Биосинтез нуклеиновых кислот

В состав ДНК и РНК входит четыре основных нуклеотида: два пуриновых и два пиримидиновых. Для краткого изображения последовательности нуклеотидов в нуклеиновых кислотах пользуются однобуквенным кодом. Запись осуществляют слева направо, так что первый нуклеотид имеет свободный 5'-фосфатный конец, а последний –ОН-группу в 3'-положении рибозы или дезоксирибозы. Например, первичная структура ДНК может быть записана следующим образом: CGTAAGTTCG… Первичную структуру РНК записывают следующим образом: САUUAGGUAA…

Цепи молекулы ДНК не идентичны, но комплементарны друг другу: если известна первичная структура одной цепи, то последовательность нуклеотидов другой цепи задается правилом комплементарности оснований: А одной цепи соответствует Т, а С G в другой цепи. Поэтому в молекуле ДНК количество адениловых нуклеотидов равно количеству тимидиловых нуклеотидов (А = Т), а количество гуаниловых равно количеству цитидиловых нуклеотидов (G = С). Соотношение А + Т / G + С величина постоянная и является видоспецифической характеристикой организма (правило Чаргаффа).

Гистоны это небольшие белки с молекулярной массой от до Д и высоким содержанием лизина и аргинина. Четыре типа гистонов в количестве 8 молекул (по две каждого вида) образуют комплекс нуклеосомный кор. Этот комплекс за счет ионных связей взаимодействует с отрицательно заряженными фосфатными группами участка ДНК длиной около 146 нуклеотидных пар (примерно полтора витка вокруг кора) и образует четковидную, компактную структуру, называемую нуклеосомой. Между нуклеосомами находится участок ДНК длиной около 30 нуклеотидных пар линкерный участок, к которому присоединяется молекула гистона Н1. Негистоновые белки представлены множеством ферментов и белков, участвующих в синтезе ДНК, РНК, регуляции этих процессов и компактизации ДНК.

Основные виды РНК: матричные РНК (мРНК), или информационные, составляют 2– 4 % всей РНК клетки. Они чрезвычайно разнообразны по первичной структуре и их количество соответствует числу белков в организме, так как каждая молекула мРНК является матрицей в синтезе соответствующего белка; транспортные РНК (тРНК) являются молекулами-адапторами, у которых к 3' концу присоединяется аминокислота, а к участку антикодона мРНК. тРНК содержат 10–20% модифицированных или минорных нуклеотидов, в состав которых входят метилированные или восстановленные азотистые основания, нуклеотиды с С С связью между азотистым основанием и рибозой. Вторичная структура тРНК описывается структурой «клеверного листа». На долю тРНК приходится около 15% всей РНК клетки.

рибосомные РНК (рРНК) составляют около 80% всей РНК клетки и входят в состав рибосом. В цитоплазматические рибосомы эукариотов входит четыре типа рРНК с разной константой седиментации скоростью оседания в ультрацентрифуге (КС), которая выражается в единицах Сведберга (S). Комплекс большой и малой субъединиц рибосомы образует компактную частицу с КС 80 S. Митохондриальные рибосомы значительно мельче цитоплазматических рибосом (55 S) и их структура сходна со структурой рибосом у прокариотов.

Метод молекулярной гибридизации позволил установить следующие закономерности: – ДНК всех клеток одного организма идентична, а ДНК разных организмов одного вида обнаруживает очень высокое сходство, обеспечивая образование «совершенных гидридов»; – ДНК является видоспецифической характеристикой организмов: чем больше филогенетическая дистанция между видами, тем сильнее отличается строение ДНК из тканей особей этих видов; – ДНК, выделенная из тканей определенного организма, содержит информацию о структуре всех видов РНК данного организма.

Процесс синтеза ДНК включает стадии: инициации, элонгации и терминации. В ходе инициации происходит расплетение двойной спирали ДНК матрицы и образование репликативной вилки. Участвуют в этом процессе ферменты ДНК-топоизомераза 1, ДНК-хеликаза и белки, связывающиеся с одноцепочечными участками ДНК (SSВ-белки).

