1

2 PMID:

3 Процессинг митохондриальных РНК Разрезание полицистронных прекурсоров Полиаденилирование мРНК Модификации нуклеотидов В результате транскрипции мтДНК образуются полицистронные прекурсоры

4 Полицистронные пре-РНК образуется в результате транскрипции с: HSP2: 10 мРНК (ATP8/ATP6 и ND4L/ND4 остаются бицистронными) + тРНК HSP1: 2 рРНК + 2 тРНК LSP: 1 мРНК (ND6) и тРНК. PMID: Полицистронные прекурсоры мтРНК

5 tRNA punctuation model of RNA processing Nature Apr 9;290(5806): tRNA punctuation model of RNA processing in human mitochondria. Ojala D, Montoya J, Attardi G. PMID:

6 Процессинг митохондриальных тРНК Процессинг 5-конца тРНК -РНКаза Р Процессинг 3-конца тРНК -РНКаза Z На 3-конец тРНК добавляется триплет ССА - АТР (СТР)-тРНКтрансфераза Модификация множества нуклеотидов

7 PMID: Процессинг 5-конца тРНК осуществляет РНКаза Р MRPP1 (mitochondrial RNase P peptide 1) – m 1 G 9 метилтрансфераза, участвующая в модификации тРНК MRPP2 (mitochondrial RNase P peptide 2) – имеет NAD + - binding domain, есть также в цитоплазме MRPP3 (mitochondrial RNase P peptide 3) – PPR-белок, имеет металлонуклеазный домен

8 MRPP1 (mitochondrial RNase P peptide 3) - m 1 G 9 метилтрансфераза Метилирует G и A в положении 9 tRNA Leu. Эта модификация важна для нормального аминоацилирования и транспорта тРНК к рибосоме. Нокдаун MRPP1, помимо падения уровня большинства тРНК, приводит к сильному уменьшению количества мРНК и сильному падению уровня трансляции. PMID:

9 MRPP3 (mitochondrial RNase P peptide 3) Нокдаун MRPP3 снижает уровень многих тРНК, а также сильно уменьшает количество мРНК и бицистронных РНК и незначительно снижает уровень рРНК PMID:

10 PMID: PPR-мотивы содержатся во многих белках митохондрий и хлоропластов PPR мотив: 35 аминокислот повторяются от 2 до 26 раз РРR мотив образует 2 альфа-спирали PPR мотив, вероятно, участвует в связывании с РНК, но механизм этого взаимодействия неизвестен

11 PMID: Процессинг 3-конца тРНК осуществляет РНКаза Z: Эндонуклеаза ELAC2 (elaC homologue 2) оказалась РНКазой Z. ELAC2 взаимодействует с PTCD1, также участвующим в процессинге 3-конца тРНК.

12 Эндонуклеаза ELAC2 (elaC homologue 2) Нокдаун снижает уровень многих тРНК, не влияя на уровень мРНК и бицистронных РНК PMID: PMID: PMID:

13 PTCD1 – присутствует только в сердце, семенниках и мышцах. Гиперэкспрессия приводит к падению уровня tRNA Leu, а нокдаун увеличивает её количество. Негативный регулятор трансляции на уровне тРНК и/или участвует в процессинге 3-концов тРНК. PTCD1 (pentatricopeptide repeat domain protein 1) PMID:

14 1.Процессинг полицистронных мт-предшественников РНК происходит за счет вырезания из них тРНК - tRNA punctuation model 2.Процессинг 5-конца тРНК осуществляет мтРНКаза Р – комплекс из трех белков : MRPP1, MRPP2, MRPP3 3.MRPP1 (mitochondrial RNase P peptide 1) является m 1 G 9 метилтрансферазой и участвует в модификации тРНК 4.Процессинг 3-конца тРНК осуществляет РНКаза Z - эндонуклеаза ELAC2, возможно работающая в комплексе с белком PTCD1. 5.На 3-конец тРНК добавляется триплет ССА 6.В мт-тРНК происходит модификация множества нуклеотидов

15 Для синтеза дистальных от промотора транскриптов на обеих цепях необходим TEFM (transcription elongation factor mitochondrial) Нарезание полицистронного транскрипта (вырезание тРНК + разрезание в некоторых дополнительных местах) Полиаденилирование Процессинг митохондриальных мРНК

16 В геноме митохондрий есть 4 сайта не содержащих тРНК, но в которых происходит разрезание транскриптов при созревании: 5-конец СОХ1 – MRPP1 Между ND5 и CYT B – предположительно участвует PTCD2 Остальные 2 участка – механизм неизвестен

