Рекомбинантные белки, современные способы получения и свойства каф. мол. биологии, МГУ

Общий метод получения рекомбинантного белка 1.Молекулярное клонирование гена или его фрагмента 2.Трансформация клеток, отбор клонов 3.Выращивание культуры или организма 4.Выделение и очистка белка

Молекулярное клонирование

Электропорация 25 мкФ = 2500 В при 200 Ω за 5 мс

Отбор клонов protein

Использование рекомбинантных белков Научные исследования – внесение мутаций, гомогенные ферменты, структурные исследования, слитые белки, антигены и т.д. Все остальное – биотехнологическое применение

Биотехнологии - технологиии, использующие живые организмы или продукты их жизнедеятельности в производстве и переработке различных продуктов Медицинские Диагностические (ИФА, ПЦР) Лечебные Вакцины БелкиДНК Терапия БелкиДНК Аграрные (силос, ГМ растения) Промышленные (стиральные порошки) Экологические

МедицинскиеЛечебныеВакциныБелкиДНК-вакциныТерапияБелки Из прирдных источников СинтетическиеРекомбинантные Культивируемые клетки Трансгенные животные ДНК генотерапия, антисенс- технология, siRNA. аптамеры, рибозимы

Рекомбинантные белки для лечения заболеваний: особые требования Высокая степень очистки Точная копия природного белка или научные доказательства безопасности мутаций для пациентов Проверенный, стабильный и безопасный продуцент Как можно более полное удаление ВСЕХ биополимеров и пирогенов продуцента (ДНК

Используемые системы экспресии Бактерии Esherichia coli и Bacillus subtilis Дрожжи Saccharomyces cerevisae и Pichia pastoris Линии клеток млекопитающих CHO, BHK, A- 293 Трансгенные животные

Экспрессионный вектор Точка инициации репликации - ORI Селекционные маркеры Промотор целевого гена Терминатор транскрипции Полилинкер - MCS

Бактерия Esherichia coli Быстрый рост (6-12 часов от посева до окончания индукции) Относительно высокий выход целевого белка ( мг/л) Низкая цена ростовой среды (натуральные простые компоненты) Низкая стоимость ферментации Возможность получать микрокристаллы целевого белка (тельца включения) Затруднен биосинтез крупных полипептидов (>50 кДа) Нет системы гликозилирования Ограниченные возможности секреции белков Многие гетерологичные белки токсичны для клеток Затруднено образование дисульфидных связей Многие гетерологичные белки образуют только тельца включения Преимущества Недостатки

E.coli – пример системы экспресии Внехромосомная репликация вектора Индуцибельный промотор Специальный штамм Дополнительный остаток Met[-1] или лидерный пептид Блок стоп-кодонов

E.сoli – варианты систем экспрессии Системы экспрессии в E.coli Цитоплазматическая экспрессия Нерастворимый белок (тельца включения Растворимый белок Секреция в периплазму Растворимый белок

E.coli – примеры использования Белки Bactericidal/permeability-increasing Protein, rDNA Carboxypeptidase, rDNA G-CSF, rDNA/Amgen GM-CSF, rDNA/Schering-Plough Hyaluronidase, rDNA Insulin-like Growth Factor-1, rDNA/Tercica Interferon alfa-2a, rDNA Interferon alfa-2b, rDNA Interferon alfacon-1, rDNA Interferon betaser, rDNA/Berlex Interferon gamma, rDNA Interleukin-1ra, rDNA Interleukin-11, rDNA Interleukin-2, rDNA/Chiron Keratinocyte growth factor, rDNA Somatropin, rDNA/ Somatropin antagonist, rDNA, PEG- T4 Endonuclease, rDNA, Liposomal TNF, rDNA tPA, rDNA/PDL Urokinase Plasminogen Activator, rDNA Слитые белки Interleukin-13–Pseudomonas toxin, rDNA Interleukin-2/diphtheria toxin, rDNA Вакцины Cholera Vaccine (rDNA)/SBL Staphylococcus vaccine (rDNA) Anthrax Vaccine, rDNA/VaxGen Lyme Vaccine, rDNA/Aventis Pertussis Toxoid, rDNA Пептиды Calcitonin, rDNA Glucagon, rDNA/Lilly Insulin, rDNA/Lilly Insulin glargine, rDNA Natriuretic peptide, rDNA Parathyroid hormone (1-34), rDNA Parathyroid hormone (1-84), rDNA Антитела и фрагменты антител Complement C5 Mab, rDNA Heat shock protein Mab Mab, rDNA TNF Mab Fab', rDNA, PEG- VEGF Mab Fab, rDNA

