МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ В ПРОТЕОМНЫХ ИССЛЕДОВАНИЯХ Марина Васильевна Серебрякова Лаборатория протеомного анализа ФГУ НИИ ФХМ г.Москва Часть 2: Приложения

1) определение количества того или иного белка в образце; 2) идентификация белка; 3) уточнение первичной структуры; 4) определение пост-трансляционных модификаций. 2D-электрофорез Специфический гидролиз MALDI-MS Специфический гидролиз Хроматография ESI-MS-MS, микросеквенирование ПРОТЕОМИКА – набор высокотехнологичных методов изучения белков Белковые чипы

Масс-спектрометрия целых белков Точность недостижима при использовании времяпролетной масс- спектрометрии, ионных ловушек Изучаемый белок как правило отличен от имеющегося в базе данных Для идентификации белка по его молекулярной массе необходима точность ее измерения < 2ppm Такая точность доступна при использовании масс-спектрометрии ИЦР В базе данных NCBI nr более записей Пример: при анализе всех цитозольных белков бактерии Rhodobacter с использованием масс-спектрометрии ИЦР идентифицировано около 10% белков, пики которых наблюдались в спектре. Массы остальных белков были отличны от рассчитанных по гену из-за наличия пост-трансляционных модификаций.

Профилирование белков КОНТРОЛЬНАЯ СЫВОРОТКА РАК МАТКИ РАК ЯИЧНИКОВ Подложки с разными типами поверхности: обращенная фаза, анионообменная, катионообменная. Биомаркер рака яичников Для идентификации белков отличий необходимо их выделение. Детектируются, как правило, хорошо представленные белки. В данном случае – сывороточный амилоид А1

2D электрофорез белков Компьютерный анализ изображений гелей Вырезание и трипсинолиз белков в фрагментах геля Экстракция пептидов и получение MALDI масс-спектра суммарного гидролизата Поиск в базе данных измеренных масс пептидов (пептидный фингерпринт) Post Source Decay-MS, TOF-TOF фрагментация отдельных пептидов Поиск в базе данных измеренных масс фрагментов Стратегия анализа: 2DE + MALDI-MS

2D-Электрофорез Электорофорез по Лэмли: Добавляется додецилсульфат Na: сильный детергент вносит отрицательный заряд Эффективное разделение по массам белков кДа Первое направление – изоэлектрическая фокусировка Второе направление – разделение по массам в полиакриламидном геле Белки, растворенные в неионном детергенте, вносятся в гель с фиксированным градиентом рН

2D-Электрофорез pI Mw kDa 8 Достоинства Реальные параметры разделения Эффективное разделение Полуколичественный метод Ограничения Проблемы с кислыми, щелочными и гидрофобными белками Невысокая воспроизводимость Окраска: Чувствительность: Кумасси голубым 50 нг/пятно Серебром, совместимая с MS анализом 1 нг/пятно Серебром, классическая 0.1 нг/пятно

2D-Электрофорез Окраска DIGE Cy3/Cy5 Электрофорез 2-х предварительно окрашенных белков Mycoplasma gallisepticum проводится на одном геле. Зеленым (Cy3) – белки из контрольных клеток, Красным (Cy5) – белки из обработанных клеток. Достоинства: Очень чувствителен, прекрасное сопоставление пятен, очень точен и удобен для оценки экспрессии белка Недостатки: Недолговечность флуоресценции (сутки), требует дорогих сканеров, непригоден для вырезания пятен без дополнительной окраски серебром

ограничение поиска по видовой принадлежности выбор базы данных учет возможных модификаций пептидов точность измеренных масс список масс пептидных фрагментов Вырезание отдельных белковых пятен (>20 нг/мм 2 ) Трипсинолиз белков в фрагментах геля Получение масс-спектра Схема проведения идентификации белка по его пептидному фингерпринту количество кандидатов

Триптические пептиды Да точность (%) кол-во кандидатов 0.1 > Немного статистики: Среднее количество пептидов разной длины, образующихся в результате полного гидролиза Распределение моноизотопных масс пептидов «уникальные» В базе данных NCBI nr более записей

