Хроматофокусирование: новые подходы в концентрировании и разделении А.В.Иванов

2 Градиенты рН Доколоночные (внешние) - Только подвижные фазы - Необходимы смесители и т.д. [пример узла установки Waters ALC-100, 1978 г.] Внутриколоночные (внутренние) - Подвижные полибуферные фазы + сорбент - Оборудование для изократического элюирования

3 Хроматофокусирование (ХФ) Метод ионообменной хроматографии, основанный на формировании линейного градиента рН внутри колонки (L.Sluyterman; Uppsala, ) объекты: биологические биполярные соединения (белки, ферменты, и т.д.) Техника получения градиента рН в уравновешенной стартовым раствором СР колонке (рН 1 ) при пропускании буферного элюента Э (рН 2 ) Слабоосновный анионообменник (-NR 2 ) – нисходящий градиент; Слабокислотный катионообменник (-COOH)- восходящий градиент

4 Техника хроматофокусирования (ХФ)

5 Фокусирующий эффект при разделении биполярных соединений (из книги Хроматофокусирование полибуфером на ПБИ, Stockholm-Uppsala, 1982)

6 Преимущества хроматофокусирования не требуется дополнительное оборудование (градиентный насос, система смесителей); высокая нагрузочная емкость колонок, концентрирование и разделение на одной колонке; высокая воспроизводимость градиентов (s r 0,02), широкий рабочий интервал рН (до 4-5 ед.); фокусирующий эффект (для биполярных соединений) НО: основное ограничение – полиамфолитные элюенты

Новые направления ХФ 1. Техника ХФ для концентрирования и разделения переходных металлов 3. ХФ пептидов на сульфокатионитах (не имеют буф. емкости) 2. Поиск простых подвижных фаз для ХФ (одно-, двухкомпонентные

8 1. Хроматофокусирование ионов переходных металлов Анионообменные сорбенты: PBE-94 (Pharmacia); кремнеземы (Силохром, Силасорб) с привитыми олигоэтиленаминами – En-, Dien-, Tetren-; AP- (аминопропил-) Катионообменные сорбенты: полимеры (МГЦ, ССПС и ПММА) с привитыми карбоксильными группами -СООН, -СН 2 СООН Удерживание ионов металлов за счет комплексообразования при более высоких рН и элюирование при плавном снижении рН в слое сорбента (концентрирование и разделение)

9 Комплексообразующие сорбенты для ХФ ионов металлов (впервые – нисходящие градиенты рН на карбоксильных сорбентах) [12 сорбентов] СорбентМатрицаФункц. группы Размер частиц (мкм) рН- диапазон гидрол. стаб-ти Ионообм. емкость PBE-94 (Pharmacia) полисаха- рид -NR 2 (не указаны) ,32 ммоль/мл геля Tetren-SiO 2 Силохром С-120 тетраэтилен- пентамин ,35 ммоль/г MacroPrep 50 CM (*) (Biorad) ПММА-CH 2 COOH ,21 0,04 ммоль/мл геля

10 Хроматофокусирование (ХФ) ионов металлов на анионообменных сорбентах сорбент - а) PBE-94; б) Tetren-SiO 2 (колонка 300х9 мм) СР - 25 мМ Трис-HCl (pH 7,5), Э - 1:8 Полибуфер-74 (pH 3,3), 1 мл/мин Детектирование - по реакции с ПАР (540 нм)

11 Разделение и концентрирование ионов металлов сорбент MacroPrep 50 CM (50 мкм, 50x4,6 мм) СР: 10 мМ Трис-HCl (pH 7,5), I СР : 0,1 (NaCl) Э: 0,5 мМ лимонная к-та (pH 3,4), I Э : 0,1 (NaCl); 1 мл/мин Детектирование: УФ (254 нм) сорбент MN (5 мкм, 50x4,6 мм) СР: 10 мМ Трис-HCl (pH 7,1), I СР : 0,05 Э: 1 мМ лимонная к-та (pH 3,3), I Э : 0,05; 1 мл/мин Проба: 2 х М Cu 2+, 30 мл Детектирование: УФ (254 нм)

