ПОСТТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ БЕЛКОВ ( известно более 100 приемов) Фолдинг Сплайсинг белков (отщепление сигнальной последовательности, вырезание интеина и лигирование экстеинов, например инсулина ) Убиквитирование Метилирование Глутатионирование Фосфорилирование Гидроксилирование Трансглютаминирование Гликозилирование

В белках могут быть множественные сигналы, определяющие их транспорт и локализацию в клетке. За эту сигнальную гипотезу Блобель получил Н.П. Сигн. Последовательность может быть на N конце или внутри белка, представляя собой конформационную структуру. Сигн. Посл-ь – это точный адрес- с каким рецептором и каким путем пойдет белок Сначала сигн. Посл-ь соединяется с рецепторм на ЭПР и прикрепляет рибосому к ЭПР, далее синтезированная цепь втягивается в полость ЭПР

Далее может образоваться везикула, которая сливается с аппаратом Гольджи. Именно такой путь у инсулина. Сначала образуется длинный предшественник. Потом в полости ЭПР от него отщепляется сигнальный пептид, а в аппарате Гольджи протеиназа выщепляет из него фрагмент с 31-по 65АМК, после чего две цепи соединяются дисульфидными связями. Знание сигнального пептида необходимо для получения инженерным путем белков, полноценных, а не таких, какие синтезируют например трансгенные бактерии Необходимо это знание и для изучения некот патологий, при которых страдают трансп. Сигналы белков

В биотехнологии при суперпродукции белка в клетке продуценте может не происходить правильный фолдинг. Белковая инженерия требует предсказания пространственной структуры белка на основк его АМК последовательности

Связи, образующие конформацию белка 1.Водородные 2.Электростатические 3. Ковалентные 4. Гидрофобные

Если в состав белка входят все 20 АМК и он состоит из 100 аминокислотных остатков, возможно образование 10 в 130степени вариантов Парадокс Левинталя - белку в 100 АМК потребовалось бы 10 в 11 степени лет для случайного перебора и достижения нативной конформации

Анфинсен показал, что РНК-аза in vitro после денатурации способна свернуться в нативную структуру в течение долей сек Также присходит фолдинг однодоменных белков цитохрома С и лизоцима и др. In vivo другие условия Синтез пептида идет в направлении от N конца к C концу. Значит N конец может начать сворачивание, пока С конец еще не синтезировался. Отдельные домены могут формировать нативную структуру отдельно от всего пептида

ШАПЕРОНЫ Открытие Анфинсена Первый молекулярный шаперон - нуклеоплазмин Белки теплового шока - шапероны Отсутствие шаперонов в искусственной системе синтеза – причина функциональной неактивности белка

Фолдинг протекает в несколько стадий Сначала быстро образуется вторичная структура за счет водородных связей и затем тоже быстро – третичная структура. После этого – медленная стадия образования спец конформации в основном за счет гидрофобных взаимодействий. Здесь возможны ошибки. Чтобы не прошла неспециф агрегация, работают шапероны

Шапероны Препятствуют незаконной связи Разворачивают белок, чтобы он не застрял в поре или мембране Многие белки по долгу службы разбираются и собираются. Например разборка и сборка нуклеосом после репликации.Ш следят, чтобы это было без ошибок После стресса белки могут слипаться после денатурации. Ш помогают образовать нужные структуры Облегчают правильную укладку, затрудняя неправильную Поэтому искуств. белки м.б.неактивны

Шапероны - связываются с полностью или частично развернутой молекулой, экранируют его гидрофобные группы и передают ее шаперонину Шаперонины – сложные белки из многих субъединиц, похожи на бочки с крышками. Шаперон приносит белок в полость бочки, где есть условия для его правильного сворачивания, после чего крышка открывается и готовая функциональная молекула белка покидает шаперонин. Шапероны и шаперонины могут исправлять поврежденную структуру белка. Например, при стрессе, тепловом шоке. Поэтому эти белки наз. Белками теплового шока. Если исправить не удается, белок д.б. разрушен в протеасоме – это тоже сложный белок, образующий полость.

Многие белки работают в комплексе с липидами и углеводами. Образование таких комплексов происходит в аппарате Гольджи

Ферменты, участвующие в фолдинге белка 1.ПДИ – протеиндисульфидизомераза (перемещает дисульфидные связи в полипептидной цепи) 2.ППИ – пептидилпролинизомераза ( контролирует цис- и трансизомеризацию пролина) 3.Шапероны – помогают при фолдинге, метят состарившиеся белки, переносят белки через мембраны митохондрий 4. Защищают белки от деградации при стрессе, например, тепловом

Прионы- особый класс инфекционных агентов, чисто белковых, не содержащих нуклеиновых кислот, вызывающих тяжёлые заболевания центральной нервной системы у человека и ряда высших животных (т. н. «медленные инфекции»).

Прионный белок, обладает аномальной трёхмерной структурой.

