1 Учебно-научная лаборатория физико-химических методов исследования полимерных наносистем и биотехнологических продуктов(лаб. 4) гг.

2 Структура доклада Сведения о лаборатории. Разработка методов регулирования селективности сорбции биологически активных веществ на полимерных сорбентах. Разработка и исследование свойств функциональных растворимых и сшитых полимеров для создания эфферентных методов удаления токсических веществ из организма человека. Синтез и исследование биоспецифических полимеров с целью разработки методов форочистки культуральных жидкостей и нативных растворов антибиотиков. Разработка «down-stream» процессов получения высокоочищенных субстанций лекарственных веществ, соответствующих международным фармакопейным требованиям (антибиотиков, ферментов и т.д.). Исследование процессов образования и физико-химических свойств гибридных полимерных нанокомпозитов на основе наночастиц биогенных элементов. Разработка способов иммобилизации ферментов с использованием наночастиц биогенных элементов. Учебная работа.

3 1. Сведения о лаборатории

4 Профиль лаборатории Изучение равновесных, кинетических и динамических закономерностей взаимодействия сшитых и растворимых гидрофильных полимеров с биологически активными веществами. Разработка на основе синтетических и природных полимеров новых биотехнологических сорбентов и биомедицинских материалов. Разработка биотехнологических процессов получения высокоочищенных субстанций лекарственных веществ, методов связывания биологически активных веществ высокоселективными растворимыми и сшитыми полимерами, методов иммобилизации ферментов. Синтез нанокомпозитов биомедицинского назначения на основе водорастворимых полимеров и наночастиц биогенных элементов. Изучение процессов формирования и морфологических характеристик наноструктур методами молекулярной оптики и гидродинамики. Осуществление и координация учебной и учебно-методической деятельности базовой кафедры медицинской биотехнологии СПбГПУ при ИВС РАН.

5 Состав лаборатории Всего 10 человек, кандидатов наук -7,молодых сотрудников - 4

6 Список молодых сотрудников (до 33 лет) 1. Лещинская Анастасия Петровна, н.с.,к.т.н. 2. Гаркушина Ирина Сергеевна, н.с.,к.т.н 3. Ершов Дмитрий Юрьевич, м.н.с. 4. Сверлова Нелли Андреевна, м.н.с.

7 ГРАНТЫ И ПРОГАММЫ - Гранты РФФИ : (рук. О.А. Писарев) «Теория селективного разделения биологически активных молекул во фронтально-вытеснительной хроматографии на сшитых полимерных сорбентах» ; (рук. И.В. Полякова) «Молекулярный импринтинг –фундаментальные основы создания высокоселективных сорбентов со свойствами искусственных макромолекулярных рецепторов» ; (рук. О.А. Писарев) « Регулирование селективности сорбции в препаративной хроматографии биологически активных веществ на полимерных сорбентах» - Грант Президента РФ по поддержке ведущих научных школ: НШ – (2008 – 2009 гг.). «Биологически активные полимерные системы (рук. Е.Ф. Панарин) - ФЦП Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на гг « Создание нового поколения растворимых и сшитых биополимеров для биотехнологии и медицины» (рук. Е.Ф. Панарин) -Программа отделения химии и наук о материалах 7 «Разработка научных основ новых химических технологий с получением опытных партий веществ и материалов» «Разработка препаративных хроматографических методов получения гидролитических ферментов медицинского назначения из поджелудочной железы крупного рогатого скота». (2008, рук. О.А. Писарев) - Программа Президиума РАН по поддержке базовой кафедры медицинской биотехнологии ( гг.) - Гранты правительства Санкт-Петербурга для молодых ученых – кандидатов наук и аспирантов и студентов: 1.«Разработка новых подходов к выделению и очистке субстанций антибактериальных антибиотиков»( Гаркушина И.С., 2008); 2.«Разработка фундаментальных основ синтеза селективных биотехнологических сорбентов» (Гаркушина И.С., 2011) ; 3. «Разработка сорбционного метода лечения гиперурикемии и подагры» (Лещинская А.П., 2009) ; 4. «Разработка методов синтеза и изучение свойств полимерных сорбентов для селективной сорбции мочевой кислоты», (Лещинская А.П.,2012) ; «Изучение свойств полимерных сорбентов, селективно сорбируюших лизин», (Небогатикова И.Л., 2009) ; 5.«Равновесие и кинетика сорбции глюкозы на полимерных сорбентах» (Захарова М.А ) ; Программа «Умник».«Разработка сорбционного метода лечения гипеурикемии (Лещинская А.П., ).

