Поиск диагностических морфологических признаков и генетических маркеров у ели европейской (Picea abies) и ели сибирской (P. obovata) и определение видовой принадлежности елей Северной Карелии Борисова П. Научныe руководители: Волкова П.А. Волкова П.А. Ильинский В.В.

Введение P. abies P. obovata Зона гибридизации

P. abies P. obovata Зона гибридизации ледник

Цель поиск видоспецифичных морфологических диагностических признаков и генетических маркеров у поиск видоспецифичных морфологических диагностических признаков и генетических маркеров у P. abies и P. obovata и определение видовой принадлежности елей Северной Карелии. P. abies и P. obovata и определение видовой принадлежности елей Северной Карелии.

Материалы и методы 141 дерево (149 шишек), 10 популяций Германия (3) Северная Карелия (4) Ненецкий АО (1) Красноярский край (2)

Наша работа

Морфология P. obovata P. abies Длина шишек: см 4-6 (8) см

коэффициент сужения: DSL/HS*100 коэффициент вытянутости: (LS-DS)/HS*100 значение разности коэффициентов сужения и вытянутости: – 55 P. abiesP. obovata

Геометрическая морфометрия – описание формы без размеров объекта

Классическая морфометрия Длина шишки, наибольшая ее ширина и расстояние до нее от основания шишки; для чешуи – аналогично Длина шишки, наибольшая ее ширина и расстояние до нее от основания шишки; для чешуи – аналогично Вторичные показатели: отношение длины к ширине и отношение положения наибольшей ширины к длине для чешуи и шишки Вторичные показатели: отношение длины к ширине и отношение положения наибольшей ширины к длине для чешуи и шишки коэффициенты сужения и вытянутости и их разность коэффициенты сужения и вытянутости и их разность

Геометрическая морфометрия

Распределение исследованных образцов в пространстве двух первых главных компонент (классификация по совокупности морфологических промеров) ь

Длина шишек для популяций P. abiesP. obovataС. Карелия

Отношение длины шишки к ее ширине С. КарелияP. obovataP. abies

Разность коэффициентов сужения и вытянутости С. КарелияP. obovataP. abies

Распределение исследованных растений в пространстве двух первых главных компонент для результатов геометрической морфометрии

Усредненные контуры чешуй

Постепенный переход P. abiesP. obovata изменение частот аллелей некоторых генов с запада на восток Маркеры в хлоропластной и митохондриальной ДНК Разграничивают виды, но важны частоты маркеров в популяции => нужны большие выборки полиморфизм одиночных нуклеотидных замен (Single nucleotide polymorphism, SNP) Возможно использовать для различения видов Молекулярно-генетическая часть

Материалы и методы Поиск нужных участков ДНК (по базе данных) Подбор праймеров Выделение ДНК Получение копий этих участков (ПЦР) Электрофорез определение последовательности нуклеотидов

Выбранные последовательности ДНК (в скобках – условные названия) 4 участка ДНК – два ядерных (220 и 467), два ядерных (220 и 467), один митохондриальный (МТ) один митохондриальный (МТ) один хлоропластный (TRN) один хлоропластный (TRN) Результаты и обсуждение

Подбор параметров ПЦР 58°, 10 сек 60°, 10 сек 62°,10 сек 61°, 10 сек 64°, 5 сек 65°, 5 сек 67°, 5 сек 60°, 5 сек

Полученные последовательности SNP в 427 позиции для участка для хлоропластного участка. GB – последовательности GenBank GB – последовательности GenBank видP. abies (GB) P. obovata (GB) P. abiesP. obovataКарельские ели нуклеотид СACAA

SNP для ядерного участка (220) GB – последовательности GenBank

Выводы Найден участок хлоропластной ДНК, который можно рекомендовать для дальнейшей разработки маркера для разграничения P. abies и P. obovata. Разработаны праймеры и подобраны оптимальные параметры ПЦР для анализа SNP на этом участке. Найден участок хлоропластной ДНК, который можно рекомендовать для дальнейшей разработки маркера для разграничения P. abies и P. obovata. Разработаны праймеры и подобраны оптимальные параметры ПЦР для анализа SNP на этом участке. P. abies, P. obovata различаются длинной шишек и формой чешуи, описанной как классической, так и геометрической морфометрией. P. abies, P. obovata различаются длинной шишек и формой чешуи, описанной как классической, так и геометрической морфометрией. Карельские ели, согласно данным геометрической морфометрии, относятся к P. × fennica, согласно классической морфометрии – к P. obovata. Карельские ели, согласно данным геометрической морфометрии, относятся к P. × fennica, согласно классической морфометрии – к P. obovata.

