне органа мишени - эмбриональное происхождение позволяет «улизнуть» от протеаз из-за специфичности

Проницаемость гемато-энцефалического барьера для крупных белковых молекул: - при стрессе (дистрессе) и многих пота биохимических каскадах проницаемость ГЭБ увеличивается в разы - для многих крупных и очень крупных функциональных белков существует активный транспорт - лимфоциты - удобный транспорт к очагу воспаления или аутоиммунной реакции ГЭБ отсутствует: дно IV желудочка, эпифиз субкомиссуральный орган субфорникальный орган нейрогипофиз lamina affixa

Адекватность дозы Целлекса 0,1 мг п/к -минимально работающая доза Целлекса, по данным доклинических исследований - 0,05 мг /сут. - оптимально эффективная доза составила 0,1 мг/сут. -по данным клинических исследований III фазы, дозы: п/к - 0,1 мг для больных средней тяжести и - 0,2 мг для тяжелых больных были эффективно-достаточны Расчет и перерасчет доз для клинических испытаний проводился по массе и площади поверхности тела. Дозозависимый эффект в доклинических исследованиях, как побочное действие, удалось получить в виде гиперактивности и изменении социального поведения при 20-кратном увеличении дозы

Световая поляризующая томографтия Исследование некоторых фармакокинетических праметров и фармакодинамики препарата «Целлекс», меченного FITC (флуоресцина изотиоцианат) Внутрибрюшинное введение, в дозе 1 мг/кг через 1 час, после экспериментального мозгового инсульта ( самец крысы 250 г )

Фармакодинамические исследования меченного Целлекса

ЦЕЛЛЕКС не обладает эмбриотоксическим и тератогенным действием. Не влияет на постнатальное развитие потомства, способность к спариванию, оплодотворению и репродуктивную функцию самок и самцов крыс. Мутагенность - тест Эдамса Salmonella/микросомы на индукцию генных мутаций - цитогенетическая активность на индукцию микроядер (в полихроматофильных эритроцитах костного мозга мышей) препарат ЦЕЛЛЕКС не обладает мутагенной активностью Исследование на наличие прионовых инфекций Не обнаружены

Исследование канцерогенности (белые мыши, терапевтическая и 10-кратная доза, внутрибрюшинное разовое, 5-ти дневное, однократное введение в сутки) - тест на индукцию ДНК – повреждений - тест на индукцию хромосомных аббераций - метод ДНК-комет (гель-электрофореза отдельных клеток) Получено статистически значимое, достоверное снижение уровня ДНК-повреждений в ткани головного мозга, печени и клетках крови. В тесте на индукцию хромосомных аббераций отмечено достоверное снижение цитогенетического эффекта мутагена.

Исследования биологической активности препарата Целлекс на культивируемых нормальных клетках. исследования влияния препарата Целлекс на выживание лимфоцитов донорской крови Через 24 часа добавление Целлекса снижает количество лимфоцитов на 20-30%. К 96-ти часам при низких дозах препарата наблюдается увеличение и снижение их числа до 40% при увеличении в среде концентрации Целлекса

Исследования биологической активности препарата Целлекс на культивируемых опухолевых клетках. Анализ подавления роста клеток Т-клеточного острого лимобластного лейкоза человека Molt 4 (А) и Jurkat (Б) через 24 и 48 часов после добавления препарата Целлекс

Исследования биологической активности препарата Целлекс на культивируемых нормальных и опухолевых клетках. Целлекс не стимулирует опухолевой рост, что доказано на 12 клеточных линиях, включая 4 линии глиобластомы. Доказана стимуляция процессов регенерации и пролиферации, синтеза белка и ДНК в нормальных клетках

Фотографии роста фибробластов на фоне бычьего сывороточного альбумина, эмбриональной телячьей сыворотки и Целлекса отмечается формирование длинных отростков – ликоподий

Фотографии фибробластов на большом увеличении из эксперимента и монтаж, иллюстрирующий длину формирующихся в присутствие препарата отростков Клетки, инкубированные в присутствие препарата Целлекс формируют тонкие длинные отростки.

