Микроэлементный состав печени и легких у крыс при алиментарном ожирении (метод РФА-СИ) В.А. Трунова (1), В.В. Зверева (1) и Б.А. Чурин (2) (1) Институт неорганической химии им. А.В. Николаева СО РАН, (2) Институт региональной патологии и патоморфологии СО РАМН

2 Печень Легкие органы с интенсивным метаболизмом окисление и синтез липидов наличие сложных ферментативных систем Подвергается ожирению (может развиться жировой гепатоз) Интенсивно изучается в связи с развитием ожирения Не подвергается ожирению Первый орган, к которому триглицериды (из просвета кишечника) поступают с кровотоком вскоре после приема пищи (в форме хиломикронов и липопротеинов очень низкой плотности) Функции легких уделяется недостаточное внимание при изучении ожирения

3 Цель : исследование метаболизма легких и печени в развитии алиментарного ожирения у крыс Задача: Определение концентраций химических элементов (от S до Sr) и установление межэлементных корреляций в ткани печени и легких у крыс с алиментарным ожирением методом РФА-СИ

4 Станция РФА-СИ (накопительное кольцо ВЭПП-3, ИЯФ СО РАН) ВЭПП-3: E ex = 2 GeV, B =2T, I e =100 mA; Параметры станции: Камера для анализа изготовлена из эльконайта; Монохроматор – монокристалл Si (111); Размер пучка от 1 до 30 mm2; Время измерения от 10 до 1000 с; Энергия возбуждения кэВ; Определяемые элементы: от S до U; ППД Si(Li) (OXFORD; 10 mm2) с разрешением на линии 5.9 кэВ эВ.

Схема эксперимента: (нелинейные крысы Wistar) Масса тела животных после 2,5мес. кормления пищей, богатой жирами, составляла порядка 280 г в контрольной группе животных и 360 г в группе с развившимся ожирением. Контрольная группа (n=22) Стандартный рацион вивария голодные (в течение 12 ч) 11 образцов легких 11 образцов печени сытые получали пищу, содержащую большое кол-во жиров (за 2 часа до) 11 образцов легких 11 образцов печени Животные с развившимся ожирением (n=20) (получали пищу, богатую жирами в теч.2,5 мес.) голодные (в течение 12 ч) 10 образцов легких 10 образцов печени сытые получали пищу, содержащую большое кол-во жиров (за 2 часа до) 10 образцов легких 10 образцов печени

6 Пробоподготовка образцов и стандартов: стандарты Сухой порошок стандартного образца (80 mesh) спрессовывался при помощи гидравлического пресса в таблетки Масса таблеток составляла порядка мг (диаметр пресс формы = 8 mm) Таблетки упаковывались в майларовые пленки (2.5 мкм), скреплялись фторопластовыми кольцами и помещались в кассету для анализа. образцы тканей Животных усыпляли этаминаловым наркозом (4 мг/100 г массы тела), затем производился отбор образцов тканей для анализа. Образцы были подвергнуты заморозки до момента непосредственной пробоподготовки. Фрагменты ткани упаковывались во фторопластовые пленки и выдерживались под грузом в течение 48 часов для придания им плоскопараллельной геометрии (при t=35С). Высушенные (на воздухе) образцы упаковывались в майларовые пленки и закреплялись фторопластовыми кольцами. Масса образцов после этапа пробоподготовки составляла порядка 3-8 мг (сухой вес). Поверхностная плотность образцов и стандартов составляла менее 20 мг/см2, что соответствует критерию тонкого слоя для РФА-СИ анализа такого рода образцов.

7 Certified reference materials (CRM) ________________________________________________ NIES 6 Mussel (Japan) NIST 1577 Bovine Liver (USA) NCS ZC Beef Liver (China) NIST 8414 Bovine muscle (USA) IAEA A-13 Animal blood (IAEA) NIES 2 Human serum (Japan) NIST 1566 Oyster tissue (USA) Энергия возбуждения 15 – 21 кэВ. Обработка спектров осуществлялась при помощи программы WinQXAS для флуоресцентных спектров. Концентрации химических элементов определяли методом внешнего стандарта. Какой (какие?) стандартные образцы можно использовать для анализа элементного содержания ткани легкого?

8 Оценка поглощающих характеристик матриц образцов (ткани легких) и различных стандартов Отношение Coh/Incoh I Coh – линейно возрастающая функция, I Compt - линейно убывающая функция μ m (E0), где μ m (E0) - полный массовый коэффициент поглощения из базы данных NIST (данные о составе матрицы)

9 Элементный анализ Масса тела животных с ожирением увеличилась на 28% по сравнению с контрольными особями

10 2 пула химических элементов в организме: Оборотный (мобильный) пул – биологически активные химические элементы, работающие в различных ферментах, транспортных белках и т. п. Резервный пул (депо) – химические элементы, накапливающиеся в определенных органах и тканях (например, Fe накапливается в печени в виде Fe-содержащего белка ферритина).

11 Коэффициент корреляции Спирмена (p=0.01) Печень. n (контрольные) = 11, n (с ожирением) =10 Контрольные, голодныеКонтрольные, сытые С ожирением, голодныеС ожирением, сытые

12 Непараметрический коэффициент корреляции Спирмена (r s ) (p=0.01) Легкие. n (контрольные) = 11, n (с ожирением) =10 Контрольные, сытые С ожирением, голодныеС ожирением, сытые Контрольные, голодные

13 Кластерный анализ. Метод Варда. Печень ! кластер Mn-Cu-Zn-As-Se-Br-Rb кластер Fe-Zn-Rb-Se Контрольные, голодныеКонтрольные, сытые С ожирением, голодные С ожирением, сытые

14 Кластерный анализ. Метод Варда оптимизация мин. дисперсии внутри кластеров. Легкие ! кластер Fe-Cu-Zn-Se-Br-Rb Контрольные, голодныеКонтрольные, сытые С ожирением, голодныеС ожирением, сытые

15 Выводы Лёгкие крыс, наряду с печенью, принимают активное участие в обменных процессах, включая обмен липидов. Изменение характера и числа межэлементных корреляций происходит как в случае уже развившегося ожирения (длительное воздействие), так и сразу после приема пищи с высоким содержанием жиров (краткое воздействие). Легкие, по-видимому, в гораздо большей степени подвергаются этому воздействию, по сравнению с печенью. Наблюдаемые корреляции могут отражать работу «мобильного пула» химических элементов в метаболизме липидов в печени и в легких. Наибольшее число положительных межэлементных корреляций наблюдается для состояния физиологического голода в легких, что свидетельствует об интенсивном метаболизме. Уменьшение числа корреляционных связей для Mn, Fe, Cu, Zn, Se может свидетельствовать об ослаблении системы антиоксидантной защиты в легких при ожирении, что, в свою очередь, может быть одним из факторов, приводящих к развитию алиментарного ожирения у крыс. Br и Rb, роль которых в биологических процессах мало изучена, принимают активное участие в метаболизме легких и печени у крыс в норме и при алиментарном ожирении.

16 Благодарю за внимание!

17 Градуировочные графики K и Zn, построенные по данным стандартных образцов с одинаковыми характеристиками матриц

18 Перекисное окисление липидов (образование реактивных форм кислорода) 1)Один из механизмов, по которому образуются реактивные формы кислорода – реакция Фентона: Fe (II) + H 2 O 2 Fe (III) + OH· + HO- Fe присутствует в составе многих биологически активных соединений, участвующих в транспорте кислорода, цепи переноса электронов, синтезе ДНК. Трансферин – пример антиоксидантного протеина, который связывает Fe, для того, чтобы ингибировать генерирование свободных радикалов (запускаемое Fe). 2) Сu – главный компонент металлоферментов, участвующих в окислении- восстановлении (фермент - супероксид дисмутаза (СОД)). Пример реакции с участием СОД: Cu (II) + O 2 ·- Cu (I) + O 2 Cu (I) + O2·- + 2H+ Cu (II) + H 2 O 2 Zn тоже участвует в этом, так как 1 атом Cu и 1 атом Zn координируют ген SOD1, который кодирует СОД-ферменты. Однако, Cu может оказывать и негативный эффект, так как может индуцировать окислительный стресс. Существует также Mn-зависимая форма СОД.

19 Перекисное окисление липидов субстрат – полиненасыщенные цепи жирных кислот (в клеточных мембранах и липопротеинах, атака АФК по сопряженным двойным связям) Ферменты антиоксидантной защиты : Супероксиддисмутаза ( СОД играет ключевую роль!) – Mn, Cu, Zn, Каталаза - Fe Глутатионпероксидаза (ГП) - Se, Глутатионредуктаза и Глутатион-S-трансфераза (GST) ( KBr greatly influences the monomer-dimer equilibrium of the wildtype isozyme GST-M1-1 ) ) Белковая база данных BRENDA, 2) Кулинский В.И., Колиснеченко Л.С. Структура, свойства, биологическая роль в регуляции глутатионпероксидазы: Успехи современной биологии 1993; 113 (1):

20 Отношение Coh/Incoh при изменении энергии возбуждения (E ex ). (на примере стандартного образца Mussel NIES No.6, n=8) это можно использовать, чтобы снизить предел обнаружения, так как пики рассеяния дают основной вклад в фон при анализе образцов с легкой матрицей

21 SRXRF-station (Storage ring VEPP-3, INP SB RAS, Novosibirsk, Russia) а) view from above б) side view Storage ring VEPP-3: E ex = 2 GeV, B =2T, I e =100 mA; Characteristics of the station: Chamber for the analysis is made of elconait; monochromator is the monocrystalof Si (111); Maximum diameter of sample is 30 mm; Beam spot area is from 1 до 30 mm2; Measurement time is from 20 до 1000 s.; Energy of excitation keV; Elements detected: from S to U; Si(Li) detector (OXFORD, Oxford Instruments Inc., USA) with area of 10 mm2, energy resolution (at 5.9 keV) is equal to 150 eV. Si(Li) Primary beam monochromator

22 K (Rb), Ca, Cl, Br – электролиты (уровень этих элементов в нормальном состоянии организма меняется мало, так как они являются эссенциальными и их содержание достаточно жестко регулируется физиологически) Перекисное окисление липидов. Окислительный стресс - дисбаланс между окислительной и антиоксидантной системами. 1) Один из механизмов, по которому образуются реактивные формы кислорода – реакция Фентона: Fe (II) + H2O2 Fe (III) + OH· + HO- Fe присутствует в составе многих биологически активных соединений, участвующих в транспорте кислорода, цепи переноса электронов, синтезе ДНК. Трансферин – пример антиоксидантного протеина, который связывает Fe, для того, чтобы ингибировать генерирование свободных радикалов (запускаемое Fe). 2) Сu – главный компонент металлоферментов, участвующих в окислении-восстановлении ( фермент - супероксид дисмутаза (СОД)). Пример реакции с участием СОД: Cu (II) + O2·- Cu (I) + O2 Cu (I) + O2·- + 2H+ Cu (II) + H2O2 Zn тоже участвует в этом, так как 1 атом Cu и 1 атом Zn координируют ген SOD1, который кодирует СОД- ферменты. Однако, Cu может оказывать и негативный эффект, так как может индуцировать окислительный стресс, 3) Известно, что Zn участвует в работе иммунной системы организма, предотвращает образование свободных радикалов, работая как кофактор СОД. Zn –компонент ДНК-связывающих протеинов и некоторых протеинов, участвующих в восстановлении ДНК. 4) Mn – также является компонентом антиоксидантных ферментов – СОД и аденилил циклазы (принимает также участие в цепи переноса электронов). 5) Se - является компонентом фермента антиоксидантной защиты - глутатион пероксидазы (а также других Se-содержащих протеинов), который участвует в защите биомембран от повреждений, вызванных действием свободных радикалов. Обнаружены и другие Se-содержащие протеины, однако их функции не до конца ясны. Известно, что содержание Se может увеличиваться с повышением уровней содержания других метало, так как он участвует в их детоксикации (в печени). Mn, Fe, Cu, Zn, Se - совместно участвуют в окислительно-восстановительных процессах, и в антиоксидантной защите. (перекисное окисление липидов сюда напрямую относится?).

23 Lower limits of detections (С min ), ppm C min, ppm KCa 13 keV Bovine liver NIST keV Bovine liver NIST keV Bovine liver NIST С min = 3.29·Сst · [*] P=0.95 N p - интегральная площадь пика (Ka-линии) определяемого элемента, N bgr - площадь фона, C st – концентрация определяемого элемента в стандартном образце. [*]. Thomas O.Ziebold. Precision and Sensitivity in Electron Microprobe Analysis // Analytical Chemistry. – – Vol.39, No.8. – P

24 Curves of relative sensitivity for standard Bovine liver NIST 1577 (for different area density of pellets). E ex = 17 keV