Благодарности Часть материала для настоящей работы собрана в ходе Беломорской экспедиции Московской гимназии на Юго-Западе (1543). собрана в ходе Беломорской экспедиции Московской гимназии на Юго-Западе (1543). Автор благодарит научных руководителей Волкову Полину Андреевну и Ильинского Валерия Владимировича; Л. Абрамову, П. Волкову, П. Петрова, А. Еськову, Е.Трушину, К. Трушина за помощь в сборе материала. Д.В. Ребрикова за ценные указания и помощь в написании работы, а так же коллектив ЦКП Д.В. Ребрикова за ценные указания и помощь в написании работы, а так же коллектив ЦКП «Генный полиморфизм» за предоставленную возможность проведения работы. Также автор признателен рецензенту Д. Кнорре за ценные замечания о данной работе и С. М. Глаголеву за организацию практики.

Спасибо за внимание

Геометрическая морфометрия Метод тонких пластин Метод тонких пластин 20 равноудаленных точек по всему контуру 20 равноудаленных точек по всему контуру Координаты меток – экранный дигитайзера tpsDig Координаты меток – экранный дигитайзера tpsDig Координаты эталонной конфигурации, значения главных, относительных и частных трансформаций – программа tpsRelw Координаты эталонной конфигурации, значения главных, относительных и частных трансформаций – программа tpsRelw Усредненные контуры чешуй – программа tpsSuper Усредненные контуры чешуй – программа tpsSuper Редактирование и конвертирование файлов данных – вспомогательная программа tpsUtil Редактирование и конвертирование файлов данных – вспомогательная программа tpsUtil

биостанция Чупа Расположение карельских популяций губа Чупа Кандалакшского залива Белого моря

Анализ главных компонент Анализ главных компонент Однофакторный дисперсионный анализ с последущим попарным сравнением выборок тестом Вилкоксона с поправкой Бонферрони. Однофакторный дисперсионный анализ с последущим попарным сравнением выборок тестом Вилкоксона с поправкой Бонферрони. Использовали статистическую среду R Использовали статистическую среду R

Вид попул я ц и и LCLC/HCDC/LCLS/HSDS/LSCPCNCN – CP Карелия b 62±111.92± ± ± ±0.0543±753±1110±14 c 58±101.94± ± ± ±0.0645±1156±1410±17 d 65±122.20± ± ± ±0.0543±958±1515±21 e 57±92.01± ± ± ±0.0545±859±1315±15 P. obovata f 57±92.04± ± ± ±0.0650±1371±821±19 g 61±82.17± ± ± ±0.0837±1173±835±12 h 68±41.99± ± ± ±0.0846±1262±616±14 P. abies i 118±132.78± ± ± ±0.0554±2037±8-14±13 j 110±182.50± ± ± ±0.0653±1043±3-10±11 k 105±103.09± ± ± ±0.0252±340±9-12±6

значения коэффициента вытянутости (CP)

коэффициент сужения (CN )

Отношение положения наибольшей ширины чешуи к ее длине (DC/LC)