Влияние Целлекса на рост эксплантатов нервной ткани куринных эмбрионов ( модель биологической активности ) Пролиферация нервных клеток куриного эмбриона (Контроль) Пролиферация нервных клеток куриного эмбриона (Целлекс)

Модель ишемического повреждения мозга методом двустороннего фотоиндуцированного тромбоза Животных наркотизируют хлоралгидратом, фотосенсибилизирующий краситель вводят в яремную вену, после продольного разреза удаляют надкостницу и фиксированную в стереотаксисе голову облучают холодным светом вызывая развитие инфаркта мозга с возможностью воспроизведения локализации и объема поражения из опыта в опыт.

Изучение протективных свойств препарата ЦЕЛЛЕКС® 1. Исследование когнитивных нарушений (сохранность и воспроизведение УРПИ – условного рефлекса пассивного избегания) 2. Изучение морфометрических характеристик (измерение площади и объема очага повреждения в префронтальной коре)

Сохранность УРПИ в разных группах (сохранность УРПИ на 6-е сутки после фотоиндуцированного инфаркта мозга в трех исследуемых группах животных) Группа животных После фототромбоза Ложно оперированные 100% Группа контроля (получали р-р NaCl 0,9%) 33% Группа Целлекс 88%

Результат морфометрических измерений очага поражения в сравниваемых группах Объем очага повреждения коры определяли по формуле: V = (Snd), где d - толщина пары срезов (200 мкм); Sn – измеренная площадь ишемического очага серийного среза в мм; - сумма объемов ишемического повреждения на срезах. Объем очага поражения в группе «леченной» физ. раствором 8,3+2,5 мм³ Объем очага поражения в группе леченной Целлексом 5,9+1,5 мм³

Объемная реконструкция очага ишемического поражения, полученная с помощью наложения серии последовательных срезов мозга, позволяет лучше представить размер повреждения Без лечения (физ. р-р) На фоне лечения Целлексом

Мофологические изменения нейронов, находящихся в переходной зоне (пенумбре) между очагом ишемического некроза и нормальной нервной тканью. Контроль окраска по Нисслю Группа Целлекс окраска по Нисслю

Изучение влияния препарата Целлекс на выживаемость животных в условиях перевязки сонных артерий (модель неполной глобальной ишемии мозга) Группа 1 - контрольные животные после перевязки сонных артерий, получавшие физиологический раствор 0,5 мл на крысу через 1 час и 0,5 мл на крысу через 5 часов после перевязки сонных артерий Группа 2 – ложно оперированные животные, у которых проводились те же манипуляции, что и у контрольных, только без перевязки сонных артерий, которым вводили физиологический раствор 0,5 мл на крысу через 1 час и 0,5 мл на крысу через 5 часов Группа 3 - животные после перевязки сонных артерий, которым вводили Целлекс в дозе 0,5 мл 0,1% раствора (0,2 мг/кг) на крысу через 1 час и 0,5 мл на крысу через 5 часов.

Влияние препарата Целлекс на выживаемость крыс в условиях перевязки обеих сонных артерий Группы животных ВыжившиеУмершие 1 группа Контроль (24 крысы) 9 из 24 (37%) 15 из 24 (63%) 2 группа 10 из 12* (83%) 2 из 12 (17%) Ложно оперированные (12 крыс) 3 группа 34 из 36* (95%) 2 из 36 (5%) Целлекс 0,2 мг/кг (36 крыс) *-Р<0,01 по сравнению с контролем.

Исследование нейропротективных свойств препарата Целлекс при глутаматной токсичности (in vitro) Окраска трипановым синим Культура 7-дневных нейронов (клеток зерен мозжечка) обработанных глутаматом в концентрации 25 мкМ (15 мин) с последующей экспозицией 4 часа в СО - инкубаторе для развития нейродегенерации. Оценка жизнеспособности нейронов проводится с помощью подсчета нейронов с нормальной морфологией на фиксированных препаратах. Защитный эффект исследуется как коэффициент эффективности защиты (КЭЗ) по формуле: КЭЗ=(Nо-Nв)/Nо x 100%, Где Nо– средний процент гибели нейронов от повреждающего воздействия глутамата в культурах с добавлением НО, Nв - средний процент гибели нейронов в культурах с добавлением Целлекса.

