ШТРИХ-КОДИРОВАНИЕ ВИДОВ НА ОСНОВЕ ДНК И ФИЛОГЕНЕТИКА РЫБ Картавцев Ю.Ф. Институт биологии моря имени А.В. Жирмунского Дальневосточного отделения Российской академии наук, Владивосток ;

МЕЖДУНАРОДНЫЙ ПРОЕКТ ШТРИХ- КОДИРОВАНИЯ ВИДОВ ЖИВЫХ ОРГАНИЗМОВ (1) «Штрих-код жизни» (Barcoding of Life – ) – это международный проект, организованный в 2004 году и призванный объединить усилия генетиков, зоологов, ботаников, специалистов по информатике и электронике для того, чтобы каждому виду обитающих на Земле животных и растений дать специфическую метку. По этой метке любой организм, даже поврежденный, сохранившийся в виде какого-то фрагмента или находящийся на ранней стадии развития (не похожей на взрослое его состояние), мог бы быть точно определен. Идея такого «штрих-кода» принадлежит канадскому биологу Полю Эберу. Он предложил в 2003 году в качестве видоспецифичной метки использовать последовательность нуклеотидов в ДНК гена, который есть у всех животных и растений. Это ген цитохромоксидазы 1, Со-1 (соответствующий белок принимает участие в процессах дыхания). Со-1 – это короткий ген, состоящий примерно из 650 нуклеотидов. Благодаря 2-м этим обстоятельствам он и получил предпочтение среди других маркеров.

МЕЖДУНАРОДНЫЙ ПРОЕКТ ШТРИХ- КОДИРОВАНИЯ ВИДОВ ЖИВЫХ ОРГАНИЗМОВ (2) Идея штрих-кодирования видов широко поддержана в мире. Образовался международный Консорциум проекта «Штрих-код жизни», в который к 2005 г. вступило 69 организаций из 31 страны (университеты, естественно-научные музеи, зоопарки, ботанические сады, агентства, занимающиеся природоохранной деятельностью, и т.д.), а в 2006 г. их численность составила 133. Конечная цель проекта – «идентифицировать» все известные и пока неизвестные виды и дать возможность легко определять принадлежность того или иного организма к конкретному виду. Сейчас биологами описано около 1 млн. 700 тыс. видов животных и растений (не считая микробов). Предполагается, что всего существует не менее 10 млн. видов, то есть большинство их еще не выявлено. Сформированы два подпроекта: Fish-BOL, по которому будут даны «штрих-коды» видов морских и пресноводных рыб и «Птицы Северной Америки» ( видов должны быть кодированы к 2010 году). К 2006 г. кодированы видов рыб. В текущем году пройдет уже вторая международная конференция по описанной проблематике в рамках глобальной инициативы (Тайбэй, сентябрь 2007). В России начинает реализовываться пилотный проект по штрих- кодированию видов рыб. Вскоре пройдет рабочее совещание по этой теме (Владивосток, июня 2007 г.).

МЕЖДУНАРОДНЫЙ ПРОЕКТ ШТРИХ- КОДИРОВАНИЯ ВИДОВ ЖИВЫХ ОРГАНИЗМОВ (3)

КОНЦЕПЦИЯ И ПРИМЕНИМОСТЬ РАЗРАБОТОК В РФ: НАЧАЛО В РФ сейчас имеется инструментальная и творческая основа для работ. В основном данная стадия предполагает следующее: 1. Доработка и унификация секвенс-анализа Co-1 2. Накопление материала по отработанным методикам 3. Создание нового фундаментального знания: разработка и уточнение филогений конкретных таксонов, таксономические ревизии 4. Разработка прикладного продукта в виде базы данных (БД) по ДНК штрих-кодированию видов, начиная с 3-4 отрядов рыб. ПК – БД – Веб-сайт

КОНЦЕПЦИЯ ШТРИХ-КОДИРОВАНИЯ ВИДОВ РЫБ РФ Создание базы данных будет сопровождаться разработкой специальной программы по переустройству музейных коллекций, начиная с коллекции музея Института биологии моря ДВО РАН (ИБМ), на современной основе. Эта работа предполагает: 1) сопровождение всех типовых (паратиповых) образцов цветными цифровыми фотографиями, 2) ваучерным представлением типовых экземпляров рыб (подготовка технической документации и ее компьютерное обеспечение в соответствии с мировыми стандартами), 3) ведением специальных крио-коллекций спиртовых образцов тканей и 4) инкорпорированием данных в мировые базы данных, начиная с Fish-BOL ( ), GenBank, NCBI ( ) и FishBase ( ).

