Универсальная технологическая платформа на основе рекомбинантных аденовирусных наночастиц для создания вакцин и лекарственных средств Д.Ю.Логунов, М.М.Шмаров, Б.С.Народицкий, А.Л.Гинцбург Universal technological platform based on recombinant adenoviral nanoparticles for vaccine and medicine creation

К наноструктурам как искуственного так и природного происхождения, которые выступают в качестве основы для создания медицинских лекарственных и профилактических препаратов существует три требования: 1)Они должны быть эффективны (т.е.должны выполнять те уникальные функции, которые в них закладываются исследователями и которые напрямую связаны с их наноразмерами. They must be effective ( are able to execute unique functions, which are determined by scientists and directly bound with their nanosize ) 2) Они должны быть безопасны (то есть биосовместимы и биодеградабельны) They must be safe (biocompatible and biodegradable) 3) Работа с этими структурами должна быть технологичной (наноструктуры должны обеспечивать исследователю максимальную свободу в выборе их модификаций) Nanostructures must provide to researcher maximum of liberty in chosing their modifications Для создания медицинских препаратов желательно иметь наноструктуры, которые можно использовать в качестве универсальной технологической наноплатформы, обладающей всеми вышеперечисленными свойствами Требования предъявляемые к наноструктурам, являющихся основой медицинских лекарственных и вакцинных препаратов Requirements for nanostructures that used as basis for vaccines and medical drugs

Общая схема модификации аденовирусных наночастиц General scheme of modification of adenoviral nanoparticles 1) 2) 3) Модификация генома вируса Viral genome modification Генетическая модификация белков оболочки вируса Genetic modification of viral capsid proteins Физико-химическая модификация капсида вируса Physical ans chemical modification of viral capsid 4) Создание вирусоподобных структур не содержащих генетического материала Creation of virus-like structures, which dont contain genetic material Генетическая вакцинация и терапия Gene vaccination and therapy Направленная тканеспецифичная доставка генов Directed tissue-specific gene delivery Использование наноконтейнеров для доставки лекарственных средств Диагностика, вакцинация (Imaging, vaccination) Применение (application): В настоящее время разработаны удобные и гибкие схемы модификаций, которые превращают аденовирусы в наноструктуры с заданными свойствами

Структурная организация аденовирусной наночастицы Structural organization of adenoviral particle - Представляет собой физическую самособирающуюся наноструктуру. (Represents physical autoassembling nanoparticle). - Содержит делетированный геном, неспособен к размножению in vitro и in vivo. (Contains replicative defective genome, unable to replicate in vitro and in vivo). -Обеспечивает доставку (и экспрессию) встроенного чужеродного генетического материала в клетку. (Provides delivery and expression of foreign genetic information in target cells). Фибер (Fiber) ДНК (DNA) Гексон (Hexon) Целевой ген (Gene of Interest) нм

Features of adenoviral nanoparticle: Safety: -doesnt cause viral infection; - doesnt integrate into genome of target cells; - eliminates from organism during 4- 5 weeks. Efficiency: - is able to penetrate both proliferating and quiescent cells; -provides high-performance expression of therapeutic genes ; -induces humoral and cytotoxic immune response against foreign antigen; -doest need any adjuvant. Безопасность:Безопасность: - не вызывают вирусной инфекции; -не встраиваются в геном клеток- мишеней; -Нетоксичны; - выводятся из организма в течении 4- 5 недель (биодеградабельны). Свойства аденовирусных наночастиц: Эффективность:Эффективность: - способны проникать в широкий спектр как делящихся, так и неделящихся клеток; - осуществляют высокоэффективную экспрессию генов терапевтического вмешательства; - индуцируют гуморальный и цитотоксический иммунный ответ на экспрессируемый чужеродный антиген; Не требуют адъювантов.

- Economically well- founded technologies of adenoviral nanoparticles production in semi- industrial scale are developed Economy: Features of adenoviral nanoparticle: (continuation) Свойства аденовирусных наночастиц: (продолжение) Экономичность:Экономичность: - Разработаны экономически обоснованные технологии получения аденовирусных наночастиц в промышленном масштабе. С использованием таких рекомбинантных аденовирусных наночастиц проведено и проводиться более 300 различных клинических исследований в которых показана их безопасность и эффективность. Два препарата разрешены для клинического применения.

target gene E1 region Аденовирусная ДНК (Adenoviral DNA) target gene Сборка аденовирусных наночастиц (adenoviral nanoparticles assembling) HEK293 клетки содержащие в своем геноме область Е1 генома аденовируса (HEK293 cells, which include adenoviral E1 region in their genome) Аденовирусная наночастица (Adenoviral nanoparticles) Схема конструирования рекомбинантных аденовирусных наночастиц (Constructing scheme of recombinant adenoviral nanoparticles)

