Программно - аппаратный комплекс оценки индивидуальной радиочувствительности онкологических больных с использованием метода «комет» 1 1 Институт проблем управления им. В.А. Трапезникова РАН, Москва 2 ФГУ «Российский научный центр рентгенорадиологии Росмедтехнологий», Москва Г.М. Попова 1, Ю.О. Дружинин 1, В.Н. Степанов 1, И.Ф. Дятчина 1 Г.П. Снигирёва 2, А.Н. Богомазова 2, Е.И. Новикова 2, Н.Н. Новицкая 2

Проблема: При лучевой терапии злокачественных новообразований трудно подвести к опухоли дозу, обладающую терапевтическим эффектом, без облучения близлежащих органов и тканей. Поэтому, кроме подавления роста и разрушения опухоли, лучевая терапия вызывает временные, а иногда и стойкие функциональные или органические нарушения в различных органах и тканях. Возникновение и степень этих изменений зависят, как от дозы ионизирующего излучения и используемых методик лучевой терапии, так и от индивидуальной радиочувствительности пациентов. Цель: Исследование индивидуальной радиочувствительности онкологических больных, проходящих курс лучевой терапии, с целью определения возможности прогноза возникновения риска осложнений при проведении лучевой терапии; это позволит обеспечить своевременную профилактику и лечение пациентов с высоким риском осложнений.

В широкой клинической практике до настоящего времени не используются радиобиологические методы оценки индивидуальной радиочувствительности, позволяющие выделять пациентов с высоким риском постлучевых повреждений. Результаты исследований последнего десятилетия позволяют считать, что одним из таких методов может оказаться тест на индивидуальную радиочувствительность лимфоцитов in vitro, по которому возможно судить о возникновении негативных последствий в нормальных тканях пациента. Одним из наиболее перспективных методов оценки клеточной реакции на облучение является метод «комет», позволяющий регистрировать радиационные повреждения молекул ДНК.

Метод «комет» Принцип метода заключается в проведении электрофореза в микрогелях для детекции повреждений ДНК в отдельных клетках. Принцип метода заключается в проведении электрофореза в микрогелях для детекции повреждений ДНК в отдельных клетках. Клетки в агарозном геле, нанесенном на предметное стекло, лизируют в солевом растворе, содержащем детергент, после чего клеточная ДНК подвергается электрофорезу в буфере с определенным значением рН. Миграция ДНК к аноду тем больше, чем больше разрывов содержит ДНК. Клетки в агарозном геле, нанесенном на предметное стекло, лизируют в солевом растворе, содержащем детергент, после чего клеточная ДНК подвергается электрофорезу в буфере с определенным значением рН. Миграция ДНК к аноду тем больше, чем больше разрывов содержит ДНК. После окрашивания препаратов флуоресцентным красителем проводят микроскопическую морфометрию кометообразных структур. После окрашивания препаратов флуоресцентным красителем проводят микроскопическую морфометрию кометообразных структур. Метод «комет» (single cell gel electrophoresis or 'Comet assay) является быстрым и чувствительным методом для изучения повреждений ДНК и их репарации на уровне индивидуальной клетки.

; - высокая чувствительность к радиоиндуцированным повреждениям ДНК (< 5 бэр); - экономичность, простота, скорость анализа. - оценка повреждения ДНК на уровне одиночной клетки, что позволяет учитывать гетерогенность клеточной популяции, а также производить более тонкую статистическую обработку результатов; - возможность «настройки» метода для учёта конкретного вида повреждений ДНК; - высокая чувствительность к радиоиндуцированным повреждениям ДНК (< 5 бэр); - экономичность, простота, скорость анализа. сложность морфологического анализа «комет» и их параметрической оценки; - сложность морфологического анализа «комет» и их параметрической оценки; вариабельность результатов исследования, связанная с технической подготовкой препаратов и анализом изображений. - вариабельность результатов исследования, связанная с технической подготовкой препаратов и анализом изображений. Преимущества метода «комет»: Трудности метода «комет»:

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ Разработать аппаратно – программные средства, позволяющие автоматизировать процесс микроскопической морфометрии «комет». Тестировать «программу – анализатор» при исследовании крови пациентов онкологической клиники. Провести оценку индивидуальной радиочувствительности онкологических больных на основе изучения репарационной способности клеток крови с использованием метода «комет»; сопоставить полученные результаты с клиническими реакциями здоровых тканей на лучевую терапию.