МАСШТАБЫ ПРИМЕНИМОСТИ РАЗРАБОТОК: ПЕРСПЕКТИВА Разработка может быть применима во всех биологических музеях РФ, а со временем, при наращивании научно-технического потенциала рыбного хозяйства и в этом секторе промышленности РФ. РАЗРАБОТКА БИОЛОГИЧЕСКИЕ МУЗЕИ РФ РЫБНОЕ ХОЗЯЙСТВО НАУКА, ОБРАЗОВАНИЕ, ПРОСВЕЩЕНИЕ

МАСШТАБЫ ПРИМЕНИМОСТИ РАЗРАБОТОК: ПЕРСПЕКТИВА Потенциальный рынок использования данной услуги В РФ функционирует 1071 ВУЗ (данные по 2004 г.), во многих из которых имеются биологические или экологические специальности и, соответственно, потенциальная потребность в данной услуге. Кроме того, биологические музеи и экспозиции имеются в профильных институтах РАН, Госкомрыболовства и Министерства природных ресурсов. Биологические экспозиции и музеи имеют также большинство природных заповедников и заказников РФ, а также многие общеобразовательные школы. Число заинтересованных организаций в РФ может достигать много более Количество пользователей через систему Интернета в перспективе может измеряться десятками тысяч посещений соответствующих сайтов при их создании и развитии. Сложности прежде всего они, видятся в материальном обеспечении: для покупки необходимого экспериментального оборудования, химреактивов, компьютеров и программного обеспечения.

ЧИСЛО ВИДОВ РЫБ РФ В недавнем каталоге бесчерепных и рыб пресных и солоноватых вод России перечислены 557 видов и других таксонов (Богутская, Насека, 2004). Истинно пресноводных – 367 видов (Froesy, Pauly, 2005; World Wide Web Fishbase). Приблизительное число морских видов – 568 (Froesy, Pauly, 2005; Fishbase, 2005). Т.е., всего число видов рыб в России составляет Однако по новой сводке Соколовского и соавторов (2007) только число морских рыб Японского моря составляет 366 видов. Видимо, число видов после реализации программы Fish- BOL сильно увеличиться. Главное однако не это, а совершенно новый уровень описания имеющегося разнообразия, с точным документированием и сопровождением всех образцов цветными фото, ДНК штрих-кодом, а также бесплатным доступом к мировым базам данных.

РАЙОНЫ РАБОТ: НАЧАЛО

Зона 1: Баренцево море, Белое море, Балтийское море, и Черное море. Главные участники: Институт общей генетики (ИОГен), Институт биологии гена (ИБГ), Зоологический институт (ЗИН), Всероссийский институт рыбного хозяйства и океанографии (ВНИРО), Полярный институт рыбного хозяйства и океанографии (ПИНРО), Московский государственный университет (МГУ) и др. Зона 2: Японское море, Охотское море, Берингово море. Главные участники: Институт биологии моря (ИБМ), Биолого-почвенный институт (БПИ), Институт биологических проблем севера (ИБПС), Дальневосточный государственный университет (ДВГУ), Тихоокеанский институт рыбного хозяйства и океанографии (ТИНРО- центр) и др.

ИСТОЧНИКИ ФИНАНСИРОВАНИЯ Внутренние Исследовательские гранты (РФФИ, ДВО и др. отделения РАН). Программа РАН (с 2007 г.?). Программа ДВО РАН (с 2007 г.?). Программа Минобрнауки (?). Лоты Роснауки (?). Внешние Fish-BOL (поиск источников для исследовательских коллективов – FAO, World Bank etc.).

