Очень полезная книга для всех, кто интересуется геномикой и ее разнообразными применениями в медицине

Геномика – раздел генетики, посвященный изучению целых геномов живых организмов. Геном – полная совокупность генетического материала в гаплоидном наборе. Обычно выделяют ядерный, органелльный (пластидный или митохондриальный), плазмидный (у бактерий) геномы.

СТРУКТУРНАЯ 1. Нуклеотидная последовательность генома. 2. Состав генома. 3. Структура генов: - домены; - регуляторные элементы; - семейства генов (паралоги). 4. Компьютерный анализ белков – эволюционная геномика. ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ 1. «Обратная генетика» (анализ фенотипов мутантов). 2. Экспрессия генов: - гибридизация нуклеиновых кислот; - репортерные конструкции; - взаимодействие белков. 3. Координация экспрессии генов - метод микрочипов (microarray-анализ); - РНК-интерференция. ГЕНОМИКА

Геномика имеет огромное как теоретическое, так и прикладное значение для селекции, биотехнологии, фармакологии и других областей. Но особенно большое применение она находит в медицине.

Размеры геномов разных организмов

Бактерия Размер (м.п.н.) Число генов МИКОПЛАЗМА ХЛАМИДИЯ РИККЕТСИЯ ХЕЛИКОБАКТЕР ТЕРМОФИЛЬНАЯ ПАЛОЧКА БАЦИЛЛА (B. subtilis ) КИШЕЧНАЯ ПАЛОЧКА К 2003 г. определена полная нуклеотидная последовательность геномов более 60 видов и штаммов бактерий и археобактерий (включая стафилококк, псевдомонаду, метанококк и др.) ГЕНОМЫ БАКТЕРИЙ

Геномы эукариот Организм Размер генома (м.п.н.) Предполагаемое количество генов Дрожжи Saccharomyces cerevesae Нематода Caenorhabditis elegans Дрозофила Растение Arabidopsis thaliana Человек

У бактерий на один ген приходиться примерно одна 1000 п.н., и гены в хромосоме упакованы плотно, межгенные промежутки по длине незначительны. У высших эукариот, помимо того, что значительная часть ДНК занята различными повторяющимися последовательностями, межгенные пространства значительны (тысячи п.н.), а в самих генах основная часть ДНК приходиться на долю интронов. Так первичный транскрипт гена миодистрофина человека имеет длину около 2,5 м.н.п. Из них в зрелой мРНК остается только 14 т.п.н. (0,6%), остальная РНК приходится на интроны.

Эукариотическая ДНК

Ортологичные гены – гомологичные гены в геномах разных организмов, происходящие от общего предкового гена. Паралогичные гены – гомологичные гены внутри одного генома: дупликация, дивергенция семейство генов; увеличивают белковый репертуар; новые функции; адаптивность; усложнение организации клетки.

Проекты по секвенированию геномов 1.Штаммы более 40 видов бактерий 2.Протисты (тетрахимена) 3.Растения (ячмень, табак, сосна) 4.Тутовый шелