ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИЕ МОДИФИКАЦИИ ГЕНОМА ПРИ ПАТОЛОГИИ ЭМБРИОНАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ ЧЕЛОВЕКА к.б.н. И.Н. Лебедев Параметры генетического здоровья работников Сибирского химического комбината, жителей г. Северска и Томской области к.б.н. И.Н. Лебедев, зав. лабораторией цитогенетики ГУ НИИ медицинской генетики ТНЦ СО РАМН, г. Томск

Биологические последствия влияния ионизирующего излучения на человека Соматические поражение соматических клеток Ранние(Острые) Отдаленные Генетические поражение половых клеток Ранние(Острые)Отдаленные Лучевая болезнь Местные лучевые поражения Лучевой канцерогенез Лучевое старение Гибель потомства, ВПР Нарушение фертильности КанцерогенезКанцерогенез Физиологическая неполноценность потомства

Исследования ГУ НИИ медицинской генетики ТНЦ СО РАМН по проблемам генетического здоровья работников Сибирского химического комбината и населения прилегающих территорий Назаренко С.А., Попова Н.А., Назаренко Л.П., Пузырёв В.П. Ядерно-химическое производство и генетическое здоровье // Томск: Печатная мануфактура, – 272 с. 1) гг. «Сравнительный анализ параметров генетического здоровья жителей г. Северска и прилегающих территорий Томской области». 2) гг. «Генетическое здоровье работников СХК, профессионально контактирующих с плутонием-239, и членов их семей». 3) гг. «Комплексный анализ структурно-функциональных изменений генома при комбинированном воздействии факторов радиационной и химической природы у работников СХК».

Уровни исследований генетических эффектов ионизирующего облучения 1. Популяционный. Исследование частоты врожденных пороков развития и груза наследственной патологии. 2. Молекулярный. Оценка частоты мутаций повторяющихся последовательностей ДНК, возникающих в половых клетках. 3. Клеточный. Цитогенетический анализ числовых и структурных хромосомных нарушений.

Три способа регистрации ВПР: 1. Регистрация у новорожденных 9 «легко» диагностируемых форм ВПР – анэнцефалия, спинномозговая грыжа, расщелины губы и неба, полидактилия, редукционные пороки конечностей, атрезия пищевода, атрезия ануса, синдром Дауна и множественные врожденные пороки развития (МВПР). 2. Стандартизованная система регистрации у детей в возрасте до 1 года 19 форм ВПР по правилам Европейского международного регистра EUROCAT. 3. Выявление у детей в возрасте до 1 года всех форм ВПР. За период с 1972 по 1998 гг. в г. Северске было проанализировано истории родов и развития новорожденных, а также протоколов анатомических вскрытий. Популяционный уровень: Анализ частоты врожденных пороков развития

Частоты 9 «легко» диагностируемых форм ВПР у новорожденных детей в городских популяциях бывшего СССР Примечание : 1 – Назаренко С.А. с соавт., 2004; 2 - Назаренко Л.П., 1998; 3 - Иванов с соавт., 1997; 4 - Лурье, 1984; 5 - Каюпова, Куандыков, 1990.

Динамика частот 9 «легко» диагностируемых форм ВПР (1:1000) у новорожденных г. Северска за три периода наблюдений

Средняя частота 19 форм ВПР (1:1000) у детей в возрасте до 1 года в России и по данным европейского регистра EUROCAT 1) Синдром Дауна 2) МВПР 3) Анэнцефалия 4) Спинномозговая грыжа 5) Расщелина губы 6) Расщелина неба 7) Полидактилия 8) Редукционные пороки конечностей 9) Атрезия ануса 10) Атрезия пищевода 11) Энцефалоцеле 12) Гидроцефалия 13) Микротия 14) Врожденные пороки сердца 15) Гипоспадия 16) Диафрагмальные грыжи 17) Агенезия и дисгенезия почек 18) Грыжа пупочного канатика 19) Гастрошизис

Частота всех форм ВПР у новорожденных в г. Северска, Томска в сравнении с некоторыми городскими популяциями России (1:1000 новорожденных)