25 Таблетки стандартного образца Bovine liver NIST 1577 (ткань печени), приготовленные из разной массы сухого материала стандарта: 7.5, 9.2, 11.9, 13.4, 18.8, 23.0 (мг), что соответствует значениям поверхностной плотности таблеток излучателя (ρ s ): 14.9, 18.3, 23.7, 26.7, 37.4, 45.8 (мг/см2)

26 Coefficients of relative spectrometric sensitivity (R is ) for the minimum (14.9 mg/cm2 ) and maximum (45.8 mg/cm2 ) of area density of pellets of Bovine liver NIST E ex = 17 keV К and Ca

27 Coefficients of relative spectrometric sensitivity (R is ) for the minimum (14.9 mg/cm2 ) and maximum (45.8 mg/cm2 ) of area density of pellets of Bovine liver NIST E ex = 17 keV Rb

28

29 The internal standard method: Relative sensitivities (R is ) between the elements and the IS are calculated on the following formula: [5], where N IS,l1 is the count rate of the analytical line l1 o the internal standard, C i and C IS are the concentrations (mass fractions) of element i and the internal standard. An equation that relates the net count rate (intensity) of the incoherently scattered peak to the count rate of the IS can be written in following way: (when the exciting radiation can be assumed to be monochromatic) [5], where ε(E il ) and ε(E IS,l1 ) is the detection efficiency for the energy of the selected analytical line of element I and the line of IS, Q il (E ex ) and Q IS,l1 (E ex ) are the production cross section of the characteristic line l of element I and of the IS, respectively.

30 The incoherently scattered peak can be used as the internal standard: (the scattering properties of the sample and the standard must be the same), where ψ is the scattering angle ( ), σ INC is the differential incoherent scatter cross section and ΔΩ is the solid angle with which the detector looks at the sample.

31 The coefficients of relative sensitivity of the spectrometer were calculated on the following formula: (1) N is is the peak area of Kα 1,2 -line of element i in the standard (CRM), N INC is the area of incoherent scattering peak, C is is the concentration of element i in the standard (CRM). The concentrations of uncertified elements were determined by the using of this formula (1). All curves were approximated by the polynomial functions of 2 nd or 3 rd order [1, 2, 3]. _____________________________________________________________________________________________________________________________________________ [1]. E.D. Greaves, G. Bernasconi, P. Wobrauschek, C. Streli. Spectrochimica Acta Part B. 1997, Vol. 52. – P [2]. Marco L.M., Greaves E.D., Alvarado J. Spectrochimica Acta Part B Vol. 54. – P [3]. L. M. Marcό P et al. Spectrochimica Acta Part B Vol. 56. P – 2201.

32 Beef liver NCS ZC (печень) и Bovine liver NIST 1577 (печень). E ex = 17 кэВ. (n=5) НЕ ДАВАТЬ

33 Сравнение результатов двух методов По t-критерию: t (p=0.95) = 4.302, t* (p=0.95, n=3), расcчитанное сравнивалось с табличным t табл.= 2.8 для двусторонней оценки (p=0.95, n=5) Рассчитывались:

34 Coh/Incoh Для образов «промежуточной толщины», в ограниченной области величины массы на единицу площади (поверхностной плотности) - интенсивность I Compt - линейно убывающая функция, а - интенсивность I Coh – линейно возрастающая функция μ m (E 0 ), где μ m (E 0 ) - полный массовый коэффициент поглощения

35 * Распространение ожирения неуклонно растет во всем мире. Оно тесно связано с такими заболеваниями как диабет, различные сердечно-сосудистые заболевания и др. * Фактор питания играет важную роль в развитии ожирения, однако причины широкого распространения этого заболевания еще не до конца ясны. В частности, неясна роль легких в возникновении и развитии ожирения, тогда как функционирование печени исследуется достаточно интенсивно. * Печень и легкие это органы с активным метаболизмом. Печень играет важную роль в метаболизме химических элементов, одновременно являясь депо для многих из них. * В легких также имеются ферментативные системы (как и в печени), обеспечивающие метаболические процессы на высоком уровне интенсивности (окислительно-восстановительные процессы, метилирование и др.). Эти ферменты принимают активное участие и в метаболизме липидов. * Легкие – первый орган, к которому триглицериды поступают в кровь после приема пищи. * Известно, что печень является органом, подвергающимся процессу ожирения, тогда как легкие – нет. Об участии легких в развитии ожирения крайне мало литературных данных.