Критерии достоверности поиска белков в базах данных: peptide fingerprint 1.количество «совпавших» пептидов, в предположении одного белка 2.количество «совпавших» пептидов, в предположении нескольких белков 3.распределение «совпавших» пептидов по точности 4.«уникальность» пептидов 5.перекрывание «совпавшими» пептидами последовательности белка 6.паттерны протеолиза 7.oтклонение массы белка от предполагаемой и т. д. измеренные m/z база данных Приоритет критериев 2, 4, 7 программа Profound Приоритет критериев 1, 5, 6 программа Mascot Score

N Масса Вероятность Описание 1.gi| reading frame [Influenza A virus] 2.gi| M1 [influenza A virus (A/Taiwan/96/1769)] 3.gi| M1 subunit [Influenza A virus] 4.gi| M1 - influenza A virus (strain A/WSN/33) gi| M1 [Influenza A virus (A/Duck/Hong Kong/698/79 (H5N3))] Sequence Coverage: 35% IVPSGPLKAE IAQRLEDVFA GKNTDLEVLM EWLKTRPILS PLTKGILGFV FTLTVPSERG LQRRRFVQNA LNGNGDPNNM DKAVKLYRKL KREITFHGAK EIALSYSAGA LASCMGLIYN RMGTVTTEVA FGLVCATCEQ IADSQHRSHR QMVTTTNPLI RHENRMVLAS TTAKAMEQMA GSSEQAAEAM DIASQARQMV QAMRTIGTHH SSSAGLKDDL LENLQAYQKR MGVQMQRFK 20 кандидатов в порядке убывания достоверности поиска массы 20 кандидатов вероятность случайное совпадение достоверный поиск Идентификация белка заменяется нахождением его ближайшего гомолога Изучаемый белок обычно отличен от имеющегося в базе данных

Accession Mass Score Description 1. gi| CYTOCHROME P450 2E1 2. gi| // gi| // gi| DIMETHYLANILINE MONOOXYGENASE 5. gi| // gi| // gi| // gi| CYTOCHROME P-450 IIC 9. gi| // gi| // gi| //---- …………………… 18. gi| NEBULIN Cпектр гидролизата смеси белков (1DE)

2DE + MALDI-MS - результаты Белковых пятен > 400 Проанализировано >150 Индивидуальных белков Mycoplasma gallisepticum 105 MW pI Mycoplasma gallisepticum strain R Protein coding genes - 726

pI pI А АБ АБ Б pI DЕ карты белков клеточной линии аденокарциномы молочной железы MCF7: контрольной (А) и устойчивой к Hoechst33342 (Б) 2DE карты белков штамма клеток E.coli (А) и штамма-продуцента треонина (Б) 2DE карты клеточных белков двух штаммов Helicobacter pylori Всего видно на геле ~1200 белковых пятен Видимых различий ~ 50 Идентифицировано ~ 30 белков отличия Всего видно на геле ~ 500 белковых пятен Видимых различий ~ 200 Идентифицировано ~ 150 разных белков Из них белки отличия ~ 100 Всего видно на геле ~ 2500 белковых пятен Видимых различий ~ 30 Идентифицировано ~ 10 белков отличия Примеры анализа 2DE карт

Стратегия анализа: 1D - LC + ESI-MS/MS Получение масс-спектров пептидов и их фрагментации Объединение данных и анализ 1D электрофорез белков Вырезание и трипсинолиз белков в полосах геля Экстракция и хроматографическое разделение пептидов

Способы фрагментации пептидов LID – фрагментация, индуцированная лазером CID – фрагментация, индуцированная столкновениями ECD – фрагментация, индуцированная захватом медленных электронов Пептид поглощает энергию лазера, захваченная энергия перераспределяется по молекуле, разрушается ближайшая слабая связь. Основной тип образовавшихся пептидных фрагментов - b-ионы и y-ионы. Может происходить отщепление модификаций. Пептид приобретает энергию от столкновений, захваченная энергия перераспределяется по молекуле, разрушается ближайшая слабая связь. Основной тип образовавшихся пептидных фрагментов - b-ионы и y-ионы. Дополнительно образуются a-ионы и x-ионы. Часто происходит отщепление модификаций. Точный механизм неизвестен. Пептид захватывает медленные электроны на азот пептидной связи, происходит мгновенный разрыв пептидной цепи с образованием z- ионов. Не происходит отщепления модификаций.