8 Публикации 3 учебных пособия, 6 патентов, 2 обзора, 31 статья в рецензируемых журналах, 19 статей в научных сборниках, 82 тезиса российских и международных конференций

9 Подготовлено 2 кандидата наук (научн. руководитель Писарев О.А.): 1. Гаркушина Ирина Сергеевна (2010). «Сорбция эритромицина полимерными сорбентами». Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук. 2. Лещинская Анастасия Петровна (2011). «Молекулярно импринтированные сорбенты для селективной сорбции мочевой кислоты» Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук.

10 Студенты и аспиранты Подготовлено 9 магистров, 2 специалиста, 6 бакалавров 1. Гаркушина Ирина Сергеевна, аспирантка базовой кафедры медицинской биотехнологии СПбГПУ при ИВС РАН, ( ), защита кандидатской диссертации, в настоящее время н.с. лаб Лещинская Анастасия Петровна, аспирантка базовой кафедры медицинской биотехнологии СПбГПУ при ИВС РАН, ( ), ), защита кандидатской диссертации, в настоящее время н.с. лаб.4. 3.Сверлова Нелли Андреевна ( ), защита магистерской диссертации, в настоящее время м.н.с. лаб Филаретов Дмитрий Алексеевич, студент СПбГПУ, ( , защита бакалаврской работы и магистерской диссертации). 4. Вашунин Сергей Игоревич, студент СПбГПУ ( , защита бакалаврской работы и магистерской диссертации). 5. Федосеева Вера Сергеевна, студентка СПбГПУ ( , защита магистерской диссертации). 6. Лебедева Елена Сергеевна, студентка СПбГПУ ( , защита магистерской диссертации). 7. Щербакова Светлана Борисовна, студентка СПбГПУ ( , защита магистерской диссертации). 8. Небогатикова Ирина Леонидовна, студентка СПбГПУ ( , защита бакалаврской работы и магистерской диссертации). 9. Вилькевич Мария Валентиновна, студентка СПбГПУ ( , защита магистерской диссертации). 10. Захарова Маргарита Александровна, студентка СПбГПУ,( , защита бакалаврской работы и магистерской диссертации). 11. Мартюшева Татьяна Игоревна, студентка СПФХА, ( , диплом специалиста). 12. Прокудина Галина Петровна, студентка СПФХА, ( , диплом специалиста). 13. Титова Анна Викторовна, студентка СПбГПУ, (2010 по настоящее время, защита бакалаврской работы). 14. Чулков Евгений Борисович, студент СПбГПУ, ( , защита бакалаврской работы). 15. Годухина Екатерина Максимовна( , защита бакалаврской работы).

11 Сотрудничество Проводились совместные работы с: лаб. 2, аналитическим центром ИВС РАН, патентно- инфомационной лабораторией ИВС РАН; Всероссийским центром экстремальной медицины им. А.М. Никифорова ; Санкт-Петербургским Государственным Политехническим Университетом; Санкт-Петербургской Химико-Фармацевтической Академией; Центральным военно-клиническим госпиталем им. Бурденко; Санкт-Петербургской государственной медицинской академией им. И.И.Мечникова; Санкт-Петербургской Мариинской больницей; ЗАО «Самсон-Мед» (г. С.- Петербург), ОАО «Восток» (пос. Восточный).

12 ЗАСЛУГИ КОЛЛЕКТИВА Получена Золотая медаль Петербургской технической ярмарки 2012 года за лучший инновационный проект в области новых материалов. Молодые ученые (А.П. Лещинская, С.В Щербакова) становились лауреатами первой премии среди дипломантов –химиков России в секции «Химические науки, химическая технология, биотехнология, биоинженерия, химическое машиностроение». А.П. Лещинская награждена первой премией, а И.С. Гаркушина - второй премией для молодых ученых СПбГПУ. Небогатикова И.Л. – диплом первой степени Всероссийской межвузовской научной конференции студентов и аспирантов, проводимой в рамках 37 недели науки СПбГПУ. Захарова М.А. - лауреат конкурса Национального исследовательского университета «Санкт-Петербургский государственный университет политехнический университет» 2011 г. «Студент года по достижениям в НИР».

