Мутации в мтДНК. Митохондриальные заболевания. Зиновкин Роман,

Мутации в мтДНК СоматическиеГенеративные 2

Митохондриальная ДНК (мтДНК) В мтДНК 37 генов В каждой клетке содержится от 100 до 3000 молекул мтДНК 3

Типы повреждений мтДНК Точечные замены Делеции/инсерции Нарушения кольцевой структуры

Причины повреждения мтДНК. Ошибки репликации/репарации Действие мутагенов и окислительного стресса. Порочный круг? 5

Точечные мутации в мтДНК Известно около 270 точечных мутаций в мтДНК, затрагивающих каждый из генов. ~60% патогенных мутаций локализованы в тРНК, хотя эти гены занимают лишь 10% мт генома. 6

Методы детекции точечных мутаций в мтДНК ПЦР – клонирование – секвенирование Прямое клонирование – секвенирование Полиморфизм сайтов рестрикции «Глубокое» секвенирование «Ультраглубокое» секвенирование 7

Самая распространенная делеция common deletion (Δ-mtDNA) затрагивает треть мт генома. Возможная причина появления такой мутации – гомологичная рекомбинация через фланкирующие прямые повторы 13 нт 8

Гетероплазмия мтДНК В одной клетке могут одновременно присутствовать разные молекулы мтДНК – гетероплазмия. Дисфункция возникает при превышении определенного порога содержания мутантной мтДНК. 9

Пациенты с гетероплазмией часто имеют разный уровень содержания мутантной ДНК в разных органах и даже в клетках одного органа. Величина порога варьирует у разных заболеваний. В среднем заболевание проявляется, когда: 50-70% мтДНК несет делецию Более 90% тРНК несет мутацию 10

PMID: Effect of the amount of mtDNA4696 on COX activity. Cy4696 cybrids possessing various proportions of mtDNA4696 were used for biochemical analysis of COX activity. 11

Митохондриальные заболевания (МЗ) Причина мт дисфункций – мутации в ядерной и митохондриальной ДНК (наиболее частая причина: наследственные точечные мутации в мтДНК); Частота встречаемости 1 к 5000 (но патогенные варианты мтДНК обнаруживаются у 0,5% популяции); Проявляются в любом возрасте; Разнообразные симптомы; Плохо поддаются лечению. 12

Генетика МЗ (мтДНК) 1. Материнское наследование (90% наследственная оптическая нейропатия Лебера (НЛ)): женщина передает мутацию всем потомкам. 13

Генетика МЗ (мтДНК, гетероплазмия) 2. Материнское наследование (10% нейропатий Лебера): вероятность передачи мутации потомкам неизвестна. 14

Мутации в ядерной ДНК также могут приводить к МЗ ~ белков, работающих в митохондриях, закодированы в ядерном геноме (яДНК) 15

Генетика МЗ (яДНК) 3. Аутосомно-доминантное наследование (доминантная оптическая атрофия): мужчины и женщины имеют 50% шанс передачи мутации каждому из детей. 16

Генетика МЗ (яДНК) 4. Аутосомно-рецессивное наследование (например, атаксия Фридрейха): каждая мутантная аллель родителей имеет 50% шанс передачи следующему поколению, однако болезнь развивается только при наличии обоих аллелей. 17

Hum Mol Genet.Hum Mol Genet Oct 16. Universal heteroplasmy of human mitochondrial DNA. Payne BAPayne BA, Wilson IJ, Yu-Wai-Man P, Coxhead J, Deehan D, Horvath R, Taylor RW, Samuels DC, Santibanez-Koref M, Chinnery PF.Wilson IJYu-Wai-Man PCoxhead JDeehan DHorvath RTaylor RWSamuels DC Santibanez-Koref MChinnery PF Wellcome Trust Centre for Mitochondrial Research, Institute of Genetic Medicine, Newcastle University, Newcastle-upon-Tyne, NE1 3BZ, UK. Abstract Mammalian cells contain thousands of copies of mitochondrial DNA (mtDNA). At birth, these are thought to be identical in most humans. Here we use long read length ultra- deep re-sequencing-by-synthesis to interrogate regions of the mtDNA genome from related and unrelated individuals at unprecedented resolution. We show that very low- level heteroplasmic variance is present in all tested healthy individuals, and is likely to be due to both inherited and somatic single base substitutions. Using this approach, we demonstrate an increase in mtDNA mutations in the skeletal muscle of patients with a proof-reading deficient mtDNA polymerase γ due to POLG mutations. In contrast, we show that OPA1 mutations, which indirectly affect mtDNA maintenance, do not increase point mutation load. The demonstration of universal mtDNA heteroplasmy has fundamental implications for our understanding of mtDNA inheritance and evolution. Ostensibly de novo somatic mtDNA mutations, seen in mtDNA maintenance disorders, neurodegenerative disease and aging, will partly be due to the clonal expansion of low- level inherited variants. 18