Защита мышей иммунизированных Ad-HA5-2 и цыплят иммунизированных Ad-HA5-1 после заражения вирусами гриппа (50LD 50 ) H5N2 и H5N1, соответственно. Protection of mice immunized with Ad-HA5-2 vaccine and chiken immunized with Ad-HA5-1 from mortality after challenge with lethal doses of influenza viruses H5N2 and H5N1, consequently Диаграмма выживаемости мышей (Survival diagram ) Дни (days) % живых мышей Диаграмма выживаемости цыплят (Survival diagram ) % живых цыплят Дни (days)

Механизм формирования противогриппозного иммунитета Mechanism of formation of antiinfluenza immunity Плазматическая В-клетка Plasma cell Наивная В-клетка Naïve B-cell Т-хелпер Т-киллерный лимфоцит T-killer lymphocyte Индукция апоптоза Эпителиальные клетки Epithelial cells IL-4,5,6 IgG IgA INFγ IL-2 Антителозави- симая клеточная цитотоксичность Antibody-dependent cellular cytotoxicity Нейтрализация вируса гриппа Influenza virus neutralization Индукция апоптоза Активация и клональная пролиферация Activation and clonal proliferation IgG Аденовирусная наночастица, экспрессирующая ген гемагглютинина вируса гриппа Гемагглютинин (haemagglutinin) (HA) Т-клеточный рецептор (TCR) В- клеточный рецептор (BCR) Apoptosis induction Apoptosis induction

Результаты по защите животных (способность обеспечивать защиту против нескольких гетерологичных штаммов вируса гриппа птиц) и данные по особенностям развития специфического иммунитета (при использовании рекомбинантных аденовирусных наночастиц, экспрессирующих ген гемагглютинина) позволяют сделать заключение о перспективности и уникальности созданных вакцин против вируса гриппа птиц H5N1.

Использование рекомбинантных аденовирусных наночастиц в качестве терапевтических средств Usage of recombinant adenoviral nanoparticles as therapeutic agents Геном аденовируса (Ad genome) Терапевтический ген (therapeutic gene) Факторы роста (growth factors) (VEGF, IGF), Ангиогенин (angiogenin) (ANG) - хроническая ишемия нижних конечностей, неиродегенеративные заболевания (chronic limb ischemia, neurodegenerative diseases) - противовирусная и противоопухолевая терапия (antiviral and antitumoral therapy) Интерфероны (interferons) (IFNs) Терапевтический ген (therapeutic gene): Заболевание (disease):

Общая схема модификации аденовирусных наночастиц General scheme of modification of adenoviral nanoparticles 1) 2) 3) Модификация генома вируса Viral genome modification Генетическая модификация белков оболочки вируса Genetic modification of viral capsid proteins Физико-химическая модификация капсида вируса Physical ans chemical modification of viral capsid 4) Создание вирусоподобных структур не содержащих генетического материала Creation of virus-like structures, which dont contain genetic material Генетическая вакцинация и терапия Gene vaccination and therapy Направленная тканеспецифичная доставка генов Directed tissue-specific gene delivery Использование наноконтейнеров для доставки низкомолекулярных лекарственных средств Диагностика, вакцинация (Imaging, vaccination) Применение (application):

Внесение гетерологичных молекул в структуру белков оболочки вируса (Incorporetion of heterologous molecules in structure of capsid proteins) Возможные варианты модификации капсидов рекомбинантных аденовирусных наночастиц Possible variants of recombinant adenoviral nanoparticle capsid modification Модификация оболочки вируса посредством введения в его структуру эпитопов антигенов или рецептор связывающих гетерологичных пептидов ( Capsid modification by introdusing in sructure of capsid proteins antigen epitopes or receptor-binding heterologous peptides Замена фибрилл на различные рецептор связывающие молекулы (The exchange of fiber for various receptor-binding molecules)

Logunov D.Y. et al. J Virol, 2007, v.81, pp.9641–9652. Эффективность доставки генетической информации капсид модифицированными аденовирусными наночастицами Efficiency of gene transfer by capsid modified adenoviral nanoparticles Клеточные линии