12 Концентрирование ионов переходных металлов СорбентCo 2+ Cu 2+ Ni 2+ Zn 2+ Fe 3+ Mn 2+ Cd 2+ Pb 2+ PBE CM > >600

13 Техника индуцирования: введение конц. индуцирующего раствора ИР (рН 2 ) в поток разбавленного буферного элюента Э (рН 1 ) (K.Slais; Brno, ; А.Иванов, ) сокращение времени в 3-4 раза

14 Разделение ионов металлов с индуцированным градиентом рН сорбент - а) Dien-SiO 2 ( мкм, 150х2 мм); б) Tetren-SiO 2 ИР – 1 мл 100 мМ Na 2 B 4 O 7, Э – а) 10 мМ (6-аминогексановая к-та + гистидин); 0,2 мл/мин; б) 20 мМ, Детектирование - по реакции с ПАР (540 нм)

15 2. Новые простые подвижные фазы для хроматофокусирования Традиционно – полиамфолитные элюенты (полибуферы) Преимущества: постоянная буферная емкость в широком диапазоне рН широкий рабочий интервал рН Но: сложный синтез, высокая стоимость, низкая устойчивость к биодеградации; трудно отделять от белков и пептидов; высокий УФ-сигнал

16 Подходы к поиску подвижных фаз – стартовых растворов и элюентов эмпирический - экспериментальная проверка смесей кислот, оснований и амфолитов – до компонентов (Hutchens, ) на основе моделирования (учет свойств сорбентов, активных компонентов подвижных фаз, наличие сильного электролита): сорбент – полифункциональный, полиэлектролитный СР – слабое основание + электролит (NaCl) Э – слабая кислота + основание + электролит (NaCl)

Как избавиться от подъема рН на нисходящем градиенте? I Э < I СР сорбент Tetren-SiO 2 (7,5 мкм, 1 мМ/г, 250x4,6 мм) СР: 25 мМ Трис-10 мМ H 2 C 2 O 4 (pH 7,5), I СР : 1 - ~0; 2 - 0,1; Э: 20 мМ H 2 C 2 O мМ Трис (pH 3,5), I Э : ~0,05

18 Нисходящие градиенты рН в анионообменных колонках полифункциональные сорбенты с полиэлектролитными свойствами; элюенты с минимальным содержанием слабых оснований; I Э < I СР для формирования плавного градиента ионную силу элюента следует понижать, для более резкого градиента - повышать

19 Разделение изоформ плазминогенов сорбент Tetren-SiO 2 (7,5 мкм, 50x4,6 мм) СР: 25 мМ Трис-HCl (pH 7,5), I СР : 0,02 Э: 2 мМ H 2 C 2 O 4 (pH 2,9), I Э : ~0; 1 мл/мин Проба: 20 мкл лиофилизов. смеси Glu- и Lys-плазминогенов (pI 5,82 и 5,66), активность 1 мг/мл Детектирование - УФ (280 нм)

20 Разделение смеси металлов сорбент PBE-94 (>100 мкм, 300x9 мм) СР: 25 мМ Трис-HCl (pH 7,5), I СР : 0,05 Э: 20 мМ глутаминовая к-та (pH 3,3), 1 мл/мин Детектирование - по реакции с ПАР (540 нм)

21 Эффект ионной силы подвижных фаз для карбоксильных колонок сорбент Macro-Prep 50 CM (50 мкм, 50x4,6 мм) СР: 10 мМ Трис-HCl (pH 7,5), Э: 1 мМ (1) и 0,5 мМ (2) лимонная кислота (pH 3,3 - 3,5); 1 мл/мин, ионная сила подвижных фаз: 1 - 0,01; 2 - 0,1

22 Квази-линейные нисходящие градиенты рН в катионообменных колонках сорбенты с полиэлектролитными свойствами; слабое основание в элюенте не влияет на профиль градиента, а лишь на конечное значение рН; I Э I СР (~0,05 – 0,2) для получения плавного градиента можно использовать однокомпонентные Э с высокой ионной силой (как в СР)