Интерпретация спектров распада пептидов TIGTHPSSSAGLK [MH] 2+

1.Отбор из базы данных всех кандидатов, содержащих триптические пептиды указанных m/z 2. «Примерка» спектров фрагментации (MS/MS) : количество «совпавших» фрагментов пептидов «уникальность» спектров фрагментации пептидов 3. Score белка = Score пептидов измеренные m/z база данных Score Критерии достоверности поиска белков в базах данных: peptide fingerprint + MS/MS Score пептидов

1DE + LC-ESI-MS/MS - результаты Проведено 3 эксперимента Белковых полос - 50 Индивидуальных белков Mycoplasma gallisepticum Эксп.1 Эксп.2 Эксп.3 Белки, которые обнаружены хотя бы в 1 эксперименте Белки, которые обнаружены хотя бы в 2 экспериментах Белки, которые обнаружены во всех 3 экспериментах ? MW Белки, которые обнаружены при проведении 2DE+MALDI-MS - 90 Mycoplasma gallisepticum strain R

СОПОСТАВЛЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ: 2DE + MALDI-MS и 1DE + LC-ESI-MS/MS Protein NCBI mW score conserved hypothetical lipoprotein gi| conserved hypothetical lipoprotein gi| conserved hypothetical lipoprotein gi| conserved hypothetical lipoprotein gi| conserved hypothetical lipoprotein gi| Protein NCBI mW score conserved hypothetical lipoprotein gi| conserved hypothetical lipoprotein gi| HepA/SNF gi| conserved hypothetical lipoprotein gi| conserved hypothetical lipoprotein gi| lipoprotein gi| lipoprotein gi| lipoprotein gi| conserved hypothetical lipoprotein gi|

Стратегия анализа: LC + ESI-MS/MS Специфический гидролиз суммарного белка + мечение ICAT Хроматографическое разделение пептидов + MS/MS Достоинства: Анализируются все меченные белки Анализ содержания одного белка в контроле и опыте Ограничения: Не видно взаимных количеств разных белков в образце Артефакты в интерпретации MS/MS Пример: ICAT-метки Выделение цистеинсодержащих пептидов (афинное связывание с авидином)

Интерпретация спектров распада пептидов (LID +CID) Сиквенирование de-novo: определение пар пиков, в сумме дающих массу родительского иона по наличию соседних пиков +/-28, +/-15 определение типа ионов по разнице масс соседних однотипных ионов построение возможных последовательностей

Лабильность пептидной связи убывает в ряду D/P D/ E/ N/ Q/ l/ L/ T/ S/ A/ V/… Степень фрагментации зависит от многих параметров и плохо предсказуема. Ограничения cиквенирования de-novo при использовании MALDI-TOF-MS : * не бывает равномерного разбиения по всем пептидным связям * не хватает точности измерения для однозначной интерпретации MALDI фрагментация пептидов (LID +CID)

Определение пост-трансляционных модификаций белков Модификации in vitro: Модификации белков после их разделения в ПААГ цистеины алкилированы йодоацетамидом (в геле) Лизоцим Т11 Т9 Т6 Т13 Т13-14 Cys + I ацетамид Cys + акриламид Met окислен Модификации in vivo: Изучение S-S мостов

О-гликозилированный пептид SAPASTTQPIGSTTSTTTK сахарный остаток галактоза (верх) либо фукоза (низ) Сахарный остаток локализован на N-концевом серине ? Стабильность различных модификаций белков в условиях получения масс-спектров (LID + CID) Pi N-ac Фрагмент спектра трипсинолиза природного (верх) и генно-инженерного (низ) белка Такова степень фосфорилирования ? Связи менее устойчивые, чем пептидная: фосфоэфирная гликозидная дисульфидная (иногда)