Внесение гетерологичных последовательностей в структурный белок pIX аденовирусной наночастицы Incorporation of heterologous molecules in structural protein pIX of adenoviral nanoparticle Белок pIX (Capsid protein pIX) Экспрессия на поверхности аденовирусной наночастицы молекул интереса: Expression of molecules of interest on recombinant adenoviral nanoparticle surface: Различных маркерных молекул (флуоресцентные и люминисцентные белки) (various markers, such as fluorescent and luminescent proteins) В настоящее время данный подход активно используется для визаулизации (контроля) таргетности доставляемых терапевтических трансгенов. (Such approach can be used for visualization (for controling) of direct delivery of therapeutic genes) Антигенов ( с мол. массами до 40кДа) (high-molecular antigen with m.w. up to.40kDa)

Общая схема модификации аденовирусных наночастиц General scheme of modification of adenoviral nanoparticles 1) 2) 3) Модификация генома вируса Viral genome modification Генетическая модификация белков оболочки вируса Genetic modification of viral capsid proteins Физико-химическая модификация капсида вируса Physical ans chemical modification of viral capsid 4) Создание вирусоподобных структур не содержащих генетического материала Creation of virus-like structures, which dont contain genetic material Применение (application): Генетическая вакцинация и терапия Gene vaccination and therapy Направленная тканеспецифичная доставка генов Directed tissue-specific gene delivery Использование наноконтейнеров для доставки низкомолекулярных лекарственных средств Диагностика, вакцинация (Imaging, vaccination)

Физико-химическая модификация рекомбинантной аденовирусной наночастицы с использованием структурного белка pIX Physical ans chemical modification of recombinant adenoviral nanoparticle using pIX structural protein Белок оболочки pIX (pIX capsid protein) Гексон (hexon) Полисахарид связывающий домен (polysaccharide binding domain) Полисахарид (декстран, целлюлоза) Polysaccharide (dextran, cellulose) Оболочка вируса (viral capsid) Полисахарид связывающий домен (polysaccharide binding domain) Спейсер (spacer) Антиген (antigen) Полисахарид связывающий домен (polysaccharide binding domain) Антиген (antigen) Схема модифицированной аденовирусной наночастицы Scheme of modified adenoviral nanoparticle В настоящее время, используя модифицированный белок рIX, (в состав которого введен карбогидратсвязывающий домен) показана возможность иммобилизации на поверхности Ад наночастицы, различных протективных антигенов Такая схема модификации Ад наночастиц позволяет нам дополнительно задействовать традиционный подход для иммунизации

Общая схема модификации аденовирусных наночастиц General scheme of modification of adenoviral nanoparticles 1) 2) 3) Модификация генома вируса Viral genome modification Генетическая модификация белков оболочки вируса Genetic modification of viral capsid proteins Физико-химическая модификация капсида вируса Physical ans chemical modification of viral capsid 4) Создание вирусоподобных структур не содержащих генетического материала Creation of virus-like structures, which dont contain genetic material Генетическая вакцинация и терапия Gene vaccination and therapy Направленная тканеспецифичная доставка генов Directed tissue-specific gene delivery Использование наноконтейнеров для доставки низкомолекулярных лекарственных средств Диагностика, вакцинация (Imaging, vaccination) Применение (application):

ВЫВОД (Conclusion) Аденовирусы представляют собой универсальную технологическую платформу структурно-функциональная организация которой позволяет получать широкий спектр наночастиц с заданными свойствами. Такие наноструктуры являются основой для создания средств профилактики и терапии различных заболеваний. Adenoviruses present an versatile technological platform, which structural-functional organization allow to obtain broad spectrum of nanoparticles with intended properties. Such nanostructures form the basis for creation vaccines and therapeutics.

Схема модификации гена гексона (Scheme of Hexon gene modification) Ген гексона (Hexon gene) гексон (hexon) фибер (fiber) пентон (penton) Модификация гена гексона (Modification of hexons gene region) Геном аденовируса (аdenoviral genome) Последовательность ДНК кодирующая лиганд (DNA sequence encodes ligand) Тример гексона (Hexon trimer) Мономер гексона (Hexon monomer) Последовательность кодирующая петлю (Sequence encoding loop) Тример гексона (Hexon trimer) Мономер гексона (Hexon monomer) Последовательность ДНК кодирующая лиганд (DNA sequence encodes лиганд) Для придания Ад наночастице заданных свойств производится направленная модификация гена путем введения в него последовательности кодирующей рецептор связывающий мотив. В результате такой модификации при сборке Ад наночастицы получается новая наноструктура с заданными свойствами.

Nanotechnology – is a branch of molecular technology which is focused on construction of nanostructures, consisting of self-assembling modules, with predetermined properties. Нанотехнология – отрасль молекулярной технологии, ориентированная на получение наноструктур, состоящих из самособирающихся модулей, с заданными свойствами. Nanoparticles – objects with size up to 100nm with unique physical and chemical properties appearing as a consequence of their sizes. Наночастицы – это объекты размером до 100 нм с уникальными физико- химическими свойствами, возникающими благодаря их размерам.

