РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИЙ И ВЫПУСК ОПЫТНЫХ ПАРТИЙ СИНТЕТИЧЕСКИХ И РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВО-ПЕПТИДНЫХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ КОРРЕКЦИИ ПАТОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ И ЛЕЧЕНИЯ СОЦИАЛЬНО ЗНАЧИМЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОНТРАКТ от 11 мая 2007 г. Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН И Б Х

Госконтракт от 11 мая 2007 г. Этап 4. 2 ЦЕЛЬ ПРОЕКТА Разработка технологий получения регуляторных белков с улучшенными свойствами и новых синтетических пептидов для внедрения в практику здравоохранения как оригинальных отечественных лекарственных средств или импортозамещающих рекомбинантных лекарственных препаратов пролонгированного действия.

Госконтракт от 11 мая 2007 г. Этап 4. 3 ЦЕЛЬ ЭТАПА Масштабирование процедур синтеза и очистки конъюгатов интерферона альфа, интерферона бета и Г-КСФ с полисиаловой кислотой и низкомолекулярными модификаторами. Проведение испытаний полученных конъюгатов. Проведение испытаний антидепрессантного пептида.

Госконтракт от 11 мая 2007 г. Этап 4. 4 Синтез конъюгатов Г-КСФ с низкомолекулярными модификаторами Cys17

Госконтракт от 11 мая 2007 г. Этап 4. 5 Ограничения технологии синтеза конъюгатов Г-КСФ с низкомолекулярными модификаторами Недостаточно высокий выход модифицированных дисахаридов (не более %). Низкий выход конъюгатов, дополнительно снижающийся при масштабировании. Нестабильность полученных конъюгатов в растворе, приводящая к олигомеризации и потере активности белка. ВЫВОД : дальнейшая технологическая разработка данного решения экономически НЕЦЕЛЕСООБРАЗНА.

Госконтракт от 11 мая 2007 г. Этап 4. 6 ИННОВАЦИОННАЯ ТЕХНОЛОГИЯ ПРОЕКТА НЕКОВАЛЕНТНОЕ ПОЛИСИАЛИРОВАНИЕ – НЕКОВАЛЕНТНОЕ ПОЛИСИАЛИРОВАНИЕ – новый подход к решению проблем генно-инженерных технологий и внедрения отечественных рекомбинантных препаратов на фармацевтический рынок. Спиральные участки молекулы полисиаловой кислоты могут взаимодействовать с белкаи АСМ высокого разрешения нанокомплексов

Госконтракт от 11 мая 2007 г. Этап 4. 7 ПРЕИМУЩЕСТВА НЕКОВАЛЕНТНОГО ПОЛИСИАЛИРОВАНИЯ Использование только природных полимеров Отсутствие нарушений первичной структуры белка Минимальные обратимые изменения вторичной структуры белка при сохранении его третичной структуры Сохранение специфической биологической активности белка Увеличение стабильности растворов субстанции Увеличение продолжительности действия полисиалированных белков Высокий выход продукта нековалентного полисиалирования Простота технологии получения нанокомплексов

Госконтракт от 11 мая 2007 г. Этап 4. 8 Технология получения полисиалированных белков Стерильная фильтрация 7 Ферментация (тельца включения) 1 Восстановление дисульфидных связей 2 Реокисление Ренатурация 3 Хроматографическая очистка белка 4 Активация полисиаловой кислоты 5 Синтез комплекса 6 Характеристика препарата

Госконтракт от 11 мая 2007 г. Этап 4. 9 Характеристика белковых препаратов Полиакриламидный гель, неденатурирующие условия, без концентрирующего геля, рН 8.8, 8%Т. 1 – нативный интерферон β, 2 – комплекс с полисиаловой кислотой 22 кДа, 3 – нативный гранулоцитарный колонестимулирующий фактор, 4 – комплекс с полисиаловой кислотой 22 кДа, 5 - карбангидраза, 6 – α-лактоглобулин, 7 – БСА. Изменение электрофоретической подвижности Суперпозиция хроматограмм немодифицированного интерферона альфа 1б (1) и его комплекса с полисиаловой кислотой 22 кДа (2). IFN – белок, PSA – полисиаловая кислота. Отсутствие ковалентной модификации