17 Полиаденилирование мРНК У цитоплазменных мРНК poly (A): стабилизирует транскрипт способствует выходу из ядра способствует инициации трансляции У бактерий и в хлоропластах poly (A): стимулирует деградацию мРНК

18 В митохондриях функции poly (A) различны у разных организмов: У растений – сигнал к деградации У дрожжей – нет poly (A), есть АU-богатый участок, необходимый для стабилизации У Простейших короткий poly (A) стабилизирует транскрипт во время редактирования, затем poly (A) удлиняется для трансляции Полиаденилирование мт-мРНК

19 Мт-мРНК имеют 3-poly (A) длиной около 45 нуклеотидов У мРНК ND5 короткий полиА хвост, у мРНК ND6 – его нет совсем, но только у этих двух мт МРНК есть длинный 3-UTR Почему? 3-UTR ND5 комплементарна кодирующей последовательности ND6, и наоборот - 3-UTR ND6 комплементарна кодирующей последовательности ND5. Возможно мРНК ND5 и ND6 образуют дц гибрид, что и препятствует полиаденилированию. Возможно, 3-UTR мРНК ND5 и ND6 формируют стабильные вторичные структуры. ND6 ND UTR

20 Полиаденилирование мт-мРНК создает стоп-кодоны для трансляции Для 7ми мт мРНК поладенилирование создает стоп-кодон на 3- конце, т.к. они заканчиваются на U или UA и не несут стоп-кодона PMID:

21 Ферменты полиаденилирования: hmtРАР (poly (A)-polymerase) – имеет гомологию с одной из цитоплазматических РАР Неизвестно, идет ли полиаденилирование в 2 стадии: олигоаденилирование, а уже затем образование длинного poly (A) с помощью РАР При нокдауне РАР полиА хвосты у всех мРНК короткие, уровень некоторых (СОХ1 и СОХ2) понижается, а некоторых не меняется или повышается (ND1, ND2, ND3, CYT B). При искусственном деаденилировании в митохондриях уровень мРНК СОХ1 и СОХ2 уменьшается, а мРНК ND1, ND2, ND3, CYT B наоборот увеличивается.

22 PNPase(polynucleotide phosphorylase экзонуклеаза) Гомолог одной из основных экзонуклеаз бактерий, может синтезировать poly (A) в отсутствии hmtРАР При уровня PNPase – удлиняются полиА хвосты мРНК СОХ1 и СОХ2, СOX3, ATP8/6 и ND3, хотя это не влияет на их время жизни. PNPase локализована в межмембранном пространстве, где нет мРНК.

23 PMID: PNPase(polynucleotide phosphorylase экзонуклеаза) 2. poly(A)-specific exoribonucleases: PARN, PDE12 3. SUV 3 РНК-хеликаза (её гомолог у дрожжей участвует в деградации мРНК) Деградация мт-мРНК SUV 3 in vitro образует комплекс с PNPase, который разрушает РНК в направлении 3-5. Гиперэкспрессия доминантно-негативного мутанта SUV3 приводит к удлинению полиА хвостов мРНК. Нокдаун как PNPase, так и SUV 3 приводит к практически полному отсутствию деградации мРНК и некоторая доля этих молекул имеет poly(U). PDE12 способен деградировать poly(U) последовательности.

24 PMID: Полиаденилирование мРНК митохондрий не оказывает решающего действия на их стабильность и не служит сигналом к их деградации.

25 1.Процессинг мт-мРНК включает в себя нарезание полицистронного транскрипта (вырезание тРНК + разрезание в некоторых дополнительных местах) и полиаденилирование 2.Мт-мРНК имеют 3-poly (A) длиной около 45 нуклеотидов, исключение составляет ND6 3.Полиаденилирование мт-мРНК создает стоп-кодоны для трансляции 7ми мРНК 4.Основные ферменты полиаденилирования в митохондриях: hmtРАР (poly (A)-polymerase) и PNPase(polynucleotide phosphorylase экзонуклеаза) 5.Основные ферменты, участвующие в деградации мт-мРНК: PNPase(polynucleotide phosphorylase экзонуклеаза) и РНК-хеликаза SUV 3 6.Полиаденилирование мРНК митохондрий не оказывает решающего действия на их стабильность и не служит сигналом к их деградации

26 Количество разных молекул мРНК варьирует в широких пределах (6000 – на клетку) => существует активная регуляция количества мРНК: Комплекс LRPPRC/SLIRP увеличивает стабильность мРНК, стимулируя полиаденилирование мРНК mtРАРом и защищая мРНК от деградации Регуляция уровня мРНК на постранскрипционном уровне: TACO1 (translational activator of mitochondrially encoded cytochrome c oxidase I) – мутации в нем вызывают падение синтеза белка СОХ1 Регуляция уровня мт-мРНК