Стабильность различных модификаций белков в условиях получения масс-спектров (LID + CID) Связи сопоставимые по устойчивости с пептидной: тиоэфирная любая амидная - N-ацетилирование дисульфидная (иногда) Пептид, модифицированный тремя пальмитатами (тиоэфирная связь) Пептид N- ацетилирован, а цистеин модифицирован янтарным ангидридом (тиоэфирная связь)

Сравнение подходов при определении белкового состава сложной многокомпонентной смеси Выделение белка Гидролиз специфическими протеазами - соотнесение значений масс пиков в спектре с первичной структурой. Определение пептидов отличных по массе от рассчитанной – гипотезы о природе модификации Индивидуальный подход к получению структурной информации из спектров фрагментации – выбор типа фрагментации, использование ферментов для дальнейшего расщепления пептида, удаления модификации, химические подходы... Стратегия определения модификаций:

Литература: * Говорун В.М., Арчаков А.И. Протеомные технологии в современной биомедицинской науке. Biochemistry (Mosc) Oct;67(10): * Lottspeich F. Proteome Analysis: A Pathway to the Functional Analysis of Proteins. Angew Chem Int Ed Engl Sep;38(17): * M.Mann, R.C.Hendrickson, A.Pandey, Analysis of proteins and proteomes by mass spectrometry, Annu. Rev. Biochem., 70, (2001). * O.N.Jensen, M.Wilm, A.Shevchenko, M.Mann, Sample preparation methods for mass spectrometric peptide mapping directly from 2-DE gels, Methods Mol. Biol., 112, (1999). * B.Kuster, T.N.Krogh, E.Mortz, D.J.Harvey, Glycosylation analysis of gel-separated proteins, Proteomics, 1, (2001). * Aebersold R, Goodlett DR Mass spectrometry in proteomics Chem Rev 2001 Feb;101(2): * Nordhoff E, Egelhofer V, Giavalisco P, Eickhoff H, Horn M, Przewieslik T, Theiss D, Schneider U, Lehrach H, Gobom J. Large-gel two-dimensional electrophoresis-matrix assisted laser desorption/ionization-time flight-mass spectrometry: an analytical challenge for studying complex protein mixtures. Electrophoresis Aug;22(14): * Roepstorff P MALDI-TOF mass spectrometry in protein chemistry.. EXS 2000;88:81-97 * Gygi SP, Aebersold R. Using mass-spectrometry for quantitative proteomics Proteomics: A Trands Guide 2000, * Andersen JS, Mann M Functional genomics by mass spectrometry. FEBS Lett Aug 25;480(1):25-31 * Kussmann M, Roepstorff P Sample preparation techniques for peptides and proteins analyzed by MALDI-MS. Methods Mol Biol. 2000;146: * Chaurand P, Luetzenkirchen F, Spengler B. Peptide and protein identification by matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) and MALDI-post-source decay time-of-flight mass spectrometry. J Am Soc Mass Spectrom Feb;10(2): * Spengler, B, Post-source decay analysis in matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of biomolecules. J. Mass Spectrom., 32(10) (1997). * Jonscher, KR and Yates, JR, 3rd, The quadrupole ion trap mass spectrometer--a small solution to a big challenge. Anal Biochem, 244(1) 1-15 (1997). * Qin, J and Chait, BT, Identification and characterization of posttranslational modifications of proteins by MALDI ion trap mass spectrometry. Anal Chem, 69(19) (1997). * Papayannopoulos, IA, The interpretation of collision-induced dissociation tandem mass spectra of peptides. Mass Spectrom. Rev., 14(1) (1995). * Hillenkamp, F, Karas, M, Beavis, RC and Chait, BT, Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of biopolymers. Anal. Chem., 63(24) 1193A-203A (1991). * Fenn, JB, Mann, M, Meng, CK, Wong, SF and Whitehouse, CM, Electrospray ionization-principles and practice. Mass Spectrom. Rev., 9(1) (1990)