БЛОЧНЫЙ ПРИНЦИП УСТРОЙСТВА ГЕНОВ ЭУКАРИОТ План 1.Альтернативный сплайсинг 2. Роль перестройки генов в дифференциров- ке клеток

1. Альтернативный сплайсинг В генах эукариот участки, несущие информацию о белках или их частях (экзоны), чередуются с некодирующими участ- ками (интронами). В процессе транскрипции с ДНК снимаются копии со всего гена, а участки, соответствующие интронам, вырезаются из преРНК (процессинг). Участки, соответствую- щие экзонам, – сшиваются (сплайсинг). Однако вырезание и соединение участков РНК может происходить неоднозначно, а несколькими (альтернативными) способами, причём вместе с интронами могут вырезаться и некоторые экзоны. Например, если ген содержит три экзона (обозначим их греческими буквами α, β, γ), то возможны следующие варианта сплайсинга: αβγ, αβ, αγ, βγ. Как самостоятельные гены могут функциони- ровать и отдельные экзоны. Таким образом, с одной и той же последовательности ДНК могут быть получены разные комбинации, соответ- ствующие нескольким белкам.

Хороший пример - ген, кодирующий в паращитовидной железе гормон кальцитонин, рeгулирующий содержание в организме кальция, а в мозговых клетках он обусловливает образование нейропептида CGRP (calcitonin gene related protein), функция которого неизвестна. Способность гена кальцитонина к диффе- ренцированной экспрессии заложена в его структуре. Он содержит 2 некодирующих и 4 кодирующих экзона, и 5 интронов (рис.1). Интроны способствуют альтер-нативному сплайсингу и образованию из мРНК-предшественника двух цитоплазматических мРНК, имею-щих общие 5'- и разные 3'- концы. Эти мРНК определяют синтез двух пептидов, из которых в результате процессинга формируются активные гормоны кальцитонин и нейропептид CGRР.

Рис 1. Альтернативный сплайсинг гена кальцитонина крысы: А ген кальцитонина; Б мРНК: слева – в щитовидной железе, справа - в клетках головного мозга; В белки-предшественники; Г гормоны; СР сайт связывания рибосом; ПА сайт полиаденилиро- вания; Cl, C2, СЗ, С4 кодирующие экзоны; И интроны

В семидесятых годах XX века было выдвинуто предположе- ние, что интроны играли важную роль в эволюции белков у дре- вних одноклеточных и даже доклеточных организмов. Новый белок получался за счет разных комбинаций уже существо- вавших кусочков – своеобразных строительных блоков, зако- дированных в экзонах. В пользу этой гипотезы говорит факт, что многие экзоны в ДНК соответствуют в белках их опреде- ленным участкам доменам. На заре появления первых кле- ток новые белки возникали, вероятно, в результате соединения и закрепления в таком положении нескольких «отрезков» ДНК. Эволюция самих геномов может происходить не только и не столько за счёт точковых мутаций но также путём удвоения и перераспределения уже имеющихся генных блоков - экзонов. В описанном примере удаление интронов из прерывных генов происходит путем сплайсинга на уровне мРНК-пред- шественника. Но известны случаи, когда сборка гена осущест- вляется на уровне ДНК. Это один из механизмов дифферен- цировки клеток.

2. Роль перестройки генов в дифференцировке клеток В организме каждого человека синтезируется до миллиона различных форм белков-иммуноглобулинов. Это разнообразие обеспечивает способность организма противостоять инфек- циям, распознавая практически любые чужеродные белки и клетки. Столь огромное разнообразие возникает за счет способ- ности генов, кодирующих иммуноглобулины, появляться в процессе созревания лимфоцитов из большого, но все же ограниченного числа небольших участков ДНК. Молекулы иммуноглобулинов состоят из двух легких (L) и двух тяжелых (Н) полипептидных цепей. В каждой из них различают две области (рис.2). Область (С) существует в не- большом числе вариантов (2 варианта у легкой цепи и около 10 - у тяжёлой), и у многих молекул она одинаковая. Поэтому она получила название константной.

Различные константные области тяжелой цепи (Сμ, Сγ, Сα и т.д.) определяют класс иммуноглобулинов (IgM, IgG, IgA и т.д.). С-область тяжелой цепи (С Н ) со- стоит из трёх (иногда четырёх) сходных по строению участков. В легкой цепи она представлена одним из таких участков. Вторая область (V) у каждой цепи уникальна, в связи с чем ее называют вариабельной. Именно взаимодействие V-областей тяжелой (V Н ) и легкой (V L ) цепей иммуноглобулинов обеспе- чивает специфичность данного антитела. Разнообразие же антител определяется тем, что одна и та же константная область соединяется с различными вариабельными областями. Рис. 2. Строение молекулы иммуноглобулина: А вариабельные части; Б место связывания антигена; В, Г тяже- лая и легкая цепи: S--S дисуль- фидная связь; F (ab ),F(c) фраг- менты, образующиеся при действии соответственно пепсина и папаина.

