Пространственная организация хромосом в ядре Ксения Куцын Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Южный федеральный университет» Ростов-на-Дону 2012

Содержание Возникновение и развитие понятия хромосомных территорий Экспериментальные доказательства существования хромосомных территорий Пространственное распределение хромосомных территорий Структура, форма и пластичность хромосомных территорий Динамика расположения хромосомных территорий во время постмитотической дифференциации клеток и в окончательно дифференцированных клетках Динамика и взаимодействие специфических локусов генов, расположенных на одной или на разных хромосомных территориях Модели ядерной архитектуры

Геном, записанный пока в одномерном варианте, на самом деле трех- или даже четырехмерен. Хромосомы - это объекты из реального мира, занимающие в ядре часть трехмерного пространства. Оптические срезы интерфазного ядра фибробласта человека. Красным выделена ДНК хромосомы 9; зеленым - ДНК её центромерного района. Проекции интерфазного ядра фибробласта человека. Линии показывают положения плоскостей оптических срезов: XY - синяя, XZ - зеленая, YZ - красная. Рубцов Н.Б., 2007

Возникновение и развитие понятия хромосомных территорий

Интерфазное ядро эпителиальной клетки саламандры (Salamandra maculata larvae) Вид сверхуВид сбоку В 1885 г. К. Рабл, обнаружив в клетках саламандр полярное расположение центромер и теломер в анафазе митоза вблизи поверхности ядер (конфигурация Рабла), предположил, что такой же порядок расположения этих участков хромосом сохраняется и в интерфазных ядрах. Rabl, 1885

Эмбрионы лошадиной аскариды на стадии двух бластомеров Эмбрион лошадиной аскариды на стадии четырех бластомеров Т. Бовери считал, что хромосомы, видимые в митозе, сохраняют свои индивидуальные особенности во время интерфазы и занимают разные части ядерного пространства Boveri, 1909

Различные взгляды на структурную организацию хромосомных территорий Модель хромосомных территорий, предложенная в 1905 году Эдвардом Страсбургером Strasburger 1905

В 1909 году Бовери предложил губкообразную модель строения хромосомных территорий. На рисунке изображены две хромосомные территории (ХТ), образованные пучками хроматина, ветвящимися и образующими сети.

Экспериментальные доказательства существования хромосомных территорий

В 1977 году Стефан Стэк, Дэвид Враун и Уильям Дэви показали, что во время интерфазы хромосомы остаются на разных территориях Stack et al Интерфазное ядро фиксированной клетки китайского хомячка, окрашенное по Гимза, показывающее скопления хроматина, отображающие отдельные хромосомные территории

Логическое обоснование опыта Кремера с локальным УФ облучением ядра диплоидной клетки китайского хомячка лазером на примере шерстяных ниток, собранных в «ядерном пространстве» Cremer et al. 1982

Реализация опыта Кремера Метафазная пластинка, полученная из ядер клеток, полученных в том же опыте, спустя 40 часов после облучения Cremer et al. 1982

Иммуноцитохимическая идентификация облученной ДНК в небольшой части метафазной пластинки Авторадиограмма ядра диплоидной клетки, подвергнутого микрооблучению Cremer et al Cremer et al. 1984

Прямые доказательства существования хромосомных территорий In situ гибридизация гибридной клеточной линии «китайский хомячок - X человек», несущей одну Х- хромосому человека с биотинилированной геномной ДНК человека на метафазном препарате(другие хромосомы окрашены по Гимза) Schardin, 1985

Современная гибридизация in situ Микрофотография метафазной пластинки. FISH с использованием специфических окрашивающих зондов (18 хромосома-красная, 19 хромосома- зеленая). Тотальная ДНК окрашена DAPI. Оптический срез ядра лимфобластоидной клетки человека, полученный с помощью конфокального микроскопа, после 3D FISH с теми же окрашивающими метками. Tanabe et al. 2002

Компьютерная обработка серии оптических срезов позволяет получить трехмерную реконструкцию ядра. Видно, что обе хромосомы 19 расположены вплотную друг к другу в центре ядра, тогда как хромосомы 18 - порознь и на периферии. Tanabe et al. 2002

Получение изображения хромосомных территорий ядра фибробласта человека Bolzer et al. 2005

Цветное изображение хромосомных территорий ядра фибробласта человека Гомологи находятся далеко друг от друга; хромосомы выстроены по периферии ядра. Bolzer et al. 2005

3D-реконструкция хромосомных территорий ядра фибробласта под разными углами Bolzer et al. 2005

Моделирование расположения хромосом в ядре фибробласта и их дальнейшая деконденсация с образованием хромосомных территорий Bolzer et al. 2005

Моделирование деконденсации хромосом с образованием хромосомных территорий Bolzer et al. 2005

Пространственное распределение хромосомных территорий

Расположение хромосомных территорий в ядерном пространстве неслучайное Радиальное расположение определяется либо с помощью расстояния между центром ядра и центром хромосомной территории, измеряемого в % от радиуса ядра, либо с помощью вокселей (элементов объемного изображения) Соседствующее расположение (паттерн сближенности) – свидетельствует о возможном функциональном соучастии исследуемых ядерных структур случайное Определяется по наличию пространственного расстояния, большего чем при неслучайном распределении