«Узкое место» или «бутылочное горлышко» (bottleneck) мтДНК 19 During the production of primary oocytes, a selected number of mitochondrial DNA (mtDNA) molecules are transferred into each oocyte. Oocyte maturation is associated with the rapid replication of this mtDNA population. This restriction- amplification event can lead to a random shift of mtDNA mutational load between generations and is responsible for the variable levels of mutated mtDNA observed in affected offspring from mothers with pathogenic mtDNA mutations. Mitochondria with mutated mtDNA are red, those with normal mtDNA are green. doi: /nrg1606

PMID:

Возможные механизмы mt bottleneck 21

Science 15 February 2008: Vol. 319 no pp

Эволюционное значение mt bottleneck 23 На первый взгляд, это патогенетический процесс, приводящий к развитию МЗ. Но без него любая мутация, появившаяся в мтДНК, не могла бы исчезнуть, что привело бы к накоплению разнообразных мутаций, в т.ч. деструктивно влияющих на функции митохондрий, и, в конечном счете, к исчезновению вида.

Классификация МЗ Известно два десятка МЗ. Классификация затруднена тем, что одна и та же мутация может иметь разнообразные клинические проявления. Это происходит из-за разного генетического бэкграунда, гетероплазмии, накоплении ошибок мтДНК в процессе репликации, тканеспецифичности порогового уровня, а также различных негенетических факторов. 24

Тканеспецифичность МЗ Гл. образом поражаются нервные и мышечные ткани. Почему? –Высокий уровень метаболизма => низкий порог гетероплазмии; –Постмитотические ткани: клетки практически не делятся митозом, в них накапливаются дефектные митохондрии с дефектной мтДНК; 25

Симптоматика МЗ Малый рост и задержка в развитии; Снижена мышечная координация; Неврологические симптомы, припадки; Аутизм; Нарушения зрения и слуха; Заболевания сердца, печени или почек; Нарушения ЖКТ; Диабет; Повышенный риск инфекций; Нейрофизиологические изменения (дезориентация, нарушение памяти). 26

27 doi: /nature11707

Синдром Кирнса-Сейра Kearns-Sayre syndrome (KSS) Ранняя офтальмоплегия 1g/L, мозжечковая атаксия, блокада сердца. Генетика KSS: делеции и дупликации мтДНК 28

Хроническая прогрессирующая наружная офтальмоплегия. Chronic progressive external ophthalmoplegia (CPEO) Наружная офтальмоплегия; Двусторонний птоз Генетика CPEO: Точечные мутации ряда ядерных генов (POLG, Twinkle, ANT) Зачастую имеются вторичные мутации в мтДНК 29

Митохондриальная энцефалопатия с лактоацидозом и инсультоподобными эпизодами; mitochondrial encephalomyopathy with lactic acidosis and stroke-like episodes (MELAS) Инсультоподобные припадки

Разорванные красные нити Поперечно-полосатые скелетные мышцы аккумулируют аномальные увеличенные митохондрии, содержащие упорядоченные включения. Это сопровождается ишемией или аноксией мышц. Эти аггрегаты митохондрий проявляются при окраске по Гомори (Gomori modified Trichrome). 31

Миоклоническая эпилепсия; myoclonic epilepsy with ragged-red fibers (MERRF) Миоклония Мозжечковая атаксия Миопатия Припадки и/или деменция; «Разорванные красные нити». Генетика MERRF: Точечные мутации в мтДНК 32

Наследственная оптическая невропатия Лебера; Lebers hereditary optic neuropathy (LHON) Резкая потеря зрения, как правило в детстве; Происходит апоптоз фоточувствительных нервных клеток (АФК, апоптоз). Генетика LHON: Точечные мутации в мтДНК: 3460 G>A, G>A и T>C. 33

Значение генетической диагностики нейропатии Лебера 90% LHON обусловлены одной из трех точечных мутаций в мтДНК, затрагивающих ЭТЦ. Клинический фенотип неотличим, однако диагностика необходима для оценки вероятности спонтанного восстановления зрения. Мутация имеет 37–71% шанс восстановления, – только 4%. Исследования носителей мутаций LHON в Европе показали, что у курящих пенетрантность составляет 93%, у некурящих – 66%. PMID: ; ; ; ; ; ;