13 2. Разработка методов регулирования селективности сорбции биологически активных веществ на полимерных сорбентах

14

15 Сорбция рубомицина и дигидрорубомицина на карбоксильном катионите БДМ-12. рН 4, М ацетат аммония. СТАТИЧЕСКИЙ ЭФФЕКТ ОБРАЩЕНИЯ СЕЛЕКТИВНОСТИ СОРБЦИИ

16 Изотермы сорбции БАВ, сочетающие эффект распределения между неподвижной и подвижной фазами с ионообменным равновесием

17 17 Условия обострения границ концентрационных профилей в случае смешанных взаимодействий сорбент – сорбат и сорбат – сорбат

18 Режимы селективной сорбции 1. Разделяемые компоненты перемещаются по cорбционной колонке в равновесном динамическом режиме. Порядок выхода зон веществ не может измениться. Порядок выхода зон веществ не может измениться. Такой режим движения осуществляется при уменьшении скорости протекания Такой режим движения осуществляется при уменьшении скорости протекания подвижной фазы до некоторой границы. при при Разделение веществ осуществляется согласно их величинам коэффициентов распределения Разделение веществ осуществляется согласно их величинам коэффициентов распределения - равновесная константа селективности. - равновесная константа селективности. - кинетическая константа селективности. - кинетическая константа селективности. 18

19 Оптимизация селективной сорбции БАВ 1. Сорбция первого компонента происходит в равновесном режиме, а второго в неравновесном динамическом режиме. -необходимое условие инверсии селективности сорбции -необходимое условие инверсии селективности сорбции Достаточное условие инверсии селективности сорбции : Достаточное условие инверсии селективности сорбции : при при 2. Оба компонента сорбируются в неравновесных динамических режимах. Необходимое условие существования данного режима селективной сорбции : Необходимое условие существования данного режима селективной сорбции :припри - достаточное условие осуществления инверсии селективности - достаточное условие осуществления инверсии селективности Инверсия селективности сорбции в данном случае является следствием различия нерегулярных форм движения разделяемых компонентов. 3. Сорбция первого компонента происходит в нерегулярном, а второго в регулярном режиме. Тогда очевидно, что, и, следовательно, порядок выхода зон из колонки не может измениться ни при каких значениях ω.

20 Инверсия селективности разделения мелиттина (1) и фосфолипазы А(2) на карбоксильном катионите БДАМ-90-9 с увеличением скорости подачи подвижной фазы ω. Приведены величины относительных выходных объемов – Vi/V0 (кр.1,2) и дистанций между фронтами - V/V0 (кр.3). Параметры сорбции: Г1 =112; Г2 =142; Г1 =112; Г2 =142; Кинетически селективное разделение свиного инсулина (1) и проинсулина(2) на катионите БДМ- 12 Параметры сорбции: Г 1 =12.4; Г 2 =18.2; Г 1 =12.4; Г 2 =18.2; 20 Разделение мелиттина (1) и фосфолипазы А2 (2) на катионите БДАМ-90-9 Разделение трипсина(1) и химотрипсина(2) на катионите БДМ-12 Примеры оптимизации препаративных разделений БАВ с использованием эффекта кинетической селективности сорбции

21 Кинетические параметры сорбции доксорубицина, рассчитанные по бидисперсной модели. рН=3.5, R=0.01 см., I=0.1 М.

22 3. Разработка и исследование свойств функциональных растворимых и сшитых полимеров для создания эфферентных методов удаления токсических веществ из организма человека.(Отв. исп. – с.н.с., к.т.н. Полякова И.В., совм. с лаб. 2).