На стадии элонгации дочерние нити ДНК образуются на обеих нитях материнской ДНК. Этот процесс катализирует несколько ДНК-полимераз, которые синтезируют полинуклеотидные цепи из дНТФ в направлении от 5'- к 3'-концу на антипараллельной матрице, имеющей направление от 3'- к 5'- концу.

Новые цепи синтезируются неодинаково. На матрице ДНК с направлением от 3'5' концу цепь растет непрерывно по ходу движения репликативной вилки и называется лидирующей. На матрице с направлением 5'-3'- концу вторая цепь синтезируется против движения репликативной вилки в виде коротких отрезков фрагментов Оказаки (по имени ученого, впервые обнаружившего их образование). Рост этой цепи начинается, только когда на матрице ДНК появляется одноцепочечный участок длиной около 200 нуклеотидов (равный длине фрагмента Оказаки), поэтому ее называют запаздывающей, или отстающей.

Синтез начинается с образования праймера олигорибонуклеотида (РНК), включающего около 10 мононуклеотидов. Его образование катализирует праймаза субъединица, входящая в состав ДНК- полимеразы α. Далее этот же фермент переключается на образование ДНК и включает во вновь синтезируемую нить около 60 дезоксинуклеотидов, после чего заменяется другими ДНК-полимеразами. Продолжают синтез лидирующей цепи ДНК-полимераза δ, а отстающей ДНК-полимераза δ или ε. Оба фермента обладают экзонуклеазной активностью и в ходе синтеза могут исправлять допущенную ошибку и отщеплять неправильно включенный нуклеотид. Это обеспечивает высокую точность синтеза ДНК.

В отстающей нити каждый фрагмент Оказаки содержит около 200 нуклеотидов, включающих РНК-праймер и участок ДНК. Праймер удаляется эндонуклеазой и РНКазой, а ДНК-полимераза β заполняет образующуюся «брешь» по принципу комплементарности, используя дНТФ в качестве субстратов. ДНК-лигаза объединяет фрагменты в полинуклеотидную цепь. Кофактором всех стадий репликации является ион Мg2+.

В результате образуются дочерние цепи, комплементарные нитям материнской ДНК. После деления каждая дочерняя клетка получает диплоидный набор хромосом, идентичный материнской клетке.

Биосинтез РНК (транскрипция)

Синтез РНК на матрице ДНК называют транскрипцией. Процесс катализируют РНК-полимеразы, которые образуют полирибонуклеотиды в соответствии с принципом комплементарности к матричной нити ДНК, в которой информация о структуре гена записана в направлении от 3'- к 5'-концу. В ядре РНК синтезируются тремя ферментами: РНК- полимераза I катализирует образование рРНК, РНК- полимераза II синтез мРНК, а РНК-полимераза III образование тРНК.

Все РНК-полимеразы осуществляют рост новых цепей РНК в направлении от 5'-3'-концу на антипараллельной матрице. Процесс транскрипции включает стадии инициации, элонгации и терминации. РНК-полимераза узнает место начала транскрипции промотор, имеющий специфическую последовательность нуклеотидов: –ТАТА. На стадии инициации к ТАТА-последовательности присоединяется белок ТАТА-фактор, который стимулирует связывание с ДНК РНК-полимеразы и факторов инициации транскрипции. Образующийся комплекс вызывает расплетение двойной нити ДНК длиной в один виток спирали (около 10 нуклеотидных пар).

На этапе элонгации происходит синтез РНК в соответствии с информацией, содержащейся в гене ДНК, при этом факторы инициации удаляются, а фактор элонгации присоединяется. По мере движения РНК-полимеразы по нити ДНК к освободившемуся промотору присоединяются новые молекулы фермента, поэтому один ген может одновременно транскрибироваться несколькими молекулами РНК-полимеразы.

Этап терминации начинается, когда РНК- полимераза достигает специфической последовательности нуклеотидов сайта терминации, расположенного на конце гена. Фактор элонгации отделяется от РНК- полимеразы, а присоединяется фактор терминации, который облегчает отделение РНК- продукта и фермента от матрицы ДНК.

Посттранскрипционные модификации пре-РНК

Молекулы РНК, которые синтезируются РНК- полимеразами, функционально неактивны и являются молекулами-предшественниками, или пре-РНК. Они превращаются в зрелые молекулы только после соответствующих посттранскрипционных модификаций. Этот процесс получил название процессинга или созревания РНК.

