КОНЪЮГИРОВАННЫЕ С ПОЛИОКСИДОНИЕМ ЛЕКАРСТВА НА ОСНОВЕ ЭНЗИМОВ И ИНТЕРФЕРОНОВ КОНЪЮГИРОВАННЫЕ С ПОЛИОКСИДОНИЕМ ЛЕКАРСТВА НА ОСНОВЕ ЭНЗИМОВ И ИНТЕРФЕРОНОВ д.х.н., профессор Некрасов А.В. к.х.н., Пучкова Н.Г. НПО «Петровакс Фарм» Москва, Россия НПО «Петровакс Фарм» Москва, Россия

улучшенный фармакокинетический профиль – значительное увеличение периода полужизни высокая биологическая активность в условиях in vivo повышение конформационной устойчивости длительная локализация физиологически активной молекулы в органах-мишенях обеспечение защиты белка от сывороточных ингибиторов и протеаз

БЕЛОК БЕЛОК - средство направленной доставки системы к органам-мишеням длительное время способен осуществлять свою прямую активность НОСИТЕЛЬ НОСИТЕЛЬ - обеспечение транспорта физиологически-активного белка обеспечение высокой локальной концентрации активного белка собственная фармакологическая активность

Выраженная фармакологическая активность Отсутствие побочных эффектов, низкая острая и хроническая токсичности Выведение из организма Устойчивость при хранении не менее 2-х лет Требования фармакологии Водорастворимость Контролируемость синтеза и деструкции Монодисперсное или узкое молекулярно-массовое распределение Наличие реакционноспособных функциональных групп для носителя Физико-химические требования Технологичность процесса получения Доступность исходного сырья Экономическая целесообразность Технологические требования ВИНИТИ, 1987 Некрасов А.В. «Вакцины нового поколения» - Ph. Eur. General Monograph 2002: 0153 Vaccines for Human Use - CPMP/BWP/6622/02

Copolymer N-oxide 1,4-ethylene piperazine and (N-carboxymethyl)-1,4-ethylene piperazinium bromide ММ – D NN СН СН 22 О N 2 2 CН СООН 2 Br + _ n m k Author prof. Nekrasov A.V. Russian, USA, EU patents

I -живая катионная полимеризация - уникальная система синтеза монодисперсных высокомолекулярных соединений заранее заданной молекулярной массы и структуры II - окисление третичного азота гетероцепного полиамина - решение ключевой проблемы синтеза водорастворимого нетоксичного препарата, способного к выведению из организма III - введение якорных функциональных групп - синтез универсального носителя вакцинных антигенов различной природы и лекарственных средств Основные стадии синтеза Полиоксидония -- N N-CH 2 -CH 2 -N N-CH 2 -CH 2 -- n [-N N-CH 2 -CH 2 -] m [-N N-CH 2 -CH 2 -] k n O n O CH 2 COOH Br + -

N О N О + - N СН 2 N ++ СОО - СН 2 СООН Br - о Водорастворимость Водорастворимость Резкое увеличение полярности (дипольный момент 5 А против 0,65 А Резкое увеличение полярности (дипольный момент 5 А против 0,65 А исходного полиамина) Способность к деструкции и выведению из организма Способность к деструкции и выведению из организма Резкое (в 10 раз) снижение токсичности (5 класс) Резкое (в 10 раз) снижение токсичности (5 класс) Биогенность Биогенность Универсальность в качестве носителя вакцинных антигенов Универсальность в качестве носителя вакцинных антигенов и лекарственных средств о

Полиоксидоний стимулирует иммунную систему, повышая устойчивость организма к местным и общим инфекциям. Помимо иммуномодулирующей активности Полиоксидоний также обладает свойствами детоксиканта, стабилизатора мембран и антиоксиданта. Водорастворимость Способность к деградации и выведению из организма Безопасность – LD 50 =1,5г / кг. Заряженные группы способны прочно связывать субстанции различной химической природы (белки, полисахариды) Полиоксидоний (и его формы) – высоко молекулярный биогенный аналог широко распространенных природных физиологически активных субстанций.