Целлекс оказывает защитный эффект, повышая выживаемость зернистых нейронов мозжечка с 54,97 ± 6,5% до 72,76 ± 9,7% Контроль (Глутамат) Целлекс (Глутамат+Целлекс)

Изучение влияния препарата Целлекс-дейли на когнитивные функции крыс с экспериментальным перинатальным гипоксически-ишемическим повреждением головного мозга Модель по методу J.Rice в модификации H. Hattori с соавт. (1989) и P. Schvartz (1992) включает в себя постоянную окклюзию общих сонных артерий у 7-дневных крысят с последующим помещением их в атмосферу с низким содержанием кислорода Модель внутриутробной асфиксии плода по B. Lubec (1997) наиболее соответствует этиопатогенезу гипоксически-ишемического повреждения ЦНС человека (асфиксия в родах)

активирует процессы физиологической и репаративной регенерации нервной ткани, тем самым предотвращая необратимые изменения, возникшие после острого гипоксически ишемического повреждения головного мозга новорожденного увеличивает выживаемость крысят в условиях полной окклюзии сонных артерий почти в 5 раз по сравнению с контролем достоверно улучшает показатели двигательно- координационной сферы, оцененной в тесте «Ротарод» по времени удержания на вращающемся барабане Улучшению долговременной рабочей памяти, оцененной в тесте «Пассивное избегание» по сохранности пассивно-оборонительного навыка

ОРИГИНАЛЬНЫЙ ПРЕПАРАТ ЦЕЛЛЕКС НОВЫЕ ПЕРСПЕКТИВЫ НЕЙРОФАРМАКОЛОГИИ НЕЙРОРЕПАРАНТ НЕЙРОПРОТЕКТОР Соколов М. А. - научный руководитель лаборатории репаративной медицины АО «ФАРМ-СИНТЕЗ» г. Москва

CEL – 09 «Многоцентровое сравнительное открытое клиническое исследование эффективности и безопасности препарата Целлекс в лечении больных с острым нарушением мозгового кровообращения» 2010 г.

Участники исследования Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова» Министерства обороны Российской Федерации Санкт-Петербургское Государственное бюджетное учреждение здравоохранения «Городская многопрофильная больница 2» Муниципальное учреждение здравоохранения г. Ярославля «Клиническая больница 8» Муниципальное учреждение здравоохранения «Кемеровский кардиологический диспансер» Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Муниципальное учреждение здравоохранения «Подольская городская клиническая больница».

Цели исследования Оценка эффективности и безопасности применения препарата Целлекс на фоне базисной терапии у больных с ОНМК в остром и раннем восстановительном периодах инсульта. Определение влияния препарата Целлекс на динамику и сроки восстановления утраченных функций у больных с ОНМК на фоне базисной терапии в остром и раннем восстановительном периодах инсульта.

Задачи исследования Оценка влияния терапии Целлексом на показатели выживаемости больных с острым нарушением мозгового кровообращения на фоне базисной терапии по каждой группе пациентов. Определение влияния препарата Целлекс на динамику регресса очаговой неврологической симптоматики и степень функционального восстановления больных с острым нарушением мозгового кровообращения на фоне базисной терапии каждой группы по следующим баллированным шкалам: Шкала Комы Глазго; Шкала Инсульта (NIHSS); Опросник Речи; Тест Информация – Память – Концентрация внимания. Определение безопасности и тяжести побочных эффектов Оценка результатов исследования, согласно критериям эффективности и безопасности протокола.

Дизайн исследования Многоцентровое сравнительное открытое клиническое исследование. III фаза Количество пациентов 180 пациентов с острым нарушением мозгового кровообращения

Критерии включения Мужчины в возрасте от 35 до 80 лет включительно Женщины в возрасте от 55 до 80 лет включительно, находящиеся в постменопаузальном периоде не менее 2-х лет Больные, подписавшие письменное информированное согласие или их ближайшие родственники (при крайней тяжести пациента) Больные с установленным диагнозом острого нарушения мозгового кровообращения ишемического или геморрагического характера в соответствии с критериями МКБ-10, подтвержденным КТ или МРТ головного мозга, госпитализированные в течение первых суток от развития заболевания

Критерии исключения 1 Крайняя тяжесть пациента с уровнем сознания ниже 5 баллов по Шкале Комы Глазго Регресс неврологической симптоматики в течение первых 24 часов от начала заболевания (транзиторная ишемическая атака) Невозможность введения исследуемого препарата в виде интратекальной инъекции по причине: - наличия абсолютных противопоказаний к проведению лечебно- диагностической люмбальной пункции - наличия положительной динамики в неврологическом статусе и уменьшения выраженности общемозговой симптоматики (при тяжести по суммарной шкале комы Глазго 8 и выше пациент переводится на подкожное введение препарата) - отсутствия заполненной и подписанной формы ИС