Геометрическая морфометрия

Выделение ДНК ДНК выделяли из высушенной хвои используя метод СТАВ. К хвоинкам добавляли 500 мкл лизирующего буфера (0,2 М Tris-HCl pH 8,0, 0,05М EDTA, 2М NaCl, 2% СТАВ), образец вместе с буфером гомогенизировали в фарфоровой ступке. После проводили очистку ДНК с помощью стандартной методики фенол-хлороформной экстракции (Chomczynski, Sacchi, 1987): ДНК выделяли из высушенной хвои используя метод СТАВ. К хвоинкам добавляли 500 мкл лизирующего буфера (0,2 М Tris-HCl pH 8,0, 0,05М EDTA, 2М NaCl, 2% СТАВ), образец вместе с буфером гомогенизировали в фарфоровой ступке. После проводили очистку ДНК с помощью стандартной методики фенол-хлороформной экстракции (Chomczynski, Sacchi, 1987): Добавляли 400 мкл фенола pH=7,2, хорошо перемешивали. Добавляли 400 мкл фенола pH=7,2, хорошо перемешивали. Добавляли 400 мкл смеси хлороформа и изоамилового спирта (24:1), хорошо перемешивали. Добавляли 400 мкл смеси хлороформа и изоамилового спирта (24:1), хорошо перемешивали. Центрифугировали 10 мин при об/мин (16000 g). Центрифугировали 10 мин при об/мин (16000 g). Переносили водную фазу в новую пробирку 1,5мл и добавляли в нее 800 мкл 100% изопропанола, хорошо перемешивали. Переносили водную фазу в новую пробирку 1,5мл и добавляли в нее 800 мкл 100% изопропанола, хорошо перемешивали. Центрифугировали 5 мин при об/мин. Центрифугировали 5 мин при об/мин. Полностью удаляли надосадочную жидкость. Полностью удаляли надосадочную жидкость. Добавляли 400 мкл 70% этанола, хорошо перемешивали. Добавляли 400 мкл 70% этанола, хорошо перемешивали. Центрифугировали 5 мин при об/мин Центрифугировали 5 мин при об/мин Полностью удаляли надосадочную жидкость и высушивали осадок при комнатной температуре (не более 10 мин). Полностью удаляли надосадочную жидкость и высушивали осадок при комнатной температуре (не более 10 мин). Растворяли осадок в 50 мкл TE (Tris EDTA) буфера путем инкубирования при 65° С с периодическим перемешиванием. Растворяли осадок в 50 мкл TE (Tris EDTA) буфера путем инкубирования при 65° С с периодическим перемешиванием. В дальнейшем образцы хранили при температуре – 20° С. В дальнейшем образцы хранили при температуре – 20° С.

Общий объем смеси для ПЦР на одну пробирку составлял 25 мкл 17,5 мкл воды 17,5 мкл воды 2,5 мкл 10-ти кратного ПЦР-буфера 2,5 мкл 10-ти кратного ПЦР-буфера 0,5 мкл раствора dNTP's (25мМ каждого) – дезоксинуклеотидтрифосфатов 0,5 мкл раствора dNTP's (25мМ каждого) – дезоксинуклеотидтрифосфатов 0,15 мкл каждого праймера 0,15 мкл каждого праймера 1 мкл ДНК 1 мкл ДНК 0,5 мкл HS Taq-полимеразы (ЗАО «Евроген») 0,5 мкл HS Taq-полимеразы (ЗАО «Евроген»)

Выбранные видоспецефичные последовательности ДНК Результаты и обсуждения Название участка Участок Номера в GenBank 1 – P. abies 2 – P. obovata Праймеры/название праймера 467 conserved ortholog set (COS) PgTRX_WS00935.B21_B17 1. EU EU GTCAAGCAGGCCACGTGGGTC (467-D) AGTTGGAGGACCTAGGGAGGAG (467-R) 220 conserved ortholog set (COS) PgTRX_ EU EU GCTTGCTAAGAGTGGAACCTGTTC (220-D) ACGACTTGTTATGCACTGGGCTTG (220-R) TRN isolate ABI2b tRNA-Thr (trnT) gene, partial sequence; tRNA-Leu (trnL) gene, complete sequence; and tRNA-Phe (trnF) gene 1. EU EF TGAATGTAGATTGTAGATTCCTTCAAG (TRN-D) GTCCGTAGCGTCTACCGATTTCG (TRN-R) MT NADH dehydrogenase subunit 1 (nad1) gene, intron 2 and partial cds 1. EF EF TCTATAGATAGAGAGATAGTAGCGAG (MT-D) CTCAAAGGGCTAGCTAGAAGGTAAG (MT-R)