Дрожжи Pichia pastoris Относительно быстрый рост (3-5 дней от посева до окончания индукции) Высокий выход целевого белка (до 40 г/л) Очень низкая цена ростовой среды (глицерин, метанол, аммиак) Умеренная стоимость ферментации Возможна экспрессия крупных полипептидов (>50 кДа) Возможно гликозилирование Секреция белка в ростовую среду, низкий уровень секреции протеаз N-гликозилирование дает иммуногенные олигосахариды Не все белки эффективно секретируются Патентные ограничения на промышленное использование Преимущества Недостатки

P.pastoris – получение продуцента

P.pastoris – схема ферментации

P.pastoris – примеры использования Alfimeprase - Accfib; fibrolase (3-serine) (Agkistrodon contortrix recombinant) DX-88; ecallantide; kallikrein inhibitor protein, recombinant

Линия клеток CHO Пригодна для белков любого размера Любые пост-трансляционные модификации Не содержит трансмиссивных вирусов Существует сублиния DG44, дефектная по гену DHFR (легкая амплификация кассет) Большое время создания продуцента (до 1 года) Медленный рост ( промышленное культивирование до 200 дней) Требует соблюдения полной стерильности и защиты от заражения вирусами Некоторые ферментные системы пост-трансляционных модификаций имеют ограниченные возможности и требуют оверэкспрессии генов Ограниченный пролиферативный потенциал (до 25 пассажей) Дорогая культуральная среда Преимущества Недостатки

CHO – вариант системы экспресии Внехромосомная репликация вектора Индуцибельный промотор Специальный штамм Дополнительный остаток Met[-1] или лидерный пептид Блок стоп-кодонов

Methotrexate (MTX) Selection Gene of interest DHFR Transfect dfhr - cells Grow in Nucleoside Free medium Culture a Colony of cells Grow in 0.05 uM Mtx Culture a Colony of cells

Methotrexate (MTX) Selection Grow in 5.0 uM Mtx Grow in 0.25 uM Mtx Culture a Colony of cells Culture a Colony of cells Foreign gene expressed in high level in CHO cells

CHO – примеры использования Гормоны и цитокины Bone Morphogenic Protein-2, rDNA Bone Morphogenic Protein-7, rDNA EPO, rDNA/Amgen EPO, darb-, rDNA Corifollitropin alfa, rDNA FSH rDNA/Schering-Plough G-CSF, rDNA/Sanofi Luteinizing hormone, rDNA Interferon beta-1a, rDNA/Biogen Insulin-like Growth Factor-1/IGFBP-3, rDNA Thyroid stimulating hormone, rDNA hCG, rDNA Ферменты Arylsulfatase B, rDNA DNase, rDNA Galactosidase, beta rDNA Glucocerebrosidase, rDNA Glucosidase, rDNA Iduronidase, rDNA Антитела CD11a Mab, rDNA CD20 Mab, rDNA CD20 Mab, rDNA conc. CD20 Mab, rDNA/Y-90 & In-111 radioconj. CD52 Mab, rDNA EGF receptor Mab, human, rDNA/Amgen HER2 receptor Mab, rDNA Immunoglobulin E Mab, rDNA RANKL Mab, rDNA TNF Receptor-IgG Fc, rDNA VEGF Mab, rDNA CTLA4-Ig, rDNA LFA-3/IgG1, rDNA Система свертываемости крови Factor IX, rDNA/Wyeth Factor VIII, rDNA/Baxter Factor VIII BDD, rDNA, PFM tPA, rDNA/Genentech tPA, TNK-, rDNA Thrombin, rDNA

Иван И. Воробьев, лаборатория медицинской биотехнологии Гематологического научного центра РАМН, лаборатория биокатализа Института биоорганической химии РАН, Слайды можно скачать: lmbt.ru/lectures/kmb08.ppt