Критерии исключения 2 Наличие у пациента заболеваний или состояний, указанных в противопоказаниях к назначению препарата Целлекс ( эпилепсия, маниакальный психоз, продуктивный бред, делирий ) Наличие в анамнезе анафилактических реакций на препараты белковой природы ( альбумин, плазма крови, иммуноглобулины, сыворотки ) Наличие злокачественного новообразования Острые и/или хронические бактериальные и вирусные заболевания в стадии обострения Аутоиммунные заболевания в стадии декомпенсации, сопровождающиеся системным васкулитом; Хроническая печеночная или почечная недостаточность в стадии обострения Выраженная или неконтролируемая патология сердца Предшествующая нейротропная метаболическая терапия в течение 14 дней перед госпитализацией пациента

Способ введения и режим дозирования препарата Целлекс Исследуемый препарат Целлекс в лекарственной форме раствора для подкожного (п/к) или интратекального (и/т) введения применялся на фоне стандартизированной базисной терапии: а) по 0,1 мг, 1 раз в сутки, п/к, первые 10 дней и с 21-х по 27 сутки заболевания, при тяжести пациента по суммарной шкале комы Глазго не ниже 12 б) по 0,2 мг, 1 раз в сутки, п/к, первые 10 дней и по 0,1 мг, 1 раз в сутки, п/к, с 21-х по 27 сутки заболевания, при тяжести пациента по суммарной шкале комы Глазго не выше 12 в) по 0,1 мг, на третьи и шестые сутки интратекально, пациентам, включенным в исследование при соблюдении следующих условий: - тяжесть пациента по суммарной шкале комы Глазго ниже 8 - отсутствие у пациента регресса общемозговой симптоматики, или ее нарастание от момента поступления - отсутствие положительной динамики в неврологическом статусе от момента поступления - наличие показаний и отсутствие абсолютных противопоказаний к проведению лечебно-диагностической люмбальной пункции; - наличие заполненной и подписанной формы ИС

Запрещенная сопутствующая терапия Все препараты, не входящие в стандартизированную базисную терапию, прямо или косвенно влияющие на сосудистую и нервную системы, реологические свойства крови, основной метаболизм, обладающие нейротропным, антигипоксантным действием были запрещены к применению на протяжении всего срока исследования

Критерии эффективности Показатели выживаемости больных с острыми нарушениями мозгового кровообращения Динамика объема очага по данным КТ или МРТ головного мозга Динамика изменения неврологического статуса согласно Шкале NIHSS Динамика двигательных нарушений по Шкале Инсульта (NIHSS) Динамика нарушений высших корковых функций по Тесту Информация – Память – Концентрация внимания и Опроснику Речи Динамика лабораторных показателей коагулограммы Динамика лабораторных и биохимических показателей ликвора Динамика скоростных параметров кровотока по данным ТКДГ и ДС сосудов головного мозга с эмболодетекцией

Безопасность Безопасность препарата оценивалась по частоте возникновения нежелательных явлений и их связи с применяемой терапией в каждой группе пациентов Для отслеживания нежелательных явлений применялись следующие методы: физикальное обследование, оценка показателей жизненно важных функций, ЭКГ, лабораторные исследования (общеклинический и биохимический анализы крови и ликвора, анализ мочи) Все нежелательные явления регистрировались в форме учета НЯ. О возникновении серьезных НЯ, в соответствии с рекомендациями, извещались регуляторные органы (Росздравнадзор, Комитет по Этике Росздравнадзора)

Клиническая характеристика больных Исследуемую группу составили 180 больных: пациентов (81,7 %) группа ишемического инсульта - 33 пациента (18,3%) группа геморрагического инсульта Согласно утвержденным критериям включения, - 90 больных (50%), подписавших информированное согласие получали препарат Целлекс на фоне унифицированной базисной терапии - 90 больных (50%), получавших базисную терапию вошли в контрольную группу