СХЕМА ПРОГРАММЫ РФ

ФИЛОГЕНЕТИКА

- Приматы - Грызуны - Кроличьи - Китообразные - Хищные (собаки, коты) - Парнокопытные (свиньи, бычьи) - Непарнокопытные (лошади) - Слоны - Сумчатые - Птицы - Крокодилы - Змеи - Ящерицы - Черепахи - Лягушки - Саламандры - Костистые рыбы - Акулы и скаты - Миноги и миксины - Насекомые - Высшие растения - Грибы - Бактерии l I I I I I I I I I l l (миллионы лет) PRECAM- ORDO- SILU- DEVO- CARBONI PER- TRIAS-JURAS CRETA- CENOZOIC BRIAN |CAMBRIAN|VICIAN| RIAN | NIAN | FEROUS | MIAN | SIC | SIC | CEOUS | Дивергенция групп позвоночных животных и линии нескольких других групп на основании палеонтологических и морфологических данных (По McLaughlin, Dayhoff, 1972; заимств. из Nei, 1987). ПРОБЛЕМЫ С ДАТИРОВКАМИ И ВЕТВЛЕНИЕМ

ВВЕДЕНИЕ ДНК митохондрий (мтДНК) – это кольцевая молекула, длиной около пн (пар нуклеотидов). Как показывают литературные данные, мтДНК всех рыб имеет сходную организацию (Lee et al., 2001; Kim et al., 2004; Kim et al., 2005; Nagase et al., 2005; Nohara et al., 2005) и мало, чем отличается и у других позвоночных животных, включая человека (Anderson et al., 1981; Bibb et al., 1981; Wallace, 1992; Kogelnik et al., 2005). Полный состав митоходриального генома (митогенома) включает: контрольный регион (CR или D петля), где сосредоточены сайт начала репликации и промоторы, большая (16S) и малая (12S) субъединицы рРНК, 22 тРНК и 13 полипептидных генов. Филогенетические исследования обычно используют последовательности единичных генов, в том числе и генов ядерной ДНК, хотя в последние годы все чаше используют для этих целей и полный митогеном. Наиболее популярны в филогенетике последовательности генов цитохрома b (Cyt-b) и цитохром оксидазы 1 (Cо-1), которые используются для сравнения таксонов на уровне вид – семейство (Johns, Avise, 1998; Hebert et al., 2004; Картавцев, Ли, 2006). Много последовательностей, несущих филогенетический сигнал, получено для разных групп также по гену 16S рРНК. Последовательности отдельных генов могут давать различный филогенетический сигнал из-за различных темпов замен и конкретной эволюционной и/или демографической судьбы таксона (дифференцированная сортировка филетических линий). Это относится и к разным участкам одного и того же гена. Кроме того, при сопоставлении многочисленных таксонов, особенно высокого ранга, возникают проблемы с эффектами гомоплазии и недостаточной информационной емкостью наборов последовательностей для филогенетических целей (Hilish et al., 1996, Miya et al., 2001). Тем не менее, для идентификации видов, за редкими исключениями, достаточно сравнения даже относительно коротких последовательностей, например гена Со-1, 654 пн.

Спейсеры [ITS-1, 2] мтДНК яДНК,рДНК Наиболее значимые статистически результаты Наиболее значимые статистически результаты Достаточно значимые статистически результаты Достаточно значимые статистически результаты Вид Род Семейство Отряд Класс Тип Применимость различных молекул в филогенетике и таксономии

Некоторые из объектов Рис. 1. Внешний вид палтусовидной камбалы, Hypoglossus elasodon (A) и темной камбалы, Pseudopleuronectes obcurus (В). A B

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ 2. Амплификация ДНК генов посредством ПЦР 3. Анализ первичной последовательности ДНК генов. В 2006 г. : 200 последовательностей 4. Филогенетический анализ 1. Выделение ДНК.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ: ДАННЫЕ ПО КАМБАЛООБРАЗНЫМ

Фрагмент выровненных последовательностей нуклеотидов гена Cyt-b 17 видов камбалообразных и других рыб

Рис. 8. Укорененное Байесовское консенсусное (50%) древо, показывающее филогенетические взаимосвязи на основе нуклеотидных последовательностей гена Co-1 для 13 проанализированных видов камбал (Pleuronectiformes) и двух внешних таксонов (out- group). В узлах показаны частоты (вероятности) в n=10 6 модельных повторностей. Древо построено на основе модели Тамуры-Нея (TrN+I+G) и укорененное по двум внешним таксонам: Окунеообразные, Perciformes. Отрезок снизу показывает масштаб для длин ветвей.