Определение расположения хромосомных территорий

Ранние данные о неслучайном радиальном распределении хромосомных территорий были получены в 3D FISH- опытах с ядрами лимфоцитов человека с использованием зондов для окрашивания хромосомы человека 19 с высокой плотностью генов и хромосомы человека 18 - бедной по содержанию генов хромосомы Радиальное расположение Tanabe et al. 2002

Соседствующее расположение (паттерн сближенности)

Богатые генами хромосомы располагаются в центре ядра, а бедные - на переферии Tanabe et al. 2002

Ядра, тотально окрашенные DAPI (голубой), с окрашенными хромосомными территориями 19 (зеленый) и 20 (красный) хромосом у эмбриона коровы (Bos taurus) на стадии бластоцисты 3D реконструкция тех же ядер в другой проекции Koehler et al. 2009

Частичная 3D реконструкция ядра лимфоцита человека после 3D FISH с двумя по-разному мечеными наборами BAC-клонов 12 хромосомы, несущими последовательности из нескольких богатых генами (зеленый) и нескольких бедных генами (красный) участков 3D реконструкция хромосомной территории 12 хромосомы после 3D FISH с теми же наборами BAC- клонов 3D реконструкция хромосомной территории 12 хромосомы после 3D FISH с двумя по-разному мечеными наборами BAC-клонов 12 хромосомы, содержащими последовательности активно экспрессирующихся генов (зеленый) и репрессированных генов (красный) Kupper et al. 2007

Структура, форма и пластичность хромосомных территорий

Kupper et al Хромосомные территории, визуализированные с помощью 3D FISH, выглядят как структуры с множеством форм, состоящих из хроматиновых доменов. Активно экспрессирующиеся и репрессированные участки хроматина равномерно распределены по всей хромосомной территории.

Выпетливание транскрипционно активных генов Недифференцированная клетка 4 день дифференцировки 10 день дифференцировки

Схема выпетливания генов Hoxb1 и Hoxb9 (черный) из хромосомной территории 11 хромосомы (серый) домовой мыши (Mus musculus) на разных стадиях дифференцировки эмбриональных стволовых клеток

Изображение хромосомных территорий инактивированной (Хi, тельце Барра) и активной (Ха) Х-хромосомы ядра фибробласта женщины (46,XX), показывающее различие в форме, структуре поверхности и интенсивности окрашивания двух гомологичных хромосомных территорий с разным распределением функций. Irina Solovei, Univ of Munich

Стабильность и изменения расположения хромосомных территорий в делящихся клетках 5 μm Материнская клетка Дочерние клетки 5 μm

Динамика расположения хромосомных территорий во время постмитотической дифференциации клеток и в окончательно дифференцированных клетках

Предпочтительные радиальные позиции индивидуальных хромосом могут различаться в клетках, дифференцированных по разным путям (на примере хромосом мыши в разных типах клеток)

Реорганизация хромосомных территорий во время окончательной дифференцировки (на примере палочковидных клеток сетчатки) Rattus norvegicus, коричневая крыса (ночной образ жизни) Sciurus carolinensis, серая белка (дневной образ жизни) Marmota monax, североамериканский лесной сурок (сумеречный образ жизни)

Динамика и взаимодействие специфических локусов генов, расположенных на одной или на разных хромосомных территориях

Фотографирование серии кадров одного и того же ядра живой клетки нейробластомы человека с одной и той же точки съемки через равные промежутки времени (20 мин) (цейтрафейная съемка). Отдельные воксели данной ХТ окрашены красным.

Перемещения доменов внутри хромосомных территорий являются хаотичными и весьма ограниченными. 5 μm

Концепция молчащей ядерной периферии и транскрипционно активной внутренней части ядра Выпетливание транскрипционно активных локусов во внутреннюю часть ядра Хромосомные территории

Визуализация локуса хроматина, привязанного к ламину А ядерной оболочки

Сложность регуляции генов на ядерной периферии

Целующиеся хромосомы Сайленсинг посредством групп репрессирующих белков Активация транскрипции генов

2n2n Образование хромосомных перестроек 4n 2 μm

Внутри хромосомных территорий позиции генов не являются случайными.

Модели ядерной архитектуры

Модель межхроматинового компартмента – interchromatin compartment (CT-IC) model - предполагает, что ядро состоит из двух основных компонентов: хромосомных территорий (CTs) и межхроматинового компартмента (IC). межхроматиновый компартмент Хромосомная территория Cremer, 2010

Модель компартментов межхроматиновых доменов постулирует размещение активных генов на поверхности хромосомных территорий

Модель, в которой ядерный матрикс представлен как система внутренних ядерных каналов Разин С.В. 1995

Список рекомендуемой литературы 1.Патрушев Л.И. Проблема размера генома эукариот. / Патрушев Л. И., Минкевич И. Г. // Усп. Биол. Хим. – – т. 47: 293 – Разин С. В. Хроматин: упакованный геном. / Разин С. В., Быстрицкий А. А. // монография. М. : БИНОМ. Лаборатория знаний. – – 176 с. 3.Рубцов Н. Б. Хромосома человека в четырех измерениях. / Рубцов Н.Б. // Природа. – Cremer T. Chromosome territories. / Cremer T., Cremer M. // Cold Spring Harb Perspect Biol. – Vol Razin S. V. The channels model of nuclear matrix structure. / Razin S. V., Gromova I. I. // Bioessays. – – Vol : 443 – 450.

Работа выполнена при финансовой поддержке Минобрнауки в рамках ФЦП "Научные и научно- педагогические кадры инновационной России", соглашение 14.А