Вирусы – платформа для создания лекарственных и вакцинных препаратов В структуре природных вирусных наночастиц присутствует большое количество функциональных групп, которые могут использоваться в качестве основы для создания комплексных наноструктур. Более того структурно-функциональная организация этих групп позволяет проводить различные их модификации как физико-химическими, так и генно-инженерными методами. (Donath и Fischlechner, 2007). Физико-химическая модификация Использование вирусов в качестве наноконтейнеров Коньюгация вирусов с Ат,Аг, 1) 2) 3) Создание квантовых точек Генетическая модификация 1) 2) Вирусная частица (viral particle) Модификация генома вируса Модификация структурных белков капсида вируса

Специфичность Толл-подобных рецепторов (TLRs) Specifity of Toll-like receptors (TLRs) Lipoproteins Lipoarabidomannan Lipoteihoic acids Zymosan (yeasts) LPS Flagellin T.gondi Профилин Nonmethylated CpG DNA dsRNAssRNA Бактериальные компоненты Bacterial components Вирусные компоненты Viral components Решая задачу распознавания и защиты от патогенов, эволюция многоклеточных создала молекулы- рецепторы, способные узнавать консервативные признаки всех классов микроорганизмов. Эти рецепторы, о существовании которых стало известно лишь 10 лет назад, называются Toll-подобными. С помощью 11 типов Toll рецепторов клетки иммунной системы, в первую очередь, профессиональные фагоциты узнают консервативные компоненты практически всех микроорганизмов, в более общей форме полимеры органического происхождения чужеродные для многоклеточного организма. Лиганд- рецепторное взаимодействие запускает весь комплекс реакций врожденного иммунитета. TLR6

Immunobiological preparations based on adenoviral nanoparticles, which are developed at Gamaleya Research Institute in collaboration with other organizations Modified technology of adenoviral nanoparticles constructing is developed. Routine practice of obtaining purified (10 12 particles/ml) adenoviral nanoparticles is developed The following candidate vaccines based on human and avian recombinant adenoviral nanoparticles are obtained: - vaccine against Rabies virus (Ad-gpG), Protect 90% of immunized animals (mice, chickens) infected with highly pathogenic rabies virus - vaccine against avian influenza (H5N1), Protect 95% of immunized animals chickens (naturally susceptible to influenza) infected with highly pathogenic influenza H5N1 virus -The study was carried out in collaboration with the All-Russia Institute for Animal Defense

Types of nanostructures 1. Abiogenous origin: fullerens (consist of carbon) nanotubes (consist of carbon) dendrimers (consist of low- molecular organic compounds polymerizing in process of nanoparticle formation) nanoemulsion (liposomes, etc) nanoparticles ( consist of aurum and other metalls)

Types of nanostructures 2. Biogenous origin : pseudoviral nanoparticles (have deletions in their genome and are capable to replicate, only in a special cell lines) nanoparticles (devoided of genome) natural biopolymers (polysaccarides, proteins)

1. Biocompatible and biodegradable nanoparticles are nontoxical carriers for vaccine-valuable components, capable to provide effective delivery of an antigenic material and controllable time of persistence in an organism. 2. Nanoparticles are carriers (glycans, chitosan, etc.) that capable act as immunomodulators and adjutants, stimulating nonspecific immune response via Toll-like receptors and providing prolonged liberation of antigen. Why nanotechnologies are necessary in vaccine development: 1. Биосовместимые и биодеградирующие наночастицы – нетоксичные носители вакцинно- ценных компонентов, способны обеспечивать эффективную доставку антигенного материала и контролируемое время пребывания в организме. 2. Наночастицы – носители (гликаны, хитозан и др.) способны выступать в роли иммуномодуляторов и адъювантов, стимулируя неспецифицеский иммунный ответ через Толл-подобные рецепторы и обеспечивая пролонгированное высвобождение антигена. Почему нужны нанотехнологии при разработке вакцин:

3. Allow to create a technology of purification, immobilization and antigen concentration on polymeric matrices in one step. 4. Allow to unify vaccine production technologies against various spicies of bacterial and viral pathogens. 5. Allow to receive multicomponent vaccines against several pathogens on one nanocarrier. 3. Позволяют создать технологию, решающую проблему очистки, иммобилизации и концентрации антигенов на полимерой матрице в одну стадию. 4. Позволяют унифицировать технологии производства вакцин против различных видов бактериальных и вирусных патогенов, 5. Позволяют получать многокомпонентные вакцины против нескольких возбудителей на одном наноносителе. Why nanotechnologies are necessary in vaccine development: (continuation) Почему нужны нанотехнологии при разработке вакцин: (продолжение)