Распределение больных в группе Целлекс Группа Целлекс 90 пациентов средний возраст 61,4 + 9 Мужчины 57 (63,3%) Женщины 33 (36,7%) Легкая степень тяжести Средняя степень тяжести Тяжелая степень 19 (21,1%) 49 (54,5%)22 (24,4%) Ишемический инсульт 71 (78,9%) Геморрагический инсульт 19 (21,1%) Мужчины 48 (67,6%) Женщины 23 (32,4%) Мужчины 9 (47,4%) Женщины 10 (52,6%) ЛСМАПСМАВББЛППП Субарахн. кровоизл. 32 (45,1%)28 (39,4%)11 (15,5%)9 (47,4%) 1 (5,2%) Легкая ст. тяжести Средняя ст. тяжести Тяжелая степень Легкая ст. тяжести Средняя ст. тяжести Тяжелая степень 17 (23,9%)43 (60,6%)11 (15,5%)4 (21%)6 (31,6%)9 (47,4%)

Распределение больных в контрольной группе Контрольная группа 90 пациентов средний возраст 62,2 + 8,9 Мужчины 52 (57,8%) Женщины 38 (42,2%) Легкая степень тяжести Средняя степень тяжести Тяжелая степень 36 (40%)44 (49%)10 (11%) Ишемический инсульт 76 (84,4%) Геморрагический инсульт 14 (15,6%) Мужчины 44 (57,9%) Женщины 32 (42,1%) Мужчины 8 (57,1%) Женщины 6 (42,9%) ЛСМАПСМАВББЛППП Субарахн. кровоизл. 31 (40,8%)30 (39,5%)15 (19,7%)9 (64,3%)5 (35,7%)0 Легкая ст. тяжести Средняя ст. тяжести Тяжелая степень Легкая ст. тяжести Средняя ст. тяжести Тяжелая степень 31 (40,8%)37 (48,7%)8 (10,5%)5 (35,7%)7 (50%)2 (14,3%)

Клиническая характеристика больных Полное 4-х недельное исследование закончили 178 больных Летальность составила - 4,4%

Влияние препарата Целлекс на динамику и сроки восстановления утраченных функций

Динамика изменений суммарного клинического балла по Шкале Инсульта NIHSS

Динамика изменений клинического балла двигательной сферы по Шкале Инсульта NIHSS

Динамика изменений суммарного клинического балла по Шкале Инсульта NIHSS в зависимости от характера инсульта

Динамика изменений суммарного клинического балла по Шкале Инсульта NIHSS в зависимости от характера и тяжести инсульта

Динамика изменений суммарного клинического балла в Тесте Информация – Память – Концентрация внимания

Нежелательные явления Анализ полученных результатов исследования показал, что за весь десятидневный курс применения препарата Целлекс в остром периоде инсульта и повторный курс в раннем реабилитационном периоде с 21 по 28 сутки, у всех пациентов различной степени тяжести, отличающихся как характером, так и локализацией сосудистого поражения головного мозга, серьезных нежелательных явлений отмечено не было.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ И ВЫВОДЫ Применение препарата Целлекс в остром и раннем реабилитационном периоде как ишемического, так и геморрагического инсульта, особенно в группах пациентов со среднетяжелым и тяжелым течением заболевания, приводит к выраженному регрессу общемозговой и очаговой неврологической симптоматики, с достоверной положительной динамикой клинического балла по Шкале Инсульта и Опроснику Речи.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ И ВЫВОДЫ В ходе клинического исследования серьезных нежелательных явлений, связанных с применением препарата Целлекс, а также каких-либо побочных реакций не выявлено, что свидетельствует о его безопасности при использовании в исследуемых дозах

ЗАКЛЮЧЕНИЕ И ВЫВОДЫ ЗАКЛЮЧЕНИЕ И ВЫВОДЫ На основании полученных данных, препарат Целлекс 0,1 мг и 0,2 мг рекомендован к применению в остром и раннем реабилитационном периоде острых нарушений мозгового кровообращения.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ И ВЫВОДЫ Таким образом, данные сравнения динамики баллов, полученные при использовании международных клинических шкал для групп сравнения, позволяют сделать выводы о достаточно высокой эффективности препарата Целлекс в остром периоде инсульта Применение препарата позволяет значительно ускорить регресс общемозговой симптоматики, двигательных и речевых нарушений у всех групп пациентов различной степени тяжести, отличающихся как характером, так и локализацией сосудистого поражения головного мозга.