23 Этапы синтеза молекулярно импринтированных сорбентов образование предполимеризационного комплекса молекула - шаблон функциональные мономеры Полимеризация Удаление молекулярного шаблона из полимерной матрицы + Полимер, содержащий молекулярный отпечаток молекула - шаблон

24 Сорбция мочевой кислоты и других компонентов из сыворотки крови на контрольном (КП) и молекулярно импринтированном (МК-МИП-16) полимерах А, %

25 Термодинамические функции сорбции глюкозы на Гл-МИПах и КП, синтезированных на основе ДМЭГ

26 Строение эндотоксина 1. Липид А – дисахарид, содержащий глюкозамин и высокомолекулярные жирные кислоты, остатки фосфорной кислоты, является липофильной и гидрофобной частью молекулы ЛПС. 2. Центральный олигосахарид – центральная часть молекулы ЛПС, состоит из необычных сахаров: кетодезоксиоктулозоната и гептозы. 3. О-антиген (О-специфическая полисахаридная цепь) – представляет собой полисахаридные цепи, которые соединены с центральным олигосахаридом. Эта часть ЛПС экспонирована в окружающую среду. Этот участок молекулы придает ей гидрофильные свойства, благодаря которым ЛПС хорошо растворимы в воде. Концентрация эндотоксина в крови: Сепсис – (25-700) нг/мл 0.14 % Тяжелый сепсис –( ) нг/мл 32 % Септический шок – >10000 нг/мл 94%

27 Изотермы сорбции эндотоксина на контрольном и функционализированных сополимерах ГМА и ДМЭГ

28 3. Синтез и исследование биоспецифических полимеров с целью разработки методов форочистки культуральных жидкостей и нативных растворов антибиотиков. Разработка «down-stream» процессов получения высокоочищенных субстанций лекарственных веществ, соответствующих международным фармакопейным требованиям (Отв. исп.- с.н.с., к.х.н. Ежова Н.М.)

29 Стратегия разработки метода выделения и очистки лекарственной субстанции Исходные дисперсные системы Культуральная жидкость – дисперсная система с «твердой» фазой – продуцентом БАВ Суспензия в экстрагенте – дисперсная система с «твердой» фазой – измельченным органом Отделение «твердой» фазы Нативный раствор, первичный экстракт Первичное выделение (концентрирование) Концентрат Очистка Полупродукт, сырец Окончательная (тонкая) очистка Целевой продукт Концентрация, г/лЧистота, % , , , , ,0 -10,

30 Осаждение примесных белков из нативного раствора противоопухолевого антибиотика рубомицина (S.coeruleorubidus штамм 2679)

31 Сорбция протеазы из нативного раствора штамма Coprinus rimosus.рН 3,75. ВЭЖХ нативного раствора штамма Coprinus Подвижная фаза: метанол + вода. Градиентное элюирование от 20% до 50% метанола Элюент Протеолитическая активность.ед/мг 5% Этанол0 15% Этанол1,5 30% этанол7,47,4 40% Этанол0 Табл. Активность протеазы во фракциях. Табл. Физико-химические свойства полимерного сорбента БДМ-12. СорбентpK α nПОЕ по Na +, мг-экв/г К наб в Н- форме ρ, г/см 3 БДМ-126,61,736,64,80,71

32 Условия десорбции эритромицина с сополимеров МАК-ДМЭГ (БДМ) Технологическая схема выделения эритромицина из культуральной жидкости Saccharopolyspora erythtreus

33 Влияние рН и ионной силы на сорбцию лизина импринтированным и контрольным полимером

34 4. Исследование процессов образования и физико-химических свойств гибридных полимерных нанокомпозитов на основе наночастиц биогенных элементов. Разработка способов иммобилизации ферментов с использованием наночастиц биогенных элементов.(Отв. исп.-с.н.с., к.ф.-м. н. Киппер А.И., н.с. Боровикова Л.Н.).

35 Уравнения реакций получения нанокомплексов селена Синтез нанокомпозитов селена с химотрипсином (ХТ) осуществлялся в ходе реакции восстановления селенистой кислоты аскорбиновой кислотой в водной среде при рН=2,8–3,5, Т=293 0 К. В результате реакции в отсутствии ХТ происходило образование золя нуль-валентного красного аморфного селена и дегидроаскорбиновой кислоты. Золь был не устойчив в растворе и выпадал в осадок через ~ 24 часа. Введение в реакцию одновременно с другими компонентами ХТ приводило к получению стабильных растворов красновато - оранжевого цвета. После синтеза в присутствие ХТ наночастицы селена сохраняли стабильное состояние в растворе в течение 6 месяцев.