Восходящие градиенты рН Мало изучены для применения в ХФ Подвижные фазы - полиамфолиты Эффект ионной силы не исследован Перспективны для разделения белков, пептидов и др. биполярных макромолекул

24 Выбор элюента для восходящих градиентов рН сорбент Macro-Prep 50 CM (50 мкм, 50x4,6 мм) СР: 2 мМ лимонная к-та (pH 3,3), Э (рН 7,5): 1:25 Полибуфер (1); 12,5 мМ Трис-HCl (2); 12,5 мМ Трис-HCl + 1 мМ лимонная к-та (3); 12,5 мМ Трис-HCl + 6 мМ лимонная к-та (4); 1 мл/мин

25 ХФ альбуминов с восходящим градиентом сорбент Macro-Prep 50 CM (50 мкм, 50x4,6 мм) СР: 2 мМ лимонная к-та + 1,5 мМ Трис (pH 3,3), I СР : ~0 Э: 20 мМ Трис-HCl + 5 мМ лимонная к-та (рН 7,6); 1 мл/мин; I Э : 0,5 Проба: овальбумин (Oval.) и бычий альбумин (BSA), 0,5 мг/мл Детектирование: УФ (280 нм)

26 ХФ образца формиатдегидрогеназы на сорбенте низкой емкости сорбент MN (5 мкм, 50x4,6 мм) СР: 2 мМ лимонная к-та (pH 3,0), I СР : 0,05 (NaCl) Э: 10 мМ Трис-лимонная к-та (рН 7,5); 1 мл/мин; I Э : ~0 Проба: ФДГ из клеточного лизата с активностью 1 мг/мл Детектирование: УФ (280 нм)

27 Квази-линейные восходящие градиенты рН в карбоксильных колонках 1. сорбенты с высокой емкостью: слабое основание в стартовом растворе влияет на начальный участок градиента рН; I Э > I СР ( от 0,1) 2. сорбенты с низкой емкостью: слабое основание в стартовом растворе не влияет на начальный участок градиента рН; I Э < I СР либо I Э I СР (~0,05)

28 3. Хроматофокусирование пептидов на сульфокатионитах Возможность разделения пептидов Проблема: полиамфолитные элюенты осложняют детектирование ( < 220 нм) – только ароматика Отсутствие буферной емкости сорбента Исключительная роль элюента Сильно- и слабоудерживаемые пептиды СорбентМатрицаРазмер частиц Функц. группы рН- диапазон стаб-ти Буферная емкость Hamilton PRP-X200 ПММА10 мкм-SO нет

29 Подвижные фазы для ХФ на сильно-кислотном сорбенте сорбент PRP-X200 (10 мкм, 200x4,6 мм) СР: 5 мМ NaH 2 PO 4 (pH 3,0), I СР : ~0 (1 и 2), 0,1 (3), 0,5 (4) Э: 10 мМ NaH 2 PO мМ Трис (рН 7,0), I Э : ~0 (1 и 4), 0,3 (2 и 3); 1 мл/мин

30 ХФ трипсинового гидролизата альбумина сорбент PRP-X200 (10 мкм, 200x4,6 мм) СР: 5 мМ NaH 2 PO 4 (pH 3,0), I СР : 0,5 (NaCl) Э: 10 мМ NaH 2 PO мМ Трис (рН 7,0), 1 мл/мин, I Э : ~0 Проба: гидролизат человеческого альбумина (0,1 мг) Детектирование: УФ (214 нм)

31 ХФ гидролизата альбумина при одновременном градиенте ионной силы сорбент PRP-X200 (10 мкм, 200x4,6 мм) СР: 3 мМ NaH 2 PO % CH 3 CN (pH 3,0), I СР : 0,1 (NaCl) Э: 10 мМ NaH 2 PO мМ Трис + 10% CH 3 CN (рН 7,0), 1 мл/мин, I Э : 0,3 (NaCl) Детектирование: УФ (214 нм)

32 Линейные восходящие градиенты рН в сильно-кислотных колонках активные компоненты стартового раствора и элюента – одной природы; добавки CH 3 CN (~10%) в обе фазы I СР (~0,1) < I Э (~0,3) (сочетание градиента рН с градиентом ионной силы)