Рис. 9. Укорененное консенсусное (50%) древо, показывающее филогенетические взаимосвязи на основе нуклеотидных последовательностей гена Cyt-b для 34 проанализированных видов камбал (Pleuronectiformes) и трех внешних таксонов (out- group). Байесовское древо; в узлах показаны частоты (вероятности, %) в n=10 6 модельных повторностей. Древо пострено на основе модели Тамуры-Нея (TrN+I+G) и укорененное по трем внешним таксонам: Окунеообразные, Perciformes. Отрезок снизу показывает масштаб для длин ветвей.

Рис. 11. Категоризированный график распределения средних р-расстояний в четырех группах сравнения по генам Cyt-b и Co-1 для разных таксонов животных. 1 - Внутривидовые, между особями одного и того же вида; внутри и между популяциями; 2 – Между близнецовыми видами, 3 - Внутриродовые, между видами одного рода; 4. Внутрисемейные, между различными родами одного семейства (по Картавцев, Ли, 2006).

ПУБЛИКАЦИИ АВТОРА ПО БЛИЗКОЙ ПРОБЛЕМАТИКЕ Картавцев Ю.Ф. Молекулярная эволюция и популяционная генетика. Владивосток: Изд-во Дальневост. Гос. Унив., с. Картавцев Ю.Ф., Ли Д.С. Анализ нуклеотидного разнообразия по генам цитохрома b и цитохромоксидазы 1 на популяционном, видовом и родовом уровнях // Генетика, T Jung S.-O., Lee Y.-M, Kartavtsev Y.P., Park I.-S., Kim D.-S., Lee J-S. The complete mitochondrial genome of the Korean soft-shelled turtle Pelodiscus sinensis // DNA Sequence, V.17(6). P Sasaki T., Kartavtsev Y.P., Uematsu T., Sviridov V.V., Hanzawa N. Phylogenetic independence of Far Eastern Leuciscinae (Pisces: Cyprinidae) inferred from mitochondrial DNA analysis // Gene and Genetic Systems, 2007 (Accepted). Kartavtsev Y.P., Lee Y.-M, Jung S-O, Byeon H-K, Son Y-, Lee J-S. Complete mitochondrial genome in the bullhead torrent catfish, Liobagrus obesus (Siluriformes, Amblycipididae) and phylogenetic considerations // Gene, 2007 (Accepted). Kartavtsev Y.P., Park T.-J., Vinnikov K. A., Ivankov V.N., Sharina S.N., Lee J.-S. Cytochrome b (Cyt-b) gene sequences analysis in six flatfish species (Pisces, Pleuronectidae) with phylogenetic and taxonomic insights // J. Marine Biol., 2007 (Accepted).

СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ!

СПИСОК ГЕНЕТИКОВ Москва 1. Захаров И.А. (ИОГен, чл-корр. РАН, зав. лабораторией, советник РАН) 2. Политов Д.В. (ИОГен, к.б.н., зав. лабораторией) 3. Гордеева Н.В. (ИОГен, к.б.н.) 4. Афанасьев К.И. (ИОГен, к.б.н.) 5. Васильев В.П. (ИПЭЭ, д.б.н.) 6. Рысков А.П. (ИБГ, чл-корр. РАН, зав. лабораторией) 6. Семенова С.А. (ИБГ, к.б.н.) 7. Барминцев A.A. (ВНИРО, к.б.н.) Владивосток 1. Картавцев Ю.Ф. (ИБМ, д.б.н.) 2. Кухлевский А.Д. (ИБМ, к.б.н.) 3. Шарина С.Н. (ИБМ, аспирант) 4. Шедько С.В. (БПИ, к.б.н., зав. группой) 5. Чичвархин А.Ю. (БПИ, к.б.н.) 6. Балакирев Е.С. (ДВГУ, д.б.н., зав. лабораторией) 7. Винников К.А. (ДВГУ, аспирант) 8. Чичвархина O.В. (ИБМ, аспирант)