Трехмерные структуры С- концевых участков белков PrPC (слева) и PrPSc. Фиолетовым цветом окрашены альфа-спирали, зелёным бета тяжи.

Микрофотография губкообразных изменений в коре большого мозга, вызванных прионами (болезнь Крейтцфельдта-Якоба).

Прионные заболевания человека: Болезнь Кройтцфельда- Якоба (спонтанная, наследственная, ятрогенная, новый вариант) Фатальная семейная бессонница Болезнь Куру Синдром Герстманна- Штройслера- Шейнкера

Стенли Прузинер «БЕЛКОВАЯ» ЭПИГЕНЕТИКА : амилоидозы, прионы и «белковая наследственность»

ПРИОНЫ- вызывают губчатые энцефалопатии Некоторые белки переносят информацию, благодаря конформационной перестройке уже синтезированных молекул Д.К.Гайдушек и Б.С.Бламберг – 1976 год – установили причину инфекционного заболевания куру, которым был поражено 1% населения Новой Гвинеи (Н.П.) Сходные заболевания человека – синдром Кройцфельда- Якоба,Синдром Герштмана-Штресслера-Шейнкера, смертельная семейная бессонница У овец – скрепи, у коз, коров, оленей - бешенство

Болезни как результат нарушения фолдинга белков или конформационные болезни агрегаты могут вызывать болезни – амилоидоз, катаракта и др Прионовые заболевания Болезнь Альцгеймера Синдром Марфана Куриная слепота Злокачественные опухоли (нарушение фолдинга р53)

Болезнь Паркинсона Болезнь Гантингтона Боковой амиотрофический склероз Фиброзно-кистозная дегенерация

Прионовые заболевания 1.Куру 2.Скрепи 3.Губчатая энцефалопатия норок, коров, оленей 4.Синдром Кройцфельда – Якоба 5.Синдром Герштмана-Штресслера-Шейнкера 6.Семейная фатальная бессонница Феномен прионизации обнаружен у многих белков разных видов

Статистика смертности ГЭ коров Англия – Бельгия – 125 Германия – 312 Дания – 13 Испания – 412 Нидерланды – 75 Португалия – 875 Польша – 14 Франция – 891 Швейцария – 453 Ирландия – 1353 Италия БКЯ людей Всего в других странах 0 10 человек

Пути распространения БКЯ среди людей Мутации в гене приона – 1 на 10млн человек Попадание аномальных прионов с мясом КРС Донорская кровь Трансплантация тканей ( твердой оболочки) Инструментарий при операциях Инкубационный период 3-5 лет, а на мясо коров Берут обычно в возрасте до 2 лет

ВИЗУАЛИЗАЦИЯ ПРИОННЫХ АГРЕГАТОВ В КЛЕТКАХ [PSI + ] S. cerevisiae Растворимые молекулы Sup35N-GFP равномерно распределяются по цитоплазме. клетки [psi - ] клетки [PSI + ] Прионные молекулы Sup35N-GFP образуют бляшки агрегатов. Sup35 + Sup35N-GFP

PrP C =43% =3% PrP Sc =34% =43% PrP C PrP Sc CONVERSION

В клетке работают два типа матричных процессов 1.Матрицы 1 рода – это линейная последовательность ( репликация, транскрипция, трансляция) 2. Матрицы 2 типа - конформационные В клетке они взаимодействуют В норме есть процессы, напоминающие прионизацию, – -Сборка и разборка микротрубочек -Сборка и разборка оболочки ядра -Образование спендерина паутины и др.

Нативная форма прионового белка – это связанный с клеточной мембраной и содержащий множество остатков пролина глиопротеин Содержит много альфа-спиралей и мало бета-структур. Растворим в детергентах, чувствителен к действию протеиназ, не образует агрегатов

Клетки, пораженные прионами

Proteinacious infection - прион С.Прусинер – создатель гипотезы protein only. Н.П. Белки –прионы обнаружены у дрожжей и некоторых др. грибов Список Вейсмана включает белки – потенциальные прионы

Хроническая изнуряющая болезнь диких оленей и лосей в США Предполагают, что болезнь распространилась с биостанции в Футхилсе в штате Колорадо, затем перешла в исследовательский центр в штате Вайоминг и далее в штат Небраска Не исключено, что заболевание передается мочой животных, содержащей прионы Эффективное средство борьбы – массовое уничтожение

Лечение прионовых заболеваний Противомалярийные препараты – хлолпромазин, хинакрин Тетрациклин Яд гремучей змеи Некоторые лекарства опаснее самих болезней- Сенека

Агрегация белков Это следствие неправильного фолдинга Теплового стресса Окислительного стресса Осмотического стресса Вирусной инфекции Неравномерного синтеза субъединиц гетероолигомерных белков Экспонирование на поверхности белка Гидрофобных АМК Агрегация белков является причиной таких заболеваний как паркинсонизм, болезнь Альцгеймера и др., при которых проявляется недостаточность шаперонной и протеасомной функций