33 Выводы Устоявшийся метод хроматофокусирования может развиваться в следующих направлениях: 1. Предложено использовать технику хроматофокусирования и индуцирования для концентрирования и рН-градиентного разделения ионов металлов на комплексообразующих анионитах и катионитах. 2. Коммерческие Полибуферы можно заменить простыми одно- двухкомпонентными элюентами при создании высокой ионной силы в одной или обеих подвижных фазах. Возможности простых элюентов показаны на примере разделения металлов; аминокислот; белков; ферментов. Фокусирующий эффект для биполярных молекул усиливается за счет градиента ионной силы. 3. Технику хроматофокусирования можно использовать в сочетании с градиентом ионной силы для разделения смесей пептидов на сульфокатионитах.

34 Публикации Опубликовано 80 статей, из них по теме работы - 57: 2 обзора (ЖАХ, 1999; Вестник МГУ, 2005) 55 статей: ЖАХ – 9 ЖФХ – 14 Вестник МГУ – 24 Сорбционные процессы – 3 Fresenius J., Mendeleev Comm., J. Liquid Chrom., J.Chromatogr., Известия ВУЗов, Молекулярные технологии Тезисы докладов – 50: XVI, XVII, XVIII Менделеевские съезды; IICS-92, 93, 94, 2000, 2004; ICAS-97, 2006; SBS-03; Всеросс. симп. по хроматографии ; Разделение и концентрирование в аналитической химии; Ломоносовские чтения-2005;Аналитика России-2007 и др. Диссертации: А.В. Иванов Хроматофокусирование переходных металлов (1997), А.Б. Тессман Формирование внутренних градиентов рН в ионообменной хроматографии: моделирование и экспериментальная проверка (2000), М.С. Вакштейн Новые подвижные фазы для хроматофокусирования в катионообменных системах (2006).

35 Благодарность докт. хим. наук П.Н.Нестеренко, О.А.Шпигуну; канд. хим. наук А.В. Гармашу; аспирантам А.Б. Тессману, М.С. Вакштейну, С.С. Кубышеву, дипл. Н.Ю. Смирновой; проф. К. Шлайсу и дипл. Т. Рейтару (Чехия) за плодотворное сотрудничество РФФИ – за финансовую поддержку исследования (проекты и )

36 Индуцированные градиенты в карбоксильных колонках сорбент Macro-Prep 50 CM (50x4,6 мм) Э: 8 мМ СН 3 СООН (pH 3,6), ионная сила: 1 и 3 - 0,1; 2 - ~0 ИР: 1 мл 3,25 М NH 3 (рН 11), ионная сила: 1 - 1; 2 и 3 - ~0

37 Индуцированные градиенты в карбоксильных колонках сорбент Macro-Prep 50 CM (50 мкм, 50x4,6 мм) ИР: 1 мл [4 М CH 3 COONa + 1 M NaCl (1, 3)] (pH 11,9) Э: 5 мМ СН 3 СООН (pH 3,6), ионная сила (NaCl): 1, 2 – 0, 3 – 0,1 M; 1 мл/мин

38 Разделение ионов металлов с индуцированным градиентом рН сорбент Macro-Prep 50 CM (50 мкм, 50x4,6 мм) ИР: 1 мл (4 М CH 3 COONa + 1 M NaCl) (pH 11,9) Э: 5 мМ СН 3 СООН + 0,1 M NaCl (pH 3,6), 1 мл/мин Детектирование - УФ (254 нм): 1 - Pb 2+, 2 - Co 2+

39 Эксперимент и модель: различие в ионной силе стартового раствора и элюента (анионообменная система) I Э > I СР 1 - сорбент Dien-SiO 2 ( мкм, 0,35 мМ/г) 2 - модель Tetren-SiO 2 СР -25 мМ Трис-HCl (pH 7,5), Э - 5 мМ CH 3 COOH + NaCl (pH 3,5)