36 Образцы исследуемых растворов.

37 Влияние соотношения селен –химотрипсин на агрегативную стабильность нанокомплексов при различных рН. C XT = 0.01вес.%; ν = C Se /C ХТ Стабильные в растворе нанокомплексы наблюдались в кислой области ( ) и при щелочных значениях рН ( ). В интервале от до наблюдалось полное фазовое разделение системы. Интервалы областей фазового разделения системы не зависели от концентрации селена в растворе и лишь при высоких концентрациях (при ν =8 и ν =10) появлялась еще одна область полного фазового разделения при сильно щелочных значениях рН.

38 Влияние концентрации белка – стабилизатора на агрегативную стабильность нанокомплексов при различных рН. С Se = 0.01%, С ХТ =0,01, 0,05, 0,1% Увеличение концентрации белка- стабилизатора расширяло интервалы стабильного состояния наносистемы при изменении рН среды. Электростерический характер стабилизации

39 Протеолитическая активность нанокомплексов Зависимость протеолитической активности нанокомплексов от рН среды. 1 – ХТ, 2 – ν = 1, 3 – ν = 10. ν = C Se /C ХТ

40 5. УЧЕБНАЯ РАБОТА

41 Разработана магистерская программа «Физико-химические основы создания новых материалов и технологий в медицине и биотехнологии». Эта программа носит авторский характер и отражает научно-педагогическую школу, существующую в ИВС РАН.

42 Краткая аннотация магистерской программы «Физико-химические основы создания новых материалов и технологий в медицине и биотехнологии» Основы химии высокомолекулярных соединений. Медицинское материаловедение. Природные и синтетические материалы для медицины, фармации и биотехнологии. Теоретические и прикладные проблемы получения полимерных биомедицинских материалов. Химические и физические основы создания биосовместимых материалов. Физические методы исследования биотехнологических продуктов. Физическая химия разделительных процессов, применяемых в биотехнологии и медицине. Особенности культивирования микророрганизмов, животных и растительных клеток. Иммобилизованные системы в биотехнологии и медицине. Физико-химические основы технологий получения аминокислот, антибиотиков, ферментов, вакцин, диагностических препаратов.

43 Создан учебно-методический комплекс (УМК) магистерской специальности кафедры. С 2010 года базовая кафедра медицинской биотехнологии СПбГПУ при ИВС РАН является выпускающей кафедрой по магистерской специальности «Физико- химические основы создания новых материалов и технологий в биотехнологии и медицине».

44 Учебные пособия 1. Писарев О.А., Полякова И.В. «Фракционирование биологически активных веществ». Часть 1: Аналитические методы Санкт-Петербург. Из-во Политехнического Университета с. 2. Писарев О.А, Полякова И.В.«Фракционирование биологически активных веществ».Часть 2: Препаративные методы Санкт-Петербург. Из-во Политехнического Университета с. 3. Ганин П.Г., Писарев О.А. Физико-химические основы культивирования микроорганизмов и выделения целевых продуктов биосинтеза. Санкт-Петербург, Из-во Политехнического Университета с.

45 Преподавательствая деятельность, руководство бакалаврами и магистрами 1. Писарев О. А. Зам. зав. базовой кафедрой медицинской биотехнологии СПбГПУ. Курс:«Медицинская биотехнология» - (магистры, 34 часа); Курс:«Фракционирование биологически активных веществ» - (магистры, 34 часа); Руководство аспирантами и магистрами кафедры. 2. Полякова И. В. Участие в разработке образовательных стандартов 3 поколения, написании учебных пособий, руководство бакалаврами и магистрами СПбГПУ, дипломантами СПФХА 3. Киппер А. И. Курс: «Экспериментальные методы исследования биологически активных веществ»- (магистры, 34 часа), руководство бакалаврами и магистрами СПбГПУ, дипломантами СПФХА 4. Ежова Н.М, руководство бакалаврами и магистрами СПбГПУ, дипломантами СПФХА. 5. Боровикова Л.Н., руководство бакалаврами и магистрами СПбГПУ. 6. Ершов Д.Ю., руководство бакалаврами и магистрами СПбГПУ.

46 Спасибо за внимание!