Mitochondrion, Vol. 10, Issue 3, April 2010, Pages 300–308 35

МУТАЦИИ В ГЕНЕ ГАММА-ПОЛИМЕРАЗЫ (POLG) Красные – мутации, приводящие к хронической прогрессирующей офтальмоплегии. Синие – мутации, приводящие к другим заболеваниям (атаксия, в т.ч. Фридрейха, синдром Ли, заболевание зубов Шарко-Мари и другие.) tools.niehs.nih.gov/polg 36

Диагностика МЗ 1. Клинические исследования 2. Лабораторные исследования –Исследование крови; –ЭКГ; –МРТ, ПЭТ, КТ; –Биопсия скелетной мышцы; –Генетические анализы. 37

Генетическая диагностика МЗ 1.Анализ мтДНК => поиск точечных мутаций и делеций. Проводится на любой ткани, содержащий митохондрии, предпочтительнее использовать постмитотические ткани (скелетные мышцы). –ПЦР – поиск определенных точечных мутаций –Секвенирование мтДНК (полное или частичное) Для некоторых МЗ характерно наличие вторичных мутаций в мтДНК. 38

Генетическая диагностика МЗ 2.Секвенирование яДНК. Любая ткань. –Секвенирование отдельных генов –Секвенирование кодирующих участков (экзома) –Полногеномное секвенирование. 39

Генетическая диагностика МЗ Атаксия Фридрейха в 95% случаев обусловлена мутациями некодирующей области гена фратаксина. Наследственная доминантная оптическая атрофия в 70-90% случаев обусловлена мутациями в гене OPA1, тогда как спонтанная форма оптической атрофии – только 50% мутаций в OPA1. Хроническая прогрессирующая наружная офтальмоплегия характеризуется мутациями в ряде генов, чьи белки участвуют в репликации мтДНК. Рекомендуется полногеномная диагностика. 40

Лечение МЗ В основном симптоматическое Переносчики электронов в ЭТЦ митохондрий / тушители свободных радикалов –Idebenone – нейропатия Лебера (PMID: ; ). 41

Лечение МЗ: перспективы Индукция биогенеза митохондрий (эстроген?) Генная терапия Митохондриально-адресованные соединения 42

Соматические мутации в мтДНК Присутствуют в соматических клетках Их количество положительно коррелирует с возрастом. 43

Соматические мутации в мтДНК, типичные для стареющего организма Annu. Rev. Biochem :683–706 44

J Clin Invest Nov;112(9): Mitochondrial DNA mutations in human colonic crypt stem cells. PMID: Immunohistochemistry cytochrome c oxidase (COX; complex IV of the respiratory chain), contains both mtDNA- and nuclear DNA (nDNA)-encoded subunits; and succinate dehydrogenase (SDH; complex II of the respiratory chain), which contains only nDNA- encoded subunits.

Bua… Aiken Am. J. Hum. Genet. 2006;79:469–480 Делеции в мтДНК вызывают дефекты в цитохромоксидазной активности в мышечных волокнах COX- COX+ 46

From: Wanagat, … Aiken, FASEB J. 15:322 (2001) degeneration of the whole fiber Мутации мтДНК могут быть причиной саркопении. A respiratory-deficient fiber in human muscle Deletion occurrs Deletion expands 47

COX (+) cellsCOX (-) cells Fraction of deleted DNA per cell (as measured by smPCR) ~3,000 PCRs p

Клональная экспансия делетированных мтДНК 49 PMID:

Клональная экспансия 50

51

Hum Mol Genet.Hum Mol Genet Oct 16. Universal heteroplasmy of human mitochondrial DNA. Payne BA, Wilson IJ, Yu-Wai-Man P, Coxhead J, Deehan D, Horvath R, Taylor RW, Samuels DC, Santibanez-Koref M, Chinnery PF. Payne BAWilson IJYu-Wai-Man PCoxhead JDeehan DHorvath RTaylor RW Samuels DCSantibanez-Koref MChinnery PF We compared 13 pairs of samples from 12 maternal first-degree. To determine the background level of similarity between unrelated individuals, we compared the same tissue between 79 different random pairs of unrelated subjects. 59/485 variants were common in unrelated subjects (12%). By contrast, when the analysis was restricted to first-degree maternal relatives, 25/63 variants were shared (40%, p < 0.001) The data clearly show that a large proportion appear to be inherited at very low heteroplasmy levels. 52