Иммуноглобулины продуцируются в крови В-лимфоцитами. Каждая клетка в соответствии с произошедшими в ней геном- ными перестройками синтезирует строго определенный вид иммуноглобулина. В клетках ранних эмбрионов гены легких цепей иммуноглобулинов разъединены на сегменты V, J и С, а гены тяжелых на сегменты V, D, J, Сμ, Сγ, Сα и т.д. Формирование вариабельной области генов легкой и тяжелой цепей происходит в процессе эмбрионального развития орга- низма на уровне ДНК путем объединения сегментов V, D и J. На этом этапе и определяется специфичность иммуногло- булинов, производящихся индивидуальными В-лимфоцитами. Различают два типа легких цепей - λ и κ. Каждой из них свой- ствен определенный набор V- и J-сегментов и специфичная константная область. У мыши, например, при образовании легкой κ-цепи происходит выбор между V-сегмен- тами и 4 J-сегментами. Сформировавшиеся VJ- и С-области транскрибируются совместно, а затем в мРНК в результате сплайсинга

Рис 3. Образование индивидуальной мРНК легкой (А) κ- и тяжелой (Б) γ- цепей иммуноглобулина мыши: а генные сегменты недифференциро- ванных, б - дифференцированных лимфоцитов; в - мРНК-предшествен- ник; г - мРНК; д - формирование в ДНК вариабельной части гена имму- ноглобулина на ранней стадии дифференцировки В-лимфоцитов; е участок ДНК В-лимфоцита после переключения синтеза иммуноглобу- линов IgM на синтез IgG

Транскрипция включается, по-видимому, за счет сближения промотора, располагающегося перед V-сегментом, и энхан- сера, который находится между J-сегментом и С-областью. Выбор определенных сегментов из классов V и J происходит случайным образом, но способ их объединения строго детерминирован. Это обусловливается специфичностью строения ДНК на 3'-концах V-сегментов и 5'-концах J- сегментов:...V-ЦАЦАГТГ (1112 произвольных нуклеотидов) АЦАААААЦЦ (3')… …5'ГГТТТТТГТ (21-24 произвольных нуклеотида) ЦАЦТГТГ-J... (Последовательности идеализированы, т.е. наиболее вероят- ны). Нетрудно заметить, что гепта- и наномеры, располагаю- щиеся на концах сегментов, попарно инвертированы (взаимно комплементарные последовательности подчёркнуты одинако- выми линиями). Поэтому в данных сайтах могут образовы- ваться шпильки.

У оснований шпилек происходит внутримолекулярная рекомбинация, приводящая к соединению какого-либо V- сегмента с одним из J-сегментов, что возможно и в меж-, а также внутрикодонных точках (ферменты, ведущие рекомбинацию, пока не известны). Такое воссоединение вызывает изменение аминокислотных последовательностей в конце вариабельной области белка. Рассмотрим теперь, как образуется тяжелая цепь иммуно- глобулина (у мышей). В хромосоме зародышевых клеток, на определенных расстояниях друг от друга, располагаются груп- пы генных сегментов V (40-80 сегментов), D (около 10) и J, а также различные С-области в заданном порядке (см. рис.3). В этом случае в процессе дифференцировки В-лимфоцитов про- исходят два типа внутригенных перестроек. Прежде всего образуются V Н -области путем объединения генных сегментов V, D, и J с помощью делетирования ДНК в строго заданных сайтах, чтобы не нарушить рамку считывания генетического кода.

В ряде случаев объединяются V-J или V-D-J-сегменты. (Меха- низм таких внутригенных перестроек тот же, что и у генов легких цепей иммуноглобулинов). На этом этапе дифферен- цировки В-лимфоцитов уже происходит синтез первого класса антител (IgM) путем образования пре-мРНК, ее процессинга и сплайсинга. На следующем этапе синтез переключается на образование иммуноглобулинов новых классов (последова- тельно IgG, IgA и т.д.) при сохранении их иммуноспеци- фичности. Это осуществляют сайты-переключатели (Sμ, Sγ, Sα и т.д.), располагающиеся между С Н -частями. Предполагается, что имеются белки (Рμ, Рγ и т.д.), которые "узнают" каждый свой сайт. Взаимодействуя друг с другом, они сближают эти сайты и производят в них специфическую рекомбинацию. В результате та же вариабельная область VDJ оказывается рядом с другой константной областью (например, Сγ) и, начинается синтез иммуноглобулина IgG с исходной специфичностью.

Как и в случае легкой κ-цепи, в гене тяжелой цепи между последним J-сегментом и сайтом Sμ располагается ткане- специфичный энхансер. Он и включает транскрипцию соответствующих генов (VDJCμ, VDJCγ, VDJCα и т.д.) в зависимости от этапа дифференцировки В-лимфоцитов. В описанном случае сближение промоторов с энхансером путем перестройки генов является причиной дифференциации клеток. Иногда оно может привести и к дедифференцировке клеток. Например, многие виды раковых заболеваний вызы- ваются экспрессией так называемых онкогенов после их транслокации в необычные места клеточных хромосом. Обна- ружено, что один из типов рака лимфоидных клеток человека явился следствием переноса гена С-mус из 8-й хромосомы в 14-ю. Этот ген внедрился в ген тяжелой цепи иммуно- глобулина между последним V Н сегментом и энхансером. Из-за соседства гена С-mус с энхансером происходит его транскрипция и, как результат, перерождение клеток.

Вопросы 1. Каким образом мозаичное строение генов эукариот обеспечивает их информационную «ёмкость»? 2. Почему один и тот же ген в разных тканях может определять синтез различных пептидов? 3. Чем обусловлено огромное разнообразие иммуноглобулинов в крови млекопитающих? 4. Каким образом онкогены могут вызвать неконтролируемое деление клеток?