27 Уровень 10 разных мРНК, образованных в результате нарезания преМРНК, существенно отличается. И имеет корреляцию с временем жизни: чем время жизни, тем большее количество данного вида мРНК содерится в митохондрии Постранскрипционная регуляция стабильности мРНК в митохондриях. PMID:

28 mRNACopy numbers/cellHalf-life (min) ND138000±160074±2 ND226000±160080±6 COX137000±490166±29 COX251000±480231±18 ATP8/647000± ±13 COX334000±600138±10 ND315000±85091±4 ND4L/432000± ±5 ND56000±7377±7 CYTB16000±84094±24 ND614000±29068±10 Количество копий мт мРНК и их время жизни в клетках Hela PMID:

29 Уровень мт-мРНК в клетке зависит от времени её жизни, за исключением мРНК ND1 и ND2. Почему мРНК ND1 и ND2 составляют исключение? Если мтДНК имеет мутации, образовавшиеся под действием ROS, транскрипты могут быть короткими, т.к. POLRMT останавливается, дойдя до мутированных нуклеотидов. Гены ND1 и ND2 находятся ближе всех к промотору HSP2. Фактор элонгации TEFM необходим POLRMT увеличения процессивности – т.е. для транскрипции дистальных генов. TEFM может не хватать, тогда будет образовываться больше проксимальных мРНК, чем дистальных.

30 Комплекс LRPPRC и SLIRP стабилизирует долгоживущие мт-мРНК Уровень мт-мРНК в клетках Hela после нокдауна LRPPRC и SLIRP снижается, причем значительнее у долгоживущих мРНК PMID:

31 LRPPRC (leucine-rich pentatricopeptide repeat motif- containing protein). Локализован в митохондриях, содержит 16 PPR мотивов, связывающих оцНК. LRPPRC образует стабильный комплекс с SLIRP. SLIRP (stem-loop-interacting RNA-binding protein), имеет участок связывания с оцРНК, локализован в митохондриях. Нокдаун SLIRP или LRPPRC резко снижает уровень мРНК, не влияя на уровень рРНК и тРНК. Нокаут LRPPRC летален у мышей – у эмбрионов снижено полиаденилирование.

32 Комплекс LRPPRC и SLIRP связывается с мт- мРНК и пре-мРНК, состоящими из мРНК и тРНК, но не связывается с пре-рРНК, состоящими из тРНК и рРНК. 12S и 16SрРНК также имеют сложную вторичную и третичную структуру, необходимую для образования малой и большой субъединиц рибосом. тРНК спонтанно приобретают вторичную и третичную структуру PMID:

33 Комплекс LRPPRC и SLIRP связывается непосредственно с кодирующей частью мРНК А не с поли(А) последовательностью т.к. мРНК ND6 не имеет полиА хвоста, но связывается с комплексом. А не с 5-UTR или с 3-UTR (в мт мРНК они короткие или отсутствуют), т.к. мРНК ND2 не имеет ни 5-UTR, ни 3- UTR3, но связывается с комплексом. Около 6 молекул LRPPRC связывается с каждой мРНК в кодирующей области, причем это связывание не специфично.

34 SLIRP, видимо, стабилизирует LRPPRC. In vitro LRPPRC стимулирует полиаденилирование mtРАРом мРНК. SLIRP стимулирует полиаденилирование mtРАРом в значительно меньшей степени.

35 Комплекс LRPPRC/SLIRP стимулирует полиаденилирование мРНК mtРАРом и защищает мРНК от деградации. PMID:

36 1.Существует постранскрипционная регуляция стабильности мРНК в митохондриях 2.Уровень мт-мРНК в клетке зависит от времени её жизни. 3.Комплекс белков LRPPRC и SLIRP стабилизирует мт-мРНК, причем долгоживущие в большей степени 4.Комплекс LRPPRC/SLIRP увеличивает стабильность мРНК, предположительно стимулируя полиаденилирование мРНК mtРАРом и защищая мРНК от деградации

37 PMID:

38 Процессинг мт-рРНК Уровень экспрессии рРНК в раз выше, чем уровень экспрессии наиболее распространенных мРНК (СОХ1 или СОХ2), что связано с большей скоростью транскрипции с промотора HSP1, чем HSP2. В свою очередь, 16S рРНК в митохондриях в 2 раза больше, чем 12S рРНК

39 PMID: Основные модификации рРНК в митохондриях В мт рРНК значительно меньше модификаций, чем в цитоплазматических или бактериальных snRNA не участвуют в модификациях мт рРНК, так же, как и у бактерий

40 PMID: TFB1M и TFB2M диметилируют А 936 и А937 в 12S rRNA Отсутствие TFB1M: приводит к потере диметилирования снижает уровень 12S rRNA ведет к невозможности трансляции в митохондриях.

