Danio Rerio – одна из важнейших позвоночных моделей для биологических исследований. Основные показатели: митотический индекс; индекс пикнотических ядер. Генетическую стабильность клеточной популяции эмбриональных клеток Danio rerio определяли по анализу хромосом. (The Zebrafish Book; 1995) ВВЕДЕНИЕ

ПОСТАВЛЕННЫЕ ЦЕЛИ Отработать методы получения препаратов эмбриональных клеток. Проанализировать эмбриологические и цитогенетические показатели в процессе эмбриогенеза у Danio rerio. Создать тест-систему для определения эмбриотоксического действия веществ и окружающей среды на эмбрион.

ОБЪЕКТ ИССЛЕДОВАНИЙ Данио рерио является замечательным объектом для генной инженерии, который встал наравне с дрозофилой и мышами. Рыбка удобна по следующим параметрам: - рыбка почти также плодовита, как дрозофила; - она имеет прозрачную оболочку икринок; - развитие зародыша можно наблюдать в отдельном сосуде, в отличие от мышей; - является модельным объектом для изучения развития всех органов (органогенез); - геном составляет немногим более, чем половина генома человека и мыши (1,7 гигабаз); - абсолютное число генов неизвестно, но большое количество генов клонировано, причем многие гены имеют большую гомологию с хромосомами млекопитающих; - удобно идентифицировать гены и мутации, проводить генетический и цитологический анализы. (The Zebrafish Book; 1995)

МОРФОЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ Стандартный протокол получения препаратов метафазных клеток включает следующие основные стадии: 1.Накопление митотических клеток; 2.Гипотоническая обработка; 3.Фиксация клеток в смеси метанола и уксусной кислоты (соотношение 3:1); 4.Распластывание хромосом на стекле.

ХАРАКТЕРИСТИКА СТАДИЙ ЭМБРИОНАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ. стадииКраткая характеристика стадииВремя, ч 0Зигота (одноклеточная стадия)0,2 1Зародыш на стадии 2 бластомеров0,75 3Зародыш на стадии 8 бластомеров1,25 5Зародыш на стадии 32 бластомеров1,75 12Стадия овала3,7 21Образование хвостовой почки, закладка железы вылупления сомитов сомит (закладка глазного хрусталика)19, сомитов. Стадия Prim 5. Закладка сердца, начало пигментации тела и ретины Стадия Prim 22. Начало пигментации радужной оболочки глаза Стадия long pec. Удлинение зачатка грудного плавника Стадия выступающего рта.72

ИКРИНКИ В МАЛОЙ ЧАШКЕ ПЕТРИ

ПРЕДМЕТНЫЕ СТЕКЛА С ОКРАШЕННЫМИ ПРЕПАРАТАМИ

АНАЛИЗ ПРЕПАРАТА. п/пКол-во клетокКол-во митозов(%)Кол-во пикнозов(%) ,350, ,771, , , ,312,12 Среднее126,55,73±0,710,59±0,30 Количество делящихся и пикнотических клеток на стадии 35 развития эмбрионов Danio rerio (контроль) (n=1012)

N п/пКол-во клетокКол-во митозов(%)Кол-во пикнозов(%) 11327,583, ,414, ,924, ,613, ,854, ,553, ,005, ,935,36 Среднее1188,48±0,41*4,37±0,23*** N п/пN п/пКол-во клетокКол-во митозов(%)Кол-во пикнозов(%) 11077,484, ,323, ,373, ,724, ,094, ,804, ,823, ,823,92 Среднее117,49,7±0,83**3,9±0,17*** *P0,05***P0,001 После обработки 5% раствором ДМСО в течение 1 часа n=919. Количество делящихся и пикнотических клеток на стадии 35 развития эмбрионов Danio rerio после обработки 10% раствором ДМСО в течение 1 часа n=944. **P0,01***P0,001 (Меркурьева; 1970)

* ДМСО (диметилсульфоксид) – это вязкая бесцветная жидкость, почти без запаха. При смешивании с водой сильно нагревается. Реагирует с иодистым метилом, образуя ион сульфоксония, способный к взаимодействию с гидридом натрия. ДМСО – почти универсальный растворитель, он хорошо растворяет как малополярные, так и ионные соединения.

РЕЗУЛЬТАТЫ. 1.Дана характеристика пролиферативной активности и апоптоза на стадии 35 (25 часов) развития эмбриона. 2.После воздействия разных концентраций раствора ДМСО показано достоверное увеличение пикнотических ядер и пролиферативной активности. 3.Цитогенетический анализ показал, что диплоидный набор хромосом у Danio rerio составляет 50, среди которых по положению центромерного участка можно выделить 7 пар метацентрических хромосом и 18 пар субметацентрических хромосом, половые хромосомы не выявлены. 4.Таким образом, предложена тест-система по влиянию химических веществ и других агентов окружающей среды по показателям индексов митозов и пикнозов на определенных стадиях развития эмбрионов.

ОБСУЖДЕНИЕ И ВЫВОДЫ. Пикнотические ядра являются конечным результатом апоптоза. Цитологически апоптоз проявляется в сжатии клеток, образовании мембранных пузырьков, конденсации и фрагментации хроматина, образовании апоптозных телец, что связано с дегенерацией актин- миозинового скелета (Croft et al.,2005). Апоптоз является физиологическим механизмом, устраняющим избыточные, или функционально-аномальные клетки, необходимые для нормального развития многоклеточного организма (Моргункова, 2005). Хромосомный анализ дает дополнительную информацию о характере геномной стабильности. В наших экспериментах была получена только одна метафазная пластинка с аберрацией хромосомы, что не дает основания утверждать о сильно повреждающем действии ДМСО на геном. В наших экспериментах наблюдалось увеличение митотического индекса, что указывает на тот факт, что воздействие ДМСО усиливает пролиферативную активность эмбриональных клеток. Таким образом, в тестах на цито- и генотоксичность исследованных химических веществ могут быть с успехом использованы такие показатели как учет количества клеток с пикнотическими ядрами и индекс пролиферативной клеточной активности. Следовательно, на протяжении эмбрионального развития Danio rerio идет координация процессов активной пролиферации клеток, а также гибели наследственного материала части эмбриональных клеток.