40 Различие в ионной силе стартового раствора и элюента I Э < I СР сорбент Tetren-SiO 2 (7,5 мкм, 1 мМ/г, 250x4,6 мм) СР: 25 мМ Трис-HCl (pH 7,5), I СР : 1 - ~0,03; 2 - 0,1; 3 - 1; 4 - 0,02 Э: 2 мМ H 2 C 2 O 4 (pH 2,9), I Э : 1, 2 и 3 - ~0; 4 - 0,5

41 Модельная смесь аминокислот сорбент Tetren-SiO 2 (7,5 мкм, 50x4,6 мм) СР: 25 мМ Трис-HCl (pH 7,5), I СР : 0,02 Э: 2 мМ H 2 C 2 O 4 (pH 2,9), I Э : ~0; 1 мл/мин Детектирование - УФ (280 нм)

42 Формирование градиента рН однокомпонентными элюентами в катионообменной системе сорбент MN (5 мкм, 50x4,6 мм) СР: 10 мМ Трис-HCl (pH 7,5) Э: 1 мМ кислоты - 1 – щавелевая, 2 - винная, 3 – лимонная, 4 – глутаминовая, 5 – уксусная; 1 мл/мин

43 Как избавиться от подъема рН? сорбент MN (5 мкм, 50x4,6 мм) СР: 10 мМ Трис-HCl (pH 7,5) Э: 0,2 мМ лимонная кислота (pH 3,7-3,9); 1 мл/мин, ионная сила подвижных фаз: 1 - ~0; 2 - 0,01, 3 - 0,1 (NaCl)

44 Анионообменные сорбенты (для ХФ ионов металлов) СорбентPBE-94 (Pharmacia) En-SiO 2 Dien-SiO 2 Tetren-SiO 2 AP- SiO 2 МатрицаполисахаридСилохром С-120 Silasorb Si 600 Lichro- sorb Функц. группы -NR 2 (не указаны) этилен- диамин диэтилен- триамин тетраэтилен- пентамин пропил- амин Размер частиц (мкм) , рН- диапазон гидрол. стаб-ти Ионообм. емкость 0,32 ммоль/мл геля 0,10 ммоль/г 0,12 ммоль/г 0,35 ммоль/г ~1,0 ммоль/г 0,10 ммоль/г

45 Карбоксильные сорбенты (для ХФ ионов металлов) Впервые – нисходящие градиенты рН СорбентCM-52Ольвагель- СOOH MNMacroPrep 50 CM ПроизводительWhatman (UK)НИИ химии (СССР) Purolite (UK)Biorad (USA) МатрицаМикрогрануллир. целлюлоза ПММАССПСПММА Функц. группы-CH 2 COOH-СООН -CH 2 COOH Размер частиц (мкм) > рН-диапазон стаб-ти Ионообменная емкость 0,95 - 1,15 ммоль/г (сухого сорбента) 0,30 ммоль/мл геля не выше 0,10 ммоль/г 0,21 0,04 ммоль/мл геля

46 Квази-линейные градиенты рН на сорбенте с низкой емкостью сорбент MN (5 мкм, 50x4,6 мм) СР: 2 мМ лимонная к-та (pH 3,0), I СР : ~0 (1 и 2), 0,05 (3 и 4) Э: 10 мМ Трис-лимонная к-та (рН 7,0), I Э : ~0 (1 и 3), 0,05 (2 и 4); 1 мл/мин

47 Влияние добавок ацетонитрила в условиях градиента рН сорбент PRP-X200 (10 мкм, 200x4,6 мм) СР: 5 мМ NaH 2 PO % CH 3 CN (pH 3,0) Э: 10 мМ NaH 2 PO мМ Трис + 20% CH 3 CN (рН 7,0), 1 мл/мин Детектирование: УФ (214 нм)

48 Влияние ионной силы в карбоксильной колонке сорбент Macro-Prep 50 CM (50 мкм, 50x4,6 мм) СР: 2 мМ лимонная к-та + 1,5 мМ Трис (pH 3,3), Э (рН 7,6): 20 мМ Трис-HCl + 5 мМ лимонная к-та; 1 мл/мин; ионная сила: 0 (1), 0,01 (2), 0,5 (3)