Динамикаотдельных форм и общей частоты ВПР Динамика отдельных форм и общей частоты ВПР у новорожденных г. Северска с 1972 по 1998 гг. 1. Частота 9 форм ВПР, в этиологии которых наибольший удельный вес занимает мутационная компонента, в течение удельный вес занимает мутационная компонента, в течение 27-летнего периода наблюдения, т.е. на протяжении жизни одного 27-летнего периода наблюдения, т.е. на протяжении жизни одного поколения, не изменилась. поколения, не изменилась. 2. При регистрации 19 форм ВПР в г. Северске до 1993 г. и после обнаружено достоверное повышение их суммарной частоты с 11,96 до 18,65 (p

Вывод: Уровень генетического груза в популяциях г. Северска и Томска сопоставим с другими популяциями России, проживающими на не загрязненных радионуклидами территориях. Популяционный уровень: Оценка груза наследственной патологии За период обследования в г. Северске было выявлено 114 семей со 138 больными с моногенными наследственными заболеваниями

Молекулярный уровень: Анализ частоты гаметических мутаций повторяющихся последовательностей ДНК Гаметические мутации повторяющихся последовательностей ДНК а) D11S1304 (материнского происхождения), б) D11S1983 (отцовского происхождения), М – маркер молекулярного веса. М а М б

Частота гаметических мутаций повторяющихся последовательностей ДНК в семьях работников СХК с внешним гамма-облучением 60 семей работников СХК, получивших на момент рождения ребенка интеграль- ную дозу внешнего гамма- облучения от 1,5 до 137 бэр. Контрольная выборка из 31 семьи, проживающей в поселке Каргала.60 семей работников СХК, получивших на момент рождения ребенка интеграль- ную дозу внешнего гамма- облучения от 1,5 до 137 бэр. Контрольная выборка из 31 семьи, проживающей в поселке Каргала. В семьях работников СХК средняя частота мутаций составила 0,035 на локус на гамету на поколение, а в контрольных - 0,025.В семьях работников СХК средняя частота мутаций составила 0,035 на локус на гамету на поколение, а в контрольных - 0,025. Достоверных различий между группами не обнаружено. Достоверных различий между группами не обнаружено.

Мутации отцовского и материнского происхождения Генети- ческий локус Частота мутаций на гамету на поколение Семьи работников СХКЖители пос. Каргала ОтцыМатери Отцы/ матери ОтцыМатериОтцы/ матери В6.7 0,08308/000,0320/3 CEB1 0,1330,0168,30,129012/0 MS1 0,0660,0501,320,0640,0322 Всего 0,0560,0134,30,0380,0123,2 Полученные результаты свидетельствуют о справедливости гипотезы репликационного происхождения значительной части мутаций минисателлитных локусов генома.

Частота гаметических мутаций повторяющихся последовательностей ДНК в семьях работников СХК с инкорпорированным плутонием ЛокусСХК (35 полных семей и 55 потомков, всего 126 человек, 1,5-257 нКи) Контроль (49 полных семей и 64 ребенка, всего 162 человека, пос. Каргала) P Число гамет МутацииЧисло гамет Мутации число частотачислочастота D2S , ,0080,347 D2S , ,0160,667 ACTBP210010, ,0170,174 D9S , ,0080,470 D21S ,0160, , ,0120,783

РазрывывДНК Разрывы в ДНК Повреждение веретена клеточного деления Структурные хромосомные аберрации Числовые хромосомные нарушения: анеуплоидия, полиплоидия Клеточный уровень: Исследование частоты и спектра хромосомных нарушений

Структура и объем исследованного цитогенетического материала в отношении эффектов γ-облучения * - Реконструированная доза по спектрометрии эмали зубов (Федосеев, Смиренная, 1996); Материалсобранв период гг. Материал собран в период гг. Обследованная группа Число обследованных лиц Возраст (лет) Интегральная доза внешнего -облучения (бэр) Число изученных метафаз СХК СХК СЕВЕРСК САМУСЬ *4527 TOMСК КАРГАЛА Всего:

Процент аберрантных метафаз у работников СХК с внешним -облучением, жителей г. Северска и прилегающих территорий Томской области * * * * - p < 0,05 - по сравнению с контролем (критерий Манна-Уитни) %

Двухударные хромосомные аберрации - дицентрические и кольцевые хромосомы (маркеры радиационного воздействия)

* * - p < 0,05 Частота дицентрических и кольцевых хромосом (маркеров радиационного воздействия) у работников СХК, жителей г.Северска и прилегающих территорий Томской области Спонтанная частота %

Структурныехромосомныенарушения у жителей г. Северска Структурные хромосомные нарушения у жителей г. Северска АБ ВГ А - одиночныйразрыв А - одиночный разрыв Б - парныйразрыв Б - парный разрыв В, Г - хроматидные обмены (маркеры химического мутагенеза)

* * * - p < 0,05 Частота хроматидных обменов (маркеров химического мутагенеза) у работников СХК, жителей г.Северска и прилегающих территорий Томской области * Вывод : Общая частота хромосомных аберраций у работников СХК и жителей г.Северска повышена за счет аберраций хроматидного типа – маркеров химического мутагенеза.