ДВОЙНОЕ СЛЕПОЕ ПЛАЦЕБО КОНТРОЛИРУЕМОЕ РАНДОМИЗИРОВАННОЕ МУЛЬТИЦЕНТРОВОЕ КЛИНИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРЕПАРАТА ЦЕЛЛЕКС В ЛЕЧЕНИИ БОЛЬНЫХ С ОСТРЫМ НАРУШЕНИЕМ МОЗГОВОГО КРОВООБРАЩЕНИЯ ПО ИШЕМИЧЕСКОМУ ТИПУ протокол TSEL-IV-2013

8 исследовательских центров пациентов 1. Государственное учреждение здравоохранения города Москвы «Городская клиническая больница 12 Департамента здравоохранения города Москвы» 2. Санкт-Петербургское государственное бюджетное учреждение здравоохранения «Городская больница 26» 3. Муниципальное бюджетное учреждение здравоохранения города Новосибирска «Городская клиническая больница 1» г. Новосибирск 4. Муниципальное бюджетное учреждение здравоохранения «Городская клиническая больница 6 им. Н.С. Карповича» г. Красноярск 5. Государственное бюджетное учреждение здравоохранения Нижегородской области "Городская клиническая больница 5», Нижегородского района г. Нижнего Новгорода. 6. Министерство здравоохранения Челябинской области, Государственное бюджетное учреждение здравоохранения «Областная клиническая больница 3 (ГБУЗ «ОКБ 3») г. Челябинск 7. Бюджетное учреждение здравоохранения «Воронежская областная клиническая больница 1» г. Воронеж 8. Государственное учреждение здравоохранения «Городская клиническая больница скорой медицинской помощи 25» г. Волгоград

ОСНОВНЫЕ ЦЕЛИ Контролируемая оценка эффективности (по клиническим показателям) применения препарата Целлекс у больных в остром и раннем реабилитационном периоде инсульта Определение влияния препарата Целлекс на динамику и сроки восстановления утраченных функций больных с острым нарушением мозгового кровообращения на фоне стандартной терапии в остром периоде ишемического инсульта по сравнению с плацебо на фоне стандартной терапии в остром периоде ишемического инсульта.

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ЦЕЛИ Определение количества, частоты и тяжести нежелательных явлений (НЯ), связанных или возможно связанных с исследуемым препаратом, требующих прекращения терапии Оценка общего числа, частоты развития субъективных НЯ на основании опроса и жалоб больных, получавших исследуемый препарат Определение частоты развития объективных НЯ на основании данных клинического, лабораторного и инструментального обследования

КРИТЕРИИ ВКЛЮЧЕНИЯ Пациенты: мужского пола в возрасте от 35 до 80 лет с ОНМК по ишемическому типу; женского пола в возрасте от 45 до 80 лет, с острым нарушением мозгового кровообращения по ишемическому типу, находящиеся в постменопаузальном периоде Пациенты с установленным диагнозом ОНМК ишемического характера (как в каротидном, так и в вертебро-базилярном бассейне) в соответствии с критериями МКБ-10, подтвержденным КТ или МРТ головного мозга, госпитализированные в течение первых 48 часов от начала заболевания, подписавшие информированное согласие Пациенты с установленным диагнозом ОНМК с уровнем сознания не ниже поверхностной комы (по Шкале Комы Глазго 9 баллов и более; индекс по шкале Карновского 20 баллов и выше; по шкале инсульта NIHSS в разделах 1a+1b+1c в сумме 4 балла и меньше) Шкалы: Тест Информация - Память - Концентрация внимания, Опросник Речи, Мока-тест, краткая шкала оценки психического статуса (Mini- Mental State Examination) - не влияли на включение или невключение пациента в исследование