Условия хроматографирования : - 2 колонки - TSK 6000 PW, TSK 4000 PW; - подвижная фаза - буфер с 0,05М tris-HCl, 0.2M NaCl, pH 6,8; скорость 0,8 мл/мин.; - флуоресцентный детектор λex 256 нм, λem 360 нм. Лонгидаза: Mw = Гиалуронидаза: Mw =

Конъюгат ПО с ИФН-альфа 2 Mr = Да ИФН-альфа2b Mr = Да Условия анализа: колонка TSK G2000SW 300 x 7,5мм, детектор флуоресценции, ацетатный буфер рН=5,0. Содержание несвязанного интерферона в конъюгате 6,1% Время, сек

Через 30 дней инкубации при 37 о С : - ЛОНГИДАЗА сохраняет 71,4% своей активности Удельная активность, U/mg белка Время, дни ЛОНГИДАЗА ГИАЛУРОНИДАЗА

Гиалуронидаза Лонгидаза t, ч За 26 ч инкубации в сыворотке крови при 37 о С : ЛОНГИДАЗА сохраняет 68% своей активности, 85% - по сравнению с исходным ферментом; гиалуронидаза – 15 % Удельная активность, U/mg белка

- Образцы конъюгатов обладают высоким пролонгирующим эффектом - По сравнению с ИНФ (уже через сутки остается 4% активности), конъюгаты позволяют сохранять значимые количества ИНФ-α в сыворотках мышей вплоть до 5-7 суток. Группа 1ч1ч 1 день 3 дня 5 дней 7 дней ИНФ-α2b 2198±39 / 100% 93±18 / 4,2% 58±16 / 2,63% 13±10 / 0,6% 26±20 / 1% Конъюгат ±29 / 100% 1874±43 / 88% 1127±49 / 53% 700±113 / 33% 298±70 / 14% Конъюгат ±23 / 100% 1578±21 / 92% 861±113 / 50% 219±59 / 13% 112±16 / 7% Буфер 19±6 Кинетика ИНФ-α (пг/мл) в сыворотках мышей Через 1ч, 1 сут., 3, 5, 7 суток после введения ИНФ-α и двух экспериментальных серий конъюгатов

ЛОНГИДАЗА в 50 раз более устойчива к действию ингибитора по сравнению с нативным ферментом – Гиалуронидазой (Лидазой) Активность (в % от исходной)

Кинетика ИНФ-α (пг/мл) в сыворотках мышей Через 1, 3, 24, 48 и 72 ч после введения ИНФ, Конъюгата и коммерческого препарата - Пегасис Группа1 час3 часа24 часа48 часов72 часа INF-alpha 2423 ± ±14255±71214±14255±3 конъюгат 2067±241961±161723±231600±91422±18 Пегасис 1553±891450±971478±951371± ±29 Буфер 55±3 Пролонгированный эффект конъюгированного интерферона сохраняется на высоком уровне (69% от исходного) и через 72 ч, что заметно дольше, чем для просто интерферона (2 % через 72 ч) Конъюгат обладает сходной фармакокинетикой с препаратом Пегасис.

% от контроля (100%) ЛГ РАЗВИТИЕ ФИБРОЗА БЕЗ ЛЕЧЕНИЯ ОБРАТНОЕ РАЗВИТИЕ ФИБРОЗА Индексы маркеров патологической соединительной ткани снижаются после лечения Лонгидазой

ОЖОГОВЫЙ РУБЕЦ ПОСЛЕ 5 ИНЪЕКЦИЙ ЛОНГИДАЗЫ ПОСТТРАВМАТИЧЕСКИЙ РУБЕЦ ПОСЛЕ КУРСА УЛЬТРАФОНОФОРЕЗА (ДАВНОСТЬЮ 3 ГОДА) ПРЕПАРАТОМ ЛОНГИДАЗА

Для увеличения биодоступности антибактериальной терапии В ортопедии, хирургии, косметологии: - рубцы после ожогов, травм, операций - длительно незаживающие раны - контрактуры суставов, артриты, гематомы - спаечная болезнь В пульмонологии, урологии, гинекологии, офтальмологии: - пневмофиброз, сидероз, кавернозно-фиброзный, - инфильтративный туберкулез, туберкулема, альвеолит, - интерстициальный цистит, спайки в малом тазу и др.

Свойства носителя, который разработан и производится на современном предприятии по требованиям GMP позволили начать разработку целого семейства нанобиотехнологических препаратов пролонгированного действия Препараты пролонгированного действия показали ряд преимуществ по сравнению с препаратами нативных и рекомбинантных белков. ПРОДЕМОНСТРИРОВАНО, ЧТО БЕЗОПАСНАЯ КОРРЕКЦИЯ СЛОЖНЕЙШИХ АУТОРЕГУЛЯТОРНЫХ ПРОЦЕССОВ, ПРОИСХОДЯЩИХ В ОРГАНИЗМЕ, ВОЗМОЖНА, ЭФФЕКТИВНА и БОЛЕЕ БЕЗОПАСНА.

Новый завод Петровакс Соответствует передовым Международным требованиям GMP Полностью автоматизированные линии производства, розлива и контроля Внедрена система менеджмента качества ISO 9001/2000