Среднее число СХО на клетку у работников СХК, жителей г. Северска и прилегающих территорий * - р

Мультиаберрантные клетки

Спонтанная частота мультиаберрантных клеток составляет 0,01 на 100 клеток, т.е. 1: метафаз (Neel et al., 1992; Bochkov, Katosova, 1994). Частота мультиаберрантных клеток у работников СХК, жителей г. Северска и прилегающих территорий Томской области * ** * * - p < 0,05 * ** - p < 0,01

Межиндивидуальнаявариабельностьработников Межиндивидуальная вариабельность работников СХК по частоте хромосомных нарушений 1. У работников СХК, подвергающихся в процессе производственной деятельности облучению сходными дозами ионизирующей радиации, обнаружена высокая межиндивидуальная вариабельность частоты хромосомных аберраций. 2. К категории лиц высокого генетического риска (частота хромосомных нарушений в 4 и более раз превышает спонтанный уровень) отнесено около 25% обследованных индивидов. 3. К категории лиц сверхвысокого генетического риска (превышение частоты спонтанного уровня в 10 и более раз) отнесено 8,5% работников. Вывод: Необходим постоянный цитогенетический мониторинг за состоянием хромосомного аппарата работников ядерно-химического производства с целью своевременного выявления групп повышенного генетического риска и дальнейшей профилактики заболеваний, особенно онкологической патологии.

Структура и объем исследованного цитогенетического материала у работников СХК, имеющих внутреннее облучение плутонием-239 Обследованная группа Число обследованных лиц Стаж работы (лет) Активность инкорпорирован ного плутония (нКи) Число изученных метафаз P , P P Контроль (пос. Каргала) Всего Обследование проведено в гг.

в) Хроматидный обменг) Мультиаберрантная клетка DMs ПФ Д DMs б) Дицентрическая хромосома с парным фрагментом Хромосомные аберрации в клетках работников СХК с инкорпорированным плутонием-239 а) Дицентрическая хромосома

Двойные минихромосомы (double minutes) в клетках крови у работников СХК с инкорпорированным плутонием-239 Маркер начального этапа малигнизации? Двойные минихромосомы являются амплифицированными онкогенами. Обычно выявляются только в опухолевых клетках.

Частота мультиаберрантных клеток у индивидов с различным содержанием плутония-239 в организме Обследованная группа Число индивидов с МАК Число метафаз с МАК Число МАК на 100 клеток (M ± m) Контроль0 / 360 / P1 (1,5-11 нКи)0 / 140 / P2 (13-20 нКи)2 / 226 / 57780,09 ± 0,08 * P3 ( нКи)6 / 247 / 65600,10 ± 0,04 * * - p < 0,01

Структура и частота хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови у работников плутониевого производства и в контрольной группе (данные гг.) ГруппаКонтроль (пос. Каргала) P1 (1,5-11 нКи) P2 (13-20 нКи) P3 ( нКи) Число обследованных лиц Число исследованных метафаз Процент аберрантных метафаз 1,34 ± 0,17 1,61 ± 0,36 2,42 ± 0,52** 2,66 ± 0,30* Аберрации хромосомного типа 0,61 ± 0,10 1,04 ± 0,34 1,61 ± 0,58 2,01 ± 0,30* Парные фрагменты 0,49 ± 0,09 0,59 ± 0,28 1,06 ± 0,31 1,09 ± 0,17* Аберрации двухударного типа 0,12 ± 0,04 0,23 ± 0,10 0,41 ± 0,21 0,61 ± 0,05* Аберрации хроматидного типа 0,86 ± 0,15 0,79 ± 0,22 0,96 ± 0,21 1,18 ± 0,27 Одиночные фрагменты 0,76 ± 0,15 0,77 ± 0,21 0,84 ± 0,18 1,04 ± 0,26 Хроматидные обмены 0,08 ± 0,03 0,02 ± 0,02 0,12 ± 0,05 0,10 ± 0,03 Мультиаберрантные клетки00 0,09 ± 0,08* 0,10 ± 0,04* * - p < 0,01; ** - p < 0,05