Интраназальная иммунизация вирусами Ad- HA5-1 or Ad-HA5-2 (10 7 БОЕ/мышь) (An intranasal administration by viruses Ad- HA5-1 or Ad-HA5-2 (10 7 PFU/mouse)) Пробой вирусом H5N2 A/Mallard Duck/Pennsylvania/10218/ 84 50LD 50 (Challenge with A/Mallard Duck/Pennsylvania/10218/8 4(H5N2) 50LD 50 3 недели (3 weeks) Отбор образцов сыворотки крови для определения титра гемагглютинин ингибирующих антител (Obtaining the serum samples for detection of hemagglutinin inhibition antibodies) Схема эксперимента (Experiment scheme) 3 недели (3 weeks) Интраназальная иммунизация вирусами Ad- HA5-1 or Ad-HA5-2 (10 7 БОЕ/мышь) (An intranasal administration by viruses Ad- HA5-1 or Ad-HA5-2 (10 7 PFU/mouse)) Пробой вирусом H5N2 A/Mallard Duck/Pennsylvania/10218/ 84 50LD 50 (Challenge with A/Mallard Duck/Pennsylvania/10218/8 4(H5N2) 50LD недель (15 weeks)

недели после иммунизации (weeks after immunization) ln2 титр антител (antibody titer) Титр антител после иммунизации Ad-HA5-1, Ad-HA5-2, Ad-null (Antibody titer after Ad-HA5-1, Ad-HA5-2, Ad-null immunization)

Защита мышей инфицированных 50LD 50 H5N2 через 21 неделю после иммунизации Ad-HA5-1 и Ad-HA5-2. (Protection of mice immunized with Ad-HA5-1 and Ad-HA5-2 vaccine from morbidity and mortality following challenge with a lethal H5N2 virus at 21 week after immunization). Выживаемость Диаграмма выживаемости мышей после иммунизации (Survival diagram ) % живых мышейДни (days) Диаграмма потери веса в % от нормы (Weight change diagram) Дни (days) % веса от нормы

Интраназальная иммунизация вирусом Ad-M-Fl, Ad-M (10 8 БОЕ/мышь). An intranasal administration by viruses Ad-M-Fl, Ad-M4-Fl or Ad-M (10 8 PFU/mouse) 3 недели (3 weeks) Схема эксперимента (Experiment scheme) Интраназальная иммунизация вирусом Ad-M-Fl, Ad-M (10 8 БОЕ/мышь). An intranasal administration by viruses Ad-M-Fl, Ad-M4-Fl or Ad-M (10 8 PFU/mouse) 3 недели (3 weeks) Пробой вирусом H5N2 A/Mallard Duck/Pennsylvania/10218/ 84 50LD 50 (Challenge with A/Mallard Duck/Pennsylvania/10218/8 4(H5N2) 50LD 50 Отбор образцов сыворотки крови для определения титра гемагглютинин ингибирующих антител (Obtaining the serum samples for detection of hemagglutinin inhibition antibodies)

Общая схема модификации Химическая модификация Использование вирусов в качестве наноконтейнеров Коньюгация вирусов с Ат,Аг, 1) 2) 3) Создание квантовых точек Генетическая модификация 1) 2) 3) Вирусная частица (viral particle) Модификация генома вируса Модификация отростков капсида вируса Модификация капсида вируса

Химерные белковые наноструктуры экспрессируемые в составе аденовирусных векторов Схематичное изображение химерного гена Схематичное изображение белковой наноструктуры Сигнальная последовательность Fc-фрагмент антитела Изолейчиновая молния Спейсер Антиген

Активирование гуморального звена приобретённого иммунного ответа. Т-клеточно - независимые антигены Плазматические В-клетки Т-клеточно - зависимые антигены Наивные В-клетки Т-хелпер MHCII TCR CD40RCD40L BCR TLR Отсутствие поляризующих цитокинов IL-4 IL-5 INF-γ IgG2a, IgG1, IgG3 IgM IgE IgG2b, IgA Активирование комплемента, нейтрализация токсинов и вирусов, опсонизация, антитело-зависимая клеточная цитотоксичность Ответ к аллергенам, тип I гиперчувст-вительности Защита слизистых поверхностей и крови Активирование системы комплемента, нейтрализация токсинов и вирусов

Protection of mice immunized with Ad-M-Fl, and Ad-M4-Fl and Ad-M vaccine from morbidity and mortality following challenge with a lethal H5N2 virus at 3 week after immunization. Результаты по антителам