41 PTCD3 связан с 12S рРНК, нокдаун снижает синтез белка, не влияя на её процессинг PMID: ERAL1 - GTP- связывающий белок, шаперон 12S рРНК: связывается с 12S рРНК, его количества приводит к уменьшению трансляции и распаду 12S рРНК. PTCD3 и ERAL1 необходимы для сборки и нормальной работы малой субъединицы мт-рибосом

42 MTERF4 связывает 16SрРНК и формирует комплекс с мт рРНК- метилтрансферазой NSUN4, необходимый для её вставки в большую субъединицу рибосом. Возможно, осуществляет направленную связь между транскрипцией и трансляцией. PMID:

43 1.Процессинг мт-рРНК включает в себя разрезание полицистронного транскрипта за счет вырезания тРНК 2.Уровень экспрессии рРНК в митохондриях в раз выше, чем уровень экспрессии наиболее распространенных мт-мРНК 3.В мт-рРНК значительно меньше модификаций, чем в цитоплазменных рРНК 4. TFB1M и TFB2M диметилируют А 936 и А 937 в 12S rRNA 5.PTCD3 и ERAL1 необходимы для сборки и нормальной работы малой субъединицы мт-рибосом 6.MTERF4 связывается с 16SрРНК и необходим для её вставки в большую субъединицу рибосом

44 PMID: PPR-мотивы содержатся во многих белках митохондрий и хлоропластов PPR мотив: 35 аминокислот повторяются от 2 до 26 раз РРR мотив образует 2 альфа-спирали PPR мотив, вероятно, участвует в связывании с РНК, но механизм этого взаимодействия неизвестен

45 3. MRPS27 (mitochondrial ribosomal protein of the small subunit 27) – компонент малой субъединицы рибосом 4. POLRMT – каталитическая субъединица РНКполимеразы 5. PTCD1 (pentatricopeptide repeat domain protein 1) - участвует в процессинге 3– концов тРНК 6. PTCD2 (pentatricopeptide repeat domain protein 2) – участвует в процессинге мРНК 7. PTCD3 (pentatricopeptide repeat domain protein 3) – связан с 12S рРНК, не влияет на её стабильность и процессинг, функции неизвестны. 1. LRPPRC (leucine-rich pentatricopeptide repeat containing protein) участвует в регуляции транскрипции 2. MRPP3 (mitochondrial RNAse P protein 3) – компонент РНКазы Р, участвует в процессинге 5– концов тРНК

46 PMID:

47 Вопросы для подготовки к зачету по лекциям 1-4 курса «Молекулярная биология митохондрий»: 1.Эволюция митохондриального протеома - PMID: , лекция 1 2.Геном митохондрий: устройство нуклеоида, формы мтДНК, митохондриальный генетический код, гены мтДНК - PMID: , лекция 1 3.Основы генетики митохондрий – гомоплазмия и гетероплазмия, особенности наследования генов мтДНК - лекция 1 4. Репликация мтДНК. Основные модели реликации мт генома, основные элементы мт генома, структура и функции основных ферментов репликации: ДНК полимераза γ, хеликаза TWINKLE, белок SSB, топоизомеразы, RNase Н I - PMID: , PMID: , лекции Основные механизмы репарации ДНК. Репарация BER в митохондриях: PMID: , лекция 2 6. Метилирование мтДНК – мт форма DNMT1: PMID: , лекция 2 7.

48 7. Транскрипция мтДНК. Структура и особенности POLRMT. Функции транскрипционных факторов TFB M1 и TFBM2. Структура, особенности связывания с ДНК и функции TFAM. PMID: , PMID: , лекции Терминация транскрипции мт генома. Механизм связывания с ДНК и функции MTERF1. Другие белки скмейства MTERF – их особенности и функции. PMID: , лекция 3 9. Процессинг мтРНК: tRNA punctuation model. Процессинг тРНК, процессинг мРНК: полиаденилирование, регуляция стабильности мРНК. Процессинг рРНК. PMID: PMID: , лекция PPR-белки, их особенности и функции в митохондриях. PMID: , лекция 2 и 4.

49 Зиновкина Людмила Андреевна, к.б.н., ст. преп. ФББ МГУ,