Группа Контроль (г. Северск) Работники СХК ( нКи) Число обследованных лиц 2052 Число исследованных метафаз Процент аберрантных метафаз 1,0±0,41,6±1,2* Аберрации хромосомного типа 0,3±0,41,6±1,7** Парные фрагменты 0,4±0,40,9±1,2 Кольцевые хромосомы 0,10±0,020,13±0,27 Дицентрические хромосомы 0,1±0,10,15±0,31 Аберрации хроматидного типа 0,5±0,40,3±0,4 Одиночные фрагменты 0,5±0,50,4±0,4 Хроматидные обмены 0,05±0,10,09±0,2 Мультиаберрантные клетки 0,03±0,10,07±0,2 * p = 0,02; ** p = 0,002 Структура и частота хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови у работников плутониевого производства и в контрольной группе (данные гг.)

Механизмы действияионизирующей радиации на генетический аппарат клетки Механизмы действия ионизирующей радиации на генетический аппарат клетки По Mateuca R. et al., 2006

Анеуплоидия состояние, при котором число хромосом в клетке не кратно нормальному основному (гаплоидному) набору.

Анеуплоидия у человека: Ранняя гибель эмбрионов и невынашивание беременности.Ранняя гибель эмбрионов и невынашивание беременности. Множественные врожденные пороки развития.Множественные врожденные пороки развития. Наследственные синдромы, сопровождающиеся умственной и физической отсталостью.Наследственные синдромы, сопровождающиеся умственной и физической отсталостью. Онкопатология.Онкопатология. Ранняя гибель эмбрионов и невынашивание беременности.Ранняя гибель эмбрионов и невынашивание беременности. Множественные врожденные пороки развития.Множественные врожденные пороки развития. Наследственные синдромы, сопровождающиеся умственной и физической отсталостью.Наследственные синдромы, сопровождающиеся умственной и физической отсталостью. Онкопатология.Онкопатология.

Теодор Бовери ( ) немецкий цитолог и эмбриолог Больше века назад предположил, что рак вызывается анеуплоидией, так как она «формирует патологический фенотип у морских ежей». Петер Дьюсберг, профессор молекулярной и клеточной биологии Калифорнийского университета, Беркли. Дал «анеуплоидной» гипотезе Бовери новое направление в объяснении этиологии и прогрессии рака.

Мутагенная индукция анеуплоидии Агенты, которые индуцируют анеуплоидию при воздействии in vitro и/или in vivo, известны как анеугены или анеуплоидогены; Анеуплоидия не индуцируется каким-либо одним общим механизмом, а возникает в результате ошибок сегрегации хроматид при делении клетки; При облучении может происходить радиационный лизис белков, содержащих SH- и S-S-группы, что ведет к фрагментации пептидных цепей. Агенты, которые индуцируют анеуплоидию при воздействии in vitro и/или in vivo, известны как анеугены или анеуплоидогены; Анеуплоидия не индуцируется каким-либо одним общим механизмом, а возникает в результате ошибок сегрегации хроматид при делении клетки; При облучении может происходить радиационный лизис белков, содержащих SH- и S-S-группы, что ведет к фрагментации пептидных цепей.

ГиперплоидияГиперплоидия -избыток одной или нескольких хромосом набора хромосом набора -избыток одной или нескольких хромосом набора хромосом набора ГипоплоидияГипоплоидия -недостаток одной или нескольких хромосом набора хромосом набора -недостаток одной или нескольких хромосом набора хромосом набора возникает как в результате нерасхождения, так и отставания хромосом или хроматид в ходе клеточного деления возникает в результате нерасхождения хромосом при делении клетки

Схема хромосомного нерасхождения Трисомия Моносомия

Схема хромосомного отставания Моносомия Микроядро Моносомия

Принцип флюоресцентной гибридизации in situ

Трисомия 12 Нормальные клетки с дисомией 11 и 16 Моносомия 7 Нуллисомия Х Дисомия Y Тетраплоидия Интерфазная цитогенетика