КРИТЕРИИ НЕВКЛЮЧЕНИЯ - Крайняя тяжесть пациента с уровнем сознания ниже 9 баллов (Шкала Комы Глазго) и/или индекс ниже 20 баллов (шкала Карновского) и/или в разделах 1a+1b+1c в сумме более 4 баллов по шкале инсульта NIHSS (поверхностная кома и ниже по отечественной классификации) - Регресс неврологической симптоматики в период до первого введения исследуемого препарата или препарата контроля (плацебо) - Наличие у пациента заболеваний или состояний, указанных в противопоказаниях к назначению препарата Целлекс: эпилепсия, маниакальный психоз, продуктивный бред, делирий - Наличие в анамнезе анафилактических реакций на препараты белковой природы (альбумин, плазма крови, иммуноглобулины, сыворотки) - Индекс массы тела: ИМТ 19; ИМТ 30 - Злокачественные новообразования, Острые и/или хронические бактериальные и вирусные заболевания в стадии обострения, Аутоиммунные заболевания в стадии обострения, сопровождающиеся системным васкулитом, Хроническая печеночная или почечная недостаточность в стадии декомпенсации, Выраженная или неконтролируемая патология сердца, Хр. алкоголизм, наркомании, злоупотребления лекарственными препаратами в анамнезе, Острые инфекционные заболевания в течение 2 недель до начала клинического исследования, Хирургические вмешательства, произведенные менее чем за 2 недели до начала клинического исследования - Отсутствие достоверных данных о наступлении постменопаузального периода (для пациенток) - Участие в любом другом клиническом исследовании в течение последних 3 месяцев.

КРИТЕРИИ ИСКЛЮЧЕНИЯ Возникновение у пациента, включенного в исследование, СНЯ или НЯ, связанных с применением препарата Обострение хронических сопутствующих заболеваний и/или их декомпенсация Возникновение выраженных анафилактических реакций, не связанных с приемом исследуемого препарата Отказ пациента или его/её ближайших родственников от дальнейшего участия в исследовании, а также неспособность или нежелание выполнять условия участия в исследовании Выявление анамнестических или клинических данных, входящих в перечень «Критерии невключения» данного протокола Применение препаратов, не разрешённых данным протоколом

- Препарат Целлекс вводился подкожно, по 0,1 мг (1 мл) один раз в сутки, утром или днем, в течение 10 дней, начиная с первого дня включения пациента в исследование в дополнение к проводимой терапии - Плацебо (р-р натрия хлорида 0,9%) вводился подкожно по 1,0 мл один раз в сутки, утром или днем, в течение 10 дней, начиная с первого дня включения пациента в исследование, в дополнение к проводимой терапии

Распределение больных по возрасту, полу, степени тяжести, характеру и бассейну поражения в контрольной группе

Распределение больных по возрасту, полу, степени тяжести, характеру и бассейну поражения в группе Целлекс

КРИТЕРИИ ЭФФЕКТИВНОСТИ Первичные: Определение % пациентов с прогредиентным, ремиттирующим и регрессирующим течением заболевания по динамике изменения неврологического статуса согласно оценочным баллированным шкалам: шкале Инсульта (NIHSS) и шкале Карновского по каждой группе пациентов Вторичные: Оценка динамики регресса общемозговых, чувствительных и двигательных, речевых нарушений по шкале Инсульта (NIHSS) в каждой группе пациентов Оценка динамики регресса нарушения высших корковых функций по Тесту Информация - Память - Концентрация внимания и Опроснику Речи, Монреальской шкале оценки когнитивных функций или Мока-тесту, краткой шкале оценки психического статуса (Mini-Mental State Examination) в каждой группе пациентов

Распределение по типу течения инсульта в % для всей выборки по NIHHSS (p < 0,001)

Изменение среднего балла по шкале Карновского от 1-х к 21-м суткам лечения в группах сравнения (p < 0,05) Для всей выборки (n 480) Для подгруппы Тяжелый инсульт (n 39)

Динамика среднего балла по NIHHSS (суммарный бал) от V0 к 21-м суткам лечения (p < 0,001) Для всей выборки (дельта 10%) (n 480) Для выборки 0-12 часов (дельта > 25%) (n 149)

Динамика среднего балла по NIHHSS (суммарный бал) от V0 к 21-м суткам лечения. Для подгруппы ВБС (p < 0,05) Для всей выборки (n 138) Для выборки 0-12 часов (n 48)

Динамика среднего балла по NIHHSS (суммарный бал) от V0 к 21-м суткам лечения (p < 0,001) Для всей выборки (n 480) Для подгруппы Тяжелый инсульт (n 39)

Динамика среднего балла по NIHHSS (двигательные нарушения) от V0 к 21 суткам лечения (p < 0,01) Вся выборка (n 480) Подгруппа Тяжелый инсульт (n 39)