53

Выводы С возрастом происходит накопление de novo мутаций в мтДНК, но, скорее всего, % дефектных мтДНК не достигает критического уровня Имеет место клональная экспансия ранее существующих вариантов. 54

Nature 429, (27 May 2004) Premature ageing in mice expressing defective mitochondrial DNA polymerase Aleksandra Trifunovic, Anna Wredenberg, Maria Falkenberg, Johannes N. Spelbrink, Anja T. Rovio, Carl E. Bruder, Mohammad Bohlooly-Y, Sebastian Gidlöf, Anders Oldfors, Rolf Wibom, Jan Törnell, Howard T. Jacobs & Nils-Göran Larsson Department of Medical Nutrition, Karolinska Institutet, Novum, Karolinska University Hospital, S Stockholm, Sweden Correspondence to: Nils-Göran Larsson 55

Трансгенные мыши с мутацией в митохондриальной ДНК полимеразе γ (POLG) Такие мыши (POLG D257A) преждевременно стареют и умирают. С возрастом накапливают множество мутаций в мтДНК. 56 PMID:

Уровень мутаций мтДНК у POLG мышей Метод: ПЦР – клонирование – секвенирование. mtDNA mutation loads in mtDNA-mutator (mut/mut; red bars), heterozygous POLG mut (+/mut; grey bars) and wild-type (+/+; blue bars) mice. PMID:

Уровень мутаций мтДНК у POLG мышей Метод: Полиморфизм сайтов рестрикции. PMID:

Уровень мутаций мтДНК у POLG мышей Nucleic Acids Res Apr;37(7): Mice expressing an error-prone DNA polymerase in mitochondria display elevated replication pausing and chromosomal breakage at fragile sites of mitochondrial DNA. Bailey LJ, Cluett TJ, Reyes A, Prolla TA, Poulton J, Leeuwenburgh C, Holt IJ. Abstract Expression of a proof-reading deficient form of mitochondrial DNA (mtDNA) polymerase gamma, POLG, causes early death accompanied by features of premature ageing in mouse. However, the mechanism of cellular senescence remains unresolved. In addition to high levels of point mutations of mtDNA, the POLG mutator mouse harbours linear mtDNAs. Using one- and two-dimensional agarose gel electrophoresis, we show that the linear mtDNAs derive from replication intermediates and are indicative of replication pausing and chromosomal breakage at the accompanying fragile sites. Replication fork arrest is not random but occurs at specific sites close to two cis-elements known as O H and O L. Pausing at these sites may be enhanced in the case of exonuclease-deficient POLG owing to delayed resumption of DNA replication, or replisome instability. In either case, the mtDNA replication cycle is perturbed and this might explain the progeroid features of the POLG mutator mouse. PMID:

Уровень мутаций мтДНК у POLG мышей PMID: Метод: Ультраглубокое секвенирование мтДНК (ткань печени). Figure 2. Corrected mutational frequencies viewed in the UCSC genome browser. The scale ranges from low mutation frequencies (light colors) to high mutation frequencies (black). (Abbreviations: wt B6 = C57Bl/6N animal, wt mut = wildtype sibling of the mtDNA mutator mouse, Hz = heterozygous sibling of the mtDNA mutator mouse, Mut = mtDNA mutator mouse, 30w & 40w = 30 and 40 weeks of age, respectively).

Уровень мутаций мтДНК у POLG мышей PMID: Метод: Ультраглубокое секвенирование мтДНК (ткань печени).

Типы мутаций у POLG мышей Точечные мутации в мтДНК Линейные молекулы мтДНК с большой делецией (11кБ), ~30% всех молекул Кольцевые молекулы мтДНК с делециями (их мало) 62

Митохондриально-направленный антиоксидант SkQ1 увеличивает продолжительность жизни мышей с мутантной мтДНК ПОЛ 63

Другие эффекты SkQ1 на мутантных мышей Увеличение физической активности; Снижение вероятности развития кифоза; Предотвращение облысения; Сохранение эстральных циклов Предотвращение потери веса; Увеличение метаболической активности митохондрий. 64

SkQ1 предотвращает вызванное OH. окисление кардиолипина M. Vysokikh

Окисление кардиолипина приводит к апоптозу клеток 66

Выводы Прогероидный фенотип POLG-мутаторных мышей обусловлен большим количеством мутаций в мтДНК Высокий уровень мутаций в мтДНК у гетерозигот POLG-мутаторных мышей не влияет на продолжительность жизни, что может свидетельствовать о небольшом вкладе мутаций в мтДНК в процесс старения Использование митохондриально- направленных соединений перспективно для лечения МЗ и прогерии. 67