Образование зрелых молекул мРНК начинается еще в момент синтеза РНК- полимеразой II новой молекулы на стадии элонгации. К 5'-концу растущей нити РНК с отщеплением ортофосфата присоединяется 5'-концом молекула ГТФ. Затем основание гуанин в составе ГТФ метилируется с образованием 7-метил-ГТФ. Эту необычную группу в составе мРНК называют «кэп» (колпачок или шапочка):7метил-G (5) ppp(5) X… Кэп защищает 5-конец мРНК от действия нуклеаз и узнается рибосомами в ходе инициации трансляции.

После того как пре-мРНК освобождается из связи с РНК-полимеразой поли(А)-полимераза на 3- конце молекулы синтезирует поли(А)-«хвост», состоящий примерно из 200 остатков АМФ и защищающий мРНК от расщепления РНКазами. Субстратом реакции является АТФ. Процесс получил название полиаденилирования.

Эукариотические ДНК имеют «мозаичное» строение, т. е. содержат участки, кодирующие последовательность аминокислот в отдельных доменах молекулы белка, экзоны, и участки, не содержащие информации о строении белка или РНК, интроны. В ходе транскрипции получаются пре-РНК, содержащие участки комплементарные как экзонам, так и интронам. При созревании мРНК интроны удаляются, а экзоны соединяются между собой с высокой точностью с помощью комплексов из малых ядерных рибонуклеопротеинов сплайсосом. Этот процесс получил название сплайсинга

10–15 % азотистых оснований модифицируется: урацил метилируется и образует тимин; двойная связь между С4 и С5 атомами урацила восстанавливается, давая дигидроурацил, остаток урацила, присоединенный к рибозе N-гликозидной связью, подвергается ротации и его связь с рибозой становится углерод-углеродной, возникает соединение, называемое псевдоуридин. к 3'-концу всех тРНК с помощью нуклеотидилтрансферазы последовательно присоединяется триплет нуклеотидов ССА, который необходим для связывания аминокислот. зрелые молекулы тРНК выходят из ядра в цитоплазму. Посттранскрипционные модификации тРНК

Пре-рРНК освобождаются из комплекса с ДНК в виде крупного транскрипта с константой седиментации 45 S. 1–2 % нуклеотидов этой молекулы метилируется по 2'- гидроксильной группе рибозы. Метильные группы служат маркерами для последующего расщепления пре-рРНК на более мелкие молекулы, включающиеся в субъединицы рибосом. Так, 18 S рРНК формирует малую 40 S субъединицу рибосомы, а молекулы с КС 28 S и 5,8 S включаются в большую субъединицу рибосомы. Самая короткая 5 S рРНК кодируется отдельным геном, транскрибируется РНК-полимеразой III (ответственной за синтез тРНК) и затем поступает в 60 S рибонуклеопротеиновую частицу. Посттранскрипционные модификации пре-рРНК

Субъединицы рибосомы и все зрелые мРНК и тРНК поступают в цитоплазму клетки и используются в синтезе белков.

Трансляция (биосинтез белка)

Декодирование информации о структуре белка, записанной в виде последовательности кодонов мРНК, возможно благодаря тРНК, выполняющим функции адапторов («приспособителей» аминокислот к кодонам мРНК). В центре полинуклеотидной цепи этих молекул имеется антикодоновая петля, в которой находится триплет нуклеотидов антикодон, способный связываться с кодоном мРНК по принципу комплементарности и антипараллельности. На 3-конце молекулы все тРНК имеют акцепторный триплет – ССА, к которому аминокислоты присоединяются α-СООН-группой.

Структура тРНК

Активация свободных аминокислот осуществляется при помощи специфических ферментов – аминоацил- тРНК-синтетаз – в присутствии АТФ. Этот процесс протекает в две стадии:

Аминокислота присоединяется к свободному концевому 3'-ОН-гидроксилу АМФ, который вместе с двумя остатками ЦМФ образует концевой триплет ЦЦА, являющийся одинаковым для всех транспортных РНК

Инициация начинается с присоединения в область «кэпа» к зрелой мРНК 40 S субъединицы рибосомы, инициирующей аа-тРНК (у эукариотов это всегда Мет- тРНК), факторов инициации и молекулы ГТФ. Образующийся комплекс скользит по мРНК вплоть до встречи с инициирующим кодоном AUG. Когда антикодон Мет-тРНКМет связывается с кодоном AUG, комплекс останавливается, к нему присоединяется 60 S субъединица рибосомы, при этом ГТФ гидролизуется до ГДФ и Н3РО4, а факторы инициации удаляются. Формируется полная 80 S рибосома с двумя активными центрами: Р-центром (пептидильным), в который оказывается включенной Мет-тРНК Мет, и А- центром (аминоацильным), в область которого попадает первый смысловой кодон мРНК.