Динамика среднего балла по NIHHSS (чувствительность) от V0 к 21 суткам лечения. Вся выборка n 480 (p < 0,05)

Динамика среднего балла по NIHHSS (Речь) от V0 к 21 суткам лечения (p < 0,01) Вся выборка (n 480) на 12% Группа 0-6 часов (n 67) на 26%

Динамика среднего балла по тесту «Опросник речи» от V0 к 21 суткам лечения. (p < 0,01) Вся выборка (n 480) Включая пациентов с легкими речевыми нарушениями и без таковых Группа с выраженными речевыми нарушениями (от 2 до 10 баллов) (n 24) на 20%

Динамика среднего балла по тесту «Опросник речи» от V0 к 21 суткам лечения. В группе пациентов с тотальной афазией (мутизмом) 0-1 балл на V0 (p < 0,01) Прирост балла к V4, почти в три раза больше чем в группе контроля

Динамика среднего бала по тесту «ИНФОРМАЦИЯ-КОНЦЕНТРАЦИЯ ВНИМАНИЯ – ПАМЯТЬ» (n 480, p < 0,01)

Динамика среднего бала по тесту «ИНФОРМАЦИЯ-КОНЦЕНТРАЦИЯ ВНИМАНИЯ – ПАМЯТЬ» Для пациентов легкой и средней тяжести, исходно без речевых нарушений (n 245, p < 0, 01) Прирост в контроле на 14,8%. Прирост в группе Целлекс на 24%

Динамика среднего бала по тесту «Монереальская шкала когнитивной оценки» (MoCA) для пациентов легкой и средней тяжести, исходно без речевых нарушений (n 245, p < 0, 05)

Динамика среднего бала по тесту «Краткая шкала оценки психического статуса» (MMSE) Для пациентов легкой и средней тяжести, исходно без речевых нарушений (n 245, p < 0, 01) 28 – 30 – нет нарушений когнитивных функций; 24 – 27 – пред дементные когнитивные нарушения; 20 – 23 – деменция легкой степени выраженности; 11 – 19 – деменция умеренной степени выраженности; 0 – 10 – тяжёлая деменция.

НЕЖЕЛАТЕЛЬНЫЕ ЯВЛЕНИЯ Анализ полученных результатов исследования показал, что за весь десятидневный курс применения препарата Целлекс в остром периоде инсульта у всех пациентов, отличающихся как степенью тяжести инсульта, так и локализацией сосудистого поражения головного мозга, нежелательных явлений отмечено не было

ЗАКЛЮЧЕНИЕ И ВЫВОДЫ Применение препарата Целлекс в остром периоде ишемического инсульта достоверно приводит к: Увеличению процента регредиентного течения инсульта на 17 (%) Уменьшению процента пациентов с ремиттирующим течением на 15 (%) Уменьшению более чем в пять раз процента пациентов с прогредиентным течением инсульта Снижению балла по шкале инсульта (NIHHSS) более чем на 10% в сравнении с группой контроля, а для пациентов с тяжелым инсультом на 25% Достоверному снижению балла по шкале инсульта (NIHHSS) в сфере двигательных нарушений, речевых нарушений и нарушений чувствительности Восстановлению речи по шкале «Опросник речи», прирост балла - более чем на 15% в сравнении с группой контроля, а для пациентов с грубыми речевыми нарушениями практически в три раза. Улучшению качества жизни (по шкале Карновского) более чем на 17% в сравнении с группой контроля для пациентов с тяжелым инсультом. Достоверному улучшению когнитивных функций по MMSE, MoCA - тесту и тесту «Информация-Концентрация внимания-Память»

ЗАКЛЮЧЕНИЕ И ВЫВОДЫ Таким образом, данные сравнения динамики баллов, полученные при использовании международных клинических шкал для групп сравнения, позволяют сделать выводы о достаточно высокой эффективности препарата Целлекс в остром периоде инсульта Применение препарата Целлекс позволяет значительно увеличить объем восстановления утраченных функций, а так же ускорить регресс общемозговой симптоматики, двигательных и речевых нарушений у всех групп пациентов, особенно у пациентов со среднетяжелым и тяжелым течением инсульта

БЛАГОДАРЮ ЗА ВНИМАНИЕ