КА позволяет вводить изображения в компьютер с мед. препаратов, установленных на микроскопе с цифровой камерой. Специализированные программные средства системы ориентированы на автоматизацию процессов анализа разнотипных изображений объектов. Анализ включает в себя обработку (фильтрацию, сегментацию, выделение внешнего контура объекта и всех внутренних их частей), морфометрию изображений, численные значения параметров которых используются для классификации, распознавания, т.е. для оценки состояния препарата и многое другое. КА позволяет объективизировать исследования, вести дифференцированный счёт микрообъектов при большом объёме выборки и получать принципиально новую, количественную информацию при диагностике препаратов. КА позволяет объективизировать исследования, вести дифференцированный счёт микрообъектов при большом объёме выборки и получать принципиально новую, количественную информацию при диагностике препаратов.

: Программа-анализатор Разработана программа для анализа изображений «комет», позволяющая автоматически: анализировать и выделять «кометы»; оценивать морфометрические параметры изображений «комет»: TD (кол-во ДНК в хвосте), TL (длина хвоста), TM (хвостовой момент td х tl); экспортировать результаты измерений в таблицы MS Excel и проводить первые этапы статистической обработки. Анализ комет включает: фильтр размытия по Гауссу с большим R (Rопт = 1/10 r средней кометы); сегментация по гистограмме яркости с автоматическим определением порога (возможна коррекция его пользователем); автоматическое определение центра головы кометы и точки определения начала хвоста (возможна коррекция центра головы кометы пользователем).

Для эффективности анализа изображений «комет» Разработан программный модуль поддержки камер стандарта PVCAM для прямого захвата изображения, что позволяет избежать сохранение и накопление изображений комет для последующей их обработки. Добавлен программный модуль управления предметным столиком, позволивший проводить сканирование с визуализацией и запоминанием движения по предметному стеклу, например, с шагом перемещения, равным полю видимости микроскопа, что исключило повторные захваты и ускорило процесс сканирования. Предусмотрены программные средства изменения масштаба просмотра изображения комет, для проверки правильности центровки головки кометы. Результаты этих усовершенствований повысили скорость анализа препаратов «комет» и создали большие удобства (что не менее важно) для проведения морфометрического анализа.

Внешний вид окна программы-анализатора "комет" в процессе работы Морфометрический анализ «комет» выполняется автоматически за 3 шага: - захват всех изображений «комет» поля видимости микроскопа; - вычисление параметров «комет»; - сохранение результатов анализа с элементами статистической обработки.

Схема исследования репаративной способности лейкоцитов Забор крови до проведения лучевой терапии; Облучение цельной крови при 4 о С в дозе 5 Гр; Приготовление микрогелевых препаратов после 0, 10, 20, 40 и 60 мин. инкубации облученных образцов крови при 37 о С; Проведение анализа (электрофорез препаратов); Микроскопический анализ препаратов и морфометрия изображений кометообразных структур. Основной измеряемый показатель - TD (процент ДНК в хвосте).

Обследованные группы: 22 пациентки с злокачественными опухолями органов малого таза, у 15 из которых после лучевой терапии зарегистрирована ранняя лучевая реакция - энтероколит. 18 пациенток с раком молочной железы, у 11 из которых проявились различные лучевые реакции после лучевой терапии.

Группа больных без повреждения нормальных тканей характеризуется более высокой скоростью репарации.

У пациенток с лучевыми реакциями наблюдается более низкая скорость репарации.

Заключение Создан удобный инструмент для анализа изображений «комет», который позволил повысить скорость получения результатов, их надежность и достоверность. Метод был апробирован при обследовании пациентов, проходящих курс радиотерапии в Российском научном центре рентгенорадиологии.. Проанализирована связь между клиническими осложнениями у онкологических больных, проходящих курс лучевой терапии, и показателями, характеризующими радиочувствительность клетки.

БЛАГОДАРИМ ЗА ВНИМАНИЕ !