Элонгация включает три последовательные стадии. 1. Связывание аа-тРНК в А-центре. К свободному А-центру присоединяется аа-тРНК, у которой антикодон комплементарен кодону мРНК, находящемуся в области этого центра. Для того чтобы это событие стало возможным, в структуре рибосомы происходят конформационные изменения, требующие затраты энергии ГТФ и участия фактора элонгации EF1. 2. Образование пептидной связи. Между α-NH2-группой аминокислоты, находящейся в Ацентре в составе аа-тРНК, и карбоксильной группой метионина или другой аминокислоты, входящей в растущую полипептидную цепь, которая присоединена к тРНК Р-центра, образуется пептидная связь. Катализирует реакцию пептидилтрансфераза. Продуктом реакции становится удлиненная на одну аминокислоту пептидил-тРНК, расположенная в А-центре рибосомы.

3. Транслокация перемещение рибосомы по мРНК. Рибосома продвигается по мРНК на один кодон в направлении от 5'- к 3'- концу с использованием энергии ГТФ и при участии фактора элонгации еEF2. В результате в рибосоме пептидил-тРНК из А- центра попадает в Р-центр, а в А-центре оказывается следующий кодон мРНК. тРНК, которая передала Мет или растущий пептид на аминокислоту аа-тРНК, на 2 этапе теряет связь с Р-центром и уходит в цитозоль клетки. Рост полипептидной цепи белка продолжается за счет многократного повторения стадий

Терминация. Когда в А-центр рибосомы попадает один из стоп-кодонов мРНК: UАА, UАG, UGА, белковые факторы терминации RF1, RF3 узнают эти кодоны и освобождают вновь синтезированный пептид из связи с последней тРНК, субъединицами рибосомы и мРНК. Этот этап энергозависим и сопровождается гидролизом ГТФ. Каждая рибосома на мРНК занимает участок длиной около 80 нуклеотидов. По мере продвижения рибосомы по мРНК к 3'-концу молекулы 5'-конец освобождается и к нему присоединяются новые рибосомы. Одновременно несколько рибосом могут синтезировать полипептидные цепи на одной и той же мРНК. Комплекс мРНК с несколькими работающими рибосомами называют полирибосомой.

Полирибосомы бывают двух типов: свободные полирибосомные образования, плавающие в цитоплазме клеток и отвечающие за синтез внутриклеточных белков; связанные с эндоплазматическим ретикулумом (ЭР) и обеспечивающие синтез белков на экспорт.

Посттрансляционные модификации белков

фолдинг молекул. В процессе синтеза полипептидных цепей на рибосоме при участии белков шаперонов происходит формирование термодинамически наиболее выгодной пространственной конформации; образование дисульфидных связей между остатками цистеина. Эта модификация имеет важное значение для проявления активности многих белков (инсулина, иммуноглобулинов, рибонуклеазы и др.); частичный протеолиз, который имеет место при синтезе всех белков на экспорт и некоторых внутриклеточных белков; присоединение простетической группы, обеспечивающее образование сложных белков;

сборка протомеров в олигомерные белки, необходимую для образования молекул с четвертичной структурой; модификация аминокислотных остатков, свойственную многим белкам. Так, фосфорилирование гидроксильных групп в остатках Сер, Тре и Тир, гидроксилирование остатков Про и Лиз в молекулах коллагенов; карбоксилирование остатков Глу в факторах свертывания крови II, VII, IХ, Х и др., метилирование остатков Арг и Лиз в молекулах гистонов; йодирование остатков Тир в белке щитовидной железы тиреоглобулине и т.д. являются необходимым этапом в синтезе и функционировании биологически активных молекул