СПИСОК УЧАСТВУЮЩИХ ИХТИОЛОГОВ ДВ ИБМ (4) Питрук Д.Л. (к.б.н.., директор музея, зам. директора) Яковлев Ю.М. (к.б.н.) Соколовский А.С. (к.б.н.) Баланов А.А. (к.б.н., зав. лабораторией) Долганов В.М. (д.б.н.) ДВГУ (4) Иванков В.Н. (д.б.н.) Платошина Л.К. (к.б.н.) Винников К.А. (аспирант) Рутенко О.А. ( аспирант ) ИБПС (3) Черешнев И.А. (член-корр. РАН, директор) Шестаков А.В. (к.б.н.) Грунин С.И. (аспирант) ТИНРО-центр, СахНИРО, КамчатНИРО и др. (7) Шунтов В.П. (д.б.н., зав. лабораторией) Борисовец Е.Н. (к.б.н., зав. лабораторией) Свиридов В.В. (к.б.н.) Пушникова Г.М. (к.б.н.) Карпенко В.В. (к.б.н., зав. лабораторией) Золотухин С.Ф. (к.б.н., зав. лабораторией) Рыбникова И.Г. (к.б.н.)

Подписка последовательностей в GenBank (NCBI)

Рис. 14. Распределение частот нуклеотидов (%) видов камбалообразных рыб (Pleuronectiformes) (1- 2) в сравнении с представителями окунеообразных рыб (Perciformes) (3). Оригинальные данные взяты из Табл. 2 для гена Cyt-b для всех трех положений нуклеотидов. Сверху показаны результаты однофакторного дисперсионного анализа (MANOVA). Группы 1 – 3: 1 – Виды из данного исследования; 2 – литературные данные по камбалообразным из генного банка (GenBank); 3 – Литературные данные по окунеобразным. Сравниваемые группы Нуклеотидный состав, %

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ (2) Амплификация мтДНК посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) Первоначально из скелетных мышц выделили тотальную ДНК с использованием обычной хлороформ- фенольной методики и осаждением ДНК спиртом. Для получения секвенс данных по гену Cyt-b для 6 видов камбаловых рыб сначала с помощью длинной ПЦР и праймеров L Leu (5-GGT CTT AGG AAC CAA AAA CTC TTG GTG CAA-3) и S-LA-16S-H (5-TGC ACC ATT AGG ATG TCC TGA TCC AAC ATC-3) получили продукты размером примерно 8 тпн. Далее использовали набор специфических праймеров, подобранных для Cyt-b камбаловых рыб: cytb-F, 5'-ATG GCC AAC CTC CGT AAA TCC CAC CCC CTT C-3' и cytb-R, 5'-CTG GGG CTC TGG ACG CTG AGC TAC TAG TGC-3'. Реакционная смесь (50 μl) для ПЦР включала: 5 μl 10x ПЦР буфера (TaKaRa, Japan), 5 μl L-праймера, 5 μl H-праймера, 8 μl смеси dNTP, 1 μl затравки, 0.5 μl Taq полимеразы (5 units/ μl ) и 30.5 μl дистиллированной воды. ПЦР реакции проводили в ходе циклов: при режимах 98 o C - 25, o C и 72 o C на цикл. Продукты ПЦР подвергали электрофорезу в 1.0% агарозном геле. Окрашивание, осуществляли бромидом этидия и просматривали в УФ-свете. Было получено несколько ПЦР-продуктов и последовательно были клонированы на векторе pCR2.1 (Invitrogen). Секвенирование реализовано с использованием коммерческих праймеров T7 или M13. Анализ первичной последовательности ДНК Меченные фрагменты ДНК анализировали на секвенаторе модели 373S (Applied Biosystems Inc.). Последовательности видов камбал по гену Cyt-b легко идентифицировали по аналогии с другими известными последовательностями. Близкие процедуры использованы при амплификации и севенировании гена Со-1 Филогенетический анализ Последовательности ДНК были выровнены с помощью программы ClustalW (Thompsn et al., 1994), интегрированной в пакет MEGA-3 (Kumar et al., 1993). Анализировали кодирующие (все позиции) и некодирующие участки последовательностей. Оптимальную модель для нуклеотидных замен для анализируемого набора последовательностей подбирали с использованием специального программного средства Modeltest 3.7 (Posada, Grandall, 1998). Реконструкция древ основывалась на нескольких подходах, включая методы максимальной парсимонии (MP), максимального правдоподобия (ML) и байесовский (BA), с бутстреп-поддержкой во всех случаях, где это необходимо (Nei, Kumar, 2000; Felsenstein, 2004). Наилучшими для всего набора данных камбаловых рыб (20 последовательностей) оказались две модели замен: TVN+I+G и TrN+I+G. Вторая модель, TrN+I+G, признана наилучшей согласно информационного критерия Акаки (Akaike), тогда как вторая, TVN+I+G, оценена как наилучшая согласно теста максимального правдоподобия