Госконтракт от 11 мая 2007 г. Этап При нековалентном полисиалировании вторичная структура белка изменяется незначительно Спектр кругового дихроизма полисиалированного Г-КСФ в сравнении с нативным белком

Госконтракт от 11 мая 2007 г. Этап Пептидное картирование – подтверждение нативности первичной структуры белка Профиль пептидов после гидролиза рИФН α2b (inf a2b) и его комплекса с полисиаловой кислотой (PSA-inf) трипсином. ВЭЖХ на обращённой фазе. PSA-IFNa IFNa

Госконтракт от 11 мая 2007 г. Этап Стабильность полисиалированных белков при лиофилизации 1, 2 – стандарты Г-КСФ, 3, 5 – комплексы ПСК-Г-КСФ до лиофилизации, 4, 6 – комплексы ПСК-Г-КСФ после лиофилизации, 7 – комплекс ПСК- рИФНα2b до лиофилизации, 8, 10 стандарты рИФНα2b, 9 – комплекс ПСК- рИФНα2b после лиофилизации, 11 – α-лактоглобулин, 12 – карбангидраза, 13 – БСА Электрофоретическое разделение в неденатурирующих условиях без концентрирующего геля, общая концентрация акриламида 7%, рН 8,8. Окрашивание EZBlue. Раствор субстанцииЛиофилизацияРастворение в воде Г-КСФ ИФНα2b

Госконтракт от 11 мая 2007 г. Этап Наработка опытных партий белковых препаратов Полисиалиро- ванный белок Количество, г Чистота, %Биологическая активность (активность стандарта) EC 50, нг/мл Интерферон альфа 2б ±1.5 (11±1.5 ) антипролиферативная Г -КСФ ±1.5 (14±1.5 ) пролиферативная Интерферон бета 1б ±3 (20±3) антипролиферативная

Госконтракт от 11 мая 2007 г. Этап Биологическая активность белковых препаратов in vivo Препараты полисиалированных белков Степень пролонгации биологического эффекта Интерферон альфа 2б 34.4 Г -КСФ 2.8 Интерферон бета 1б 4.5

Госконтракт от 11 мая 2007 г. Этап Испытания эффективности и безопасности пептидного препарата ИБХ-05OH Наименование испытанийРезультаты Изучение специфической активности препарата Антистрессорное и антидепрессивное действие (доза 10 – 100 мкг/кг) Изучение острой токсичности и переносимости при однократном введении и токсичности при многократном применении Низкотоксичен (LD 50 > 1440 мг/кг). Не вызывает никаких клинических и функциональных нарушений при длительном применении. Изучение влияния на репродуктивную функцию и развитие потомства и мутагенной активности Не обладает эмбриотоксическим и тератогенным действием, не имеет мутагенной активности Изучение влияния на иммунную систему и аллергенной опасности препарата Не проявляет аллергенных свойств, обладает слабо выраженной иммуномодулирующей активностью. Изучение общих фармакологических и фармакокинетических свойств препарата Основное количество радиоактивности (около 90%) выводилось в течение 24 час после введения меченого пептида.

Госконтракт от 11 мая 2007 г. Этап Результаты 4 этапа 1. Разработаны опытно-промышленные регламенты получения рИФНα-2b и рГ- КСФ. 2. Разработан лабораторный регламент получения полисиалированного рИФНβ-1b 3. Проведена наработка опытных партий полисиалированных белков в количестве 9.8 – 10.2 г субстанции каждого препарата. 4. Проведен анализ качества белковых препаратов. 5. Проведены испытания полученных полисиалированных белков в системах in vivo и показано, что время полужизни таких препаратов существенно больше времени полужизни немодифицированных белков. 6. Проведено тестирование эффективности и безопасности полученных препаратов. 7. Наработана опытная партия синтетического пептида ИБХ-05ОН в количестве 50г. 8. Проведены испытания антидепрессивных и противотревожных свойств пептидного препарата ИБХ-05ОН, а также его эффективности и безопасности. Показано, пептид ИБХ-05ОН является препаратом средней токсичности, относится к классу психотропных веществ, с выраженным действием на ЦНС, обладающих анксиолитическим, психоседативным, и противотревожным действием. 9. Разработан проект Фармакопейной статьи предприятия на препарат ИБХ-05ОН.

Госконтракт от 11 мая 2007 г. Этап Медицинское применение белковых препаратов Активная субстанция Показания к применению Цена упаковки (дозы), руб Перспективы применения Интерферон альфа 2б Вирусные, онкологические заболевания, нарушение функций иммунной системы 6500Выявлено более 100 направлений клинического использования препарата. Перспективны комбинации с другими препаратами. Г -КСФ Нейтропении, онкологические больные после химиотерапии 9000Годовая потребность в препарате рГ-КСФ в России (РОНЦ РАМН) составляет кг субстанции препарата и тыс. флаконов готовой лекарственной формы. Интерферон бета 1б Вирусные инфекции (гепатит С, везикулярный стоматит), рассеянный склероз 40000Потребность в современном препарате для лечения рассеянного склероза оценивается миллионами доз, (1- 5 кг субстанции)

Госконтракт от 11 мая 2007 г. Этап Перспективы пептидных препаратов ИБХ-07ME – противоалкогольный препарат В случае успешного завершения клинических испытаний и начала промышленного выпуска препарата ИБХ-07ОМЕ планируется в первый год 1- 1,5% проникновения препарата на рынок России, что составит не менее 1 млн. долларов поступлений от реализации препарата. ИБХ-05OH – антидепрессантный препарат После завершения клинических испытаний препарат планируется применять при следующих заболеваниях: - пограничные состояния с симптомами страха и тревоги, - острые тревожные состояния, - эмоциональное напряжение и беспокойство, - профилактика стрессовых состояний в клинической практике, в военной медицине и медицине катастроф. При организации современного производства пептидных препаратов рентабельность может составлять до 50% при производстве субстанций, а общая рентабельность производства может составлять до 40%.

Госконтракт от 11 мая 2007 г. Этап Результаты работы. Патенты. мг/мл Название патентаАвторыРегистрационн ый номер Способ очистки рекомбинантного интерферона бета-1b Воробьев И.И. Пономаренко Н.А. Мирошников А.И. Смирнов И.В Комплекс биологически активного рекомбинантного белка с полисиаловой кислотой Безуглов В.В. Грецкая Н.М. Бобров М.Ю. Акимов М.Г. Баирамашвили Д.И. Шибанова Е.Д. Клинов Д.В. Мирошников А.И

Госконтракт от 11 мая 2007 г. Этап Результаты работы. Регламенты. НаименованиеКоличество Лабораторные регламенты получения рекомбинантных белков: интерферона альфа 2б, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, интерферона бета 1б 3 Опытно-промышленные регламенты получения рекомбинантных белков: интерферона альфа 2б, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора 2 Лабораторные регламенты получения субстанций полисиалированных рекомбинантных белков: интерферона альфа 2б, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, интерферона бета 1б 3 Лабораторные регламенты получения субстанций пептидных препаратов ИБХ-05OH, ИБХ-07ME 2

Госконтракт от 11 мая 2007 г. Этап Достижение заданных значений программных индикаторов ПараметрЗначение Количество разработанных новых технологий 2 Количество молодых специалистов28 Количество защищённых диссертаций2 Количество публикаций5