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 Контроль Работники СХК 23% р=0,25 23% р=0,25 52% р=0,01 52% р=0,01 - Некультивированные лейкоциты- Культивированные лейкоциты (1 цикл репликации ДНК) Суммарная частота анеуплоидии у контрольных лиц и работников СХК с внешним гамма-облучением в некультивированных и культивированных клетках Назаренко С.А., Тимошевский В.А. Сравнительный анализ частоты анеуплоидии в покоящихся и делящихся клетках человека при воздействии вредных внешнесредовых факторов // Генетика Т С

Тест-система определения мутагенного влияния Обнаруженные закономерности могут быть положены в основу нового способа оценки мутагенного потенциала различных физических, химических и биологических факторов на основе технологии интерфазного молекулярно- цитогенетического анализа. Тимошевский В.А., Лебедев И.Н., Назаренко С.А. Биологическая индикация мутагенных воздействий: анализ числовых хромосомных нарушений в интерфазных клетках человека // Томск г. 40 с. Тимошевский В.А., Лебедев И.Н., Назаренко С.А. Биологическая индикация мутагенных воздействий: анализ числовых хромосомных нарушений в интерфазных клетках человека // Томск г. 40 с.

Тест-система определения мутагенного влияния Мутагенное влияние Отсутствие вредного воздействия Некультивированные и культивированные клетки Разность в частоте числовых хромосомных нарушений Значимое повышение Незначимое повышение Преимущество тест-системы: индивидуализация оценки мутагенного воздействия.

Анализ цитокинез-блокированных двухъядерных клеток Цитохалазин В

Б А cen FISH А: двухъядерная клетка с микроядром, содержащим центромерный FISH- сигнал, принадлежащий отставшей хромосоме; Б: распределение гибридизационных сигналов в ядрах при хромосомном нерасхождении. Схема определения хромосомного отставания и нерасхождения с помощью FISH-анализа двухъядерных клеток

Характеристика обследуемых групп Группавозраст Активность инкорпориро- ванного плутония, нКи Число проанализированных двухъядерных клеток Контроль (г. Северск) n = Работники СХК n = (X = 57) (X = 52)

Нормальные двухъядерные лимфоциты FISH-анализ цитокинез- блокированных двухъядерных клеток Двухъядерные лимфоциты, в которых произошло нерасхождение хромосомы 12 - D7Z1 - D12Z3 - D7Z1 - D12Z3

Частота нерасхождения по хромосомам 2, 8, 7, 12 в цитохалазин-блокированных лимфоцитах p=0,037 P

Уровень центромер-позитивных микроядер (частота хромосомного отставания) в цитохалазин-блокированных лимфоцитах индивидов исследуемых групп p = 0,018 Контроль СХК

FISH-анализ цитокинез- блокированных двухъядерных клеток Двухъядерные лимфоциты, в которых произошло отставание Y-хромосом Двухъядерные лимфоциты, в которых произошло нерасхождение обеих половых хромосом - DXZ1 - DYZ3 - DXZ1 - DYZ3

Частота нерасхождения по хромосомам Х и Y в цитохалазин-блокированных лимфоцитах Контроль СХК Контроль СХК Х-хромосома Y-хромосома

Частоты нерасхождения хромосом в цитохалазин-блокированных лимфоцитах Контроль СХК

Частота отставания хромосом Х и Y в цитохалазин-блокированных лимфоцитах Контроль СХК Контроль СХК Х-хромосома Y-хромосома

Частоты отставания хромосом в цитохалазин-блокированных лимфоцитах Контроль СХК

Числовые нарушения хромосом в клетках человека заслуживают пристального внимания в качестве новых потенциальных маркеров повреждения генетического аппарата вследствие воздействия ионизирующего излучения. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Цитогенетический анализ оказывается наиболее информативным в мониторировании биологических эффектов ионизирующего излучения в малых дозах. Повышенный уровень хромосомных аберраций регистрируется у ряда индивидов, подвергающихся действию ядерно-химических факторов в ходе своей профессиональной деятельности.

ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИЕ МОДИФИКАЦИИ ГЕНОМА ПРИ ПАТОЛОГИИ ЭМБРИОНАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ ЧЕЛОВЕКА к.б.н. И.Н. Лебедев Сибирский химический комбинат (г. Северск) Томский атомный центр (г. Томск) Клиническая больница 81 (г. Северск)