Александр Тышковский, факультет биоинженерии и биоинформатики МГУ, 2011

Генетическая инженерия – использование основ и методов молекулярной биологии и молекулярной генетики для конструирования организмов с заданными наследственными свойствами.

Что же именно в геноме нас интересует? Геном – совокупность всей ДНК клетки. В случае генной инженерии это, прежде всего, гены. А что такое ген? Ген – определенный участок ДНК, кодирующий один или несколько продуктов: ДНК и/или РНК

Организм Esherichia coli Saccharomyces cerevisiae Arabidopsis thaliana Drosophila melanogaster Homo sapiens Размер генома (н.п.) 4,6 x ,2 x ,2 x x ,3 x 10 9 Количество генов Чемпион по размеру генома – тритон (3 x н.п.). Чем больше геном, тем сложнее организм? Одинакова ли ДНК во всех клетках нашего организма? Нет! Ведь есть спонтанные мутации и транспозоны.

При этом в средней клетке нашего организма хромосомная ДНК составляет 1% от всей ДНК. То есть во всей ДНК клетки хромосомных генов всего 0,015%. Поэтому без биоинформатических методов сейчас не обойтись.

Чем больше генов, тем сложнее организм? У арабидопсиса примерно генов, у человека – Значит, арабидопсис сложнее человека? Нет! Ведь есть альтернативный сплайсинг (в 94% генов человека)!

ДНК и РНК – носители генетической информации; Центральная догма молекулярной биологии: ДНК – РНК – белок; Свойства генетического кода; Открытие плазмид; Открытие рестриктаз; И многое другое.

1.Получение фрагмента ДНК; 2.Конструирование in vitro рекомбинантных молекул; 3.Введение рекомбинантных молекул в клетки; 4.Отбор клонов, несущих рекомбинантную молекулу.

Химико-ферментативный синтез ДНК; Рестрикционные фрагменты; ПЦР; Синтез комплементарной ДНК (кДНК) из мРНК.

Система модификации-рестрикции – примитивный аналог имунной системы в бактериях. ДНК бактерии метилирована, поэтому не режется рестриктазами ДНК бактериофага не метилирована, поэтому разрезается рестриктазами Рестриктазы = Эндонуклеазы рестрикции

В основном, узнают палиндромные последовательности:

Липкие концы на 5-конце (фосфатный): На 3-конце (гидроксильный): Тупые: 5 G A A T T C 3 3 C T T A A G 5 EcoRI SphI SmaI 5 G C A T G C 3 3 C G T A C G 5 5 C C C G G G 3 3 G G G C C C 5

1.Термическая денатурация двухцепочечной ДНК 2. Отжиг (гибридизация) праймеров 3. Синтез ДНК (удлинение цепи) по матрице одноцепочечной исходной ДНК Необходимы 2 праймера, фланкирующие нужный участок ДНК. Вспоминаем репликацию ДНК!

Каждая цепь, синтезированная в ходе цикла, является матрицей для синтеза ДНК в следующем цикле. Таким образом, число продукта удваивается в каждом цикле! ПЦР легко позволяет вводить в нужный фрагмент ДНК мутацию (для этого всего лишь нужно ввести мутацию в праймер).

По матрице мРНК синтезируем ДНК. Что нам для этого нужно? Вспоминаем, как это делают ретровирусы или ретротранспозоны. Используем ревертазу (обратную транскриптазу) для синтеза ДНК по матрице мРНК (в качестве праймера – олиго(dT)). Потом – обычную ДНК-полимеразу. Можно ли использовать праймер к ДНК?

Что такое вектор? Вектор (векторная молекула) – молекула ДНК, способная переносить чужеродную ДНК и обеспечивать ее поддержание в реципиентных клетках. Рекомбинатная молекула – вектор, в который что- нибудь встроилось. Какие векторы есть в природе? 1.Вирусы; 2.Плазмиды.

Плазмида – кольцевая молекула ДНК бактерий, способная к автономной репликации и имеющая собственный ориджин репликации. Плазмиды обеспечивают один из основых способов переноса генетического материала у бактерий (горизонтального переноса генов) – конъюгацию. Часто плазмиды содержат гены устойчивости к антибиотикам.

На помощью опять приходят рестриктазы! Разрежем фрагмент ДНК и вектор по одним и тем же сайтам рестрикции, после чего сошьем ДНК-лигазой. Чтобы вектор не замкнулся сам на себе и чтобы фрагмент ДНК встроился только в одну сторону, используют 2 разных сайта рестрикции. Какие концы лучше – липкие или тупые? Липкие! ДНК-лигазе будет куда проще их сшить (комплементарные пары концов свяжут цепи правильным образом).

Вектор должен: Автономно реплицироваться в клетках реципиента; Не утрачивать способность к автономной репликации после вставки фрагмента ДНК; Иметь уникальный сайт клонирования (вставки фрагмента ДНК); Иметь селективный маркер (желательно внутри сайта клонирования).

1.Трансформация; 2.Электропорация; 3.Микроинъекции; 4.Инфицирование (вирусы и фаги); 5.Бомбардировка микрочастицами с адсорбированной ДНК.

Здесь нам понадобится селективный маркер! Лучше всего, когда их 2: один внутри сайта рестрикции вектора, другой – снаружи.

Ген вводят в один из пронуклеосов. Интеграция трансгена происходит случайно и может привести к нарушению экспрессии генов и быть летальной. Трансген интегрирует только в одну хромосому, поэтому трансгенное животное является гемизиготным.

1.Устойчивость к вредителям (ген эндотоксина, безопасный для человека, но опасный для насекомых) – вместо пестицидов!

2. Улучшение качества пищевых продуктов (многие растения не содержат некоторых незаменимых аминокислот (особенно лизина) и витаминов; некоторые вещества у нас не усваиваются (например, растительное железо ни в каком виде у человека не усваивается)). Получен рис, обладающий всеми этими качествами.

3. Животные как фармацевтические фабрики (биореакторы) на примере получения активатора плазминогена.

4. GFP (green fluorescent protein) – позволяет следить за судьбой белка: - в клетке - в организме - и… выйти за предел разрешения светового микроскопа!

5. Молекулярно-биологические методы (изучение взаимодействия белков, нуклеиновых кислот, регуляции, выделение и очистка белков и т.д.). 6. Лекарства против вирусов (например, против СПИДа!) на основе активации апоптоза вирусными протеазами.

7. Генная терапия (герминальная, соматическая).

8. Для красоты

9. И многое-многое другое!

И добро пожаловать на факультет биоинженерии и биоинформатики МГУ!