Рис. 2. Карта сбора материала. Кружками показаны места локализации выборок.

ВВЕДЕНИЕ (2) Комплекс проблем: таксономия, филогения, популяционная структура. Японская камбала (Psedopleuronectes yokohamae) Камбала Шренка (P. schrenki) Противоречия единый таксон разные таксоны Поиск в банке нуклеотидных последовательностей NCBI - Cyt-b ген у камбаловых широко не использован - 16S рДНК ген использован с молекулярно филогенетическими целями (Pardo et al., 2005) - Со-1 мало изучен у камбал Близкие проблемы существуют для палтусовидных камбал, в целом для отряда Камбалообразные и практически для любой группы организмов. Norman, 1934 Moiseev, 1953 Ivankova, 1995 Sakamoto, 1984 Lindberg, Fedorov, 1993

Основные вопросы: Оценить нуклеотидное разнообразие у 6 видов камбал и выяснить согласуемость этих данных с результатами предыдущих исследований для Pseudopleuronectes yokohamae – P. schrenki и Hippoglossoides elassodon – H. robustus. Подтвердить или опровергнуть монофилетичность семейства Pleuronectidae.

Рис. 7. Укорененные консенсусные (50%) древа (A-B), показывающие филогенетические взаимосвязи на основе нуклеотидных последовательностей гена Cyt-b для проанализированных видов камбал (Pleuronectiformes) и четырех внешних таксонов (out-group). A – древо построенное на основе метода ближайшего соседства (NJ) с бутстреп- поддержкой (n=1000), B – Байесовское древо; в узлах показаны частоты (вероятности, %) в n=10 6 модельных повторностей. Древо пострено на основе модели Тамуры-Нея (TrN+I+G) и укорененное по четырем внешним таксонам: три – Окунеообразные, Perciformes и один - Карпообразные Cypriniformes. Отрезки снизу показывают масштаб для длин ветвей.

Рис. 10. Результаты однофакторного анализа (ANOVA) и средние величины p-расстояний в четырех группах сравнения среди камбалообразных рыб (Pleuronectiformes). Рассчитаны из таблицы попарных p-расстояний. Группы: 1. Внутривидовые, между особями одного и того же вида; 2. Внутриродовые, между видами одного рода; 3. Внутрисемейные, между различными родами одного семейства; 4. Внутриотрядные, между разными семействами одного отряда (Pleuronectiformes). Значимость изменчивости в дисперсионном комплексе показана сверху. SE: - стандартная ошибка средней. Средние значения по группам: (1) 0.56±0.07%, (2) 3.75±1.20%, (3) 12.02±0.21%, and (4) 19.33±0.22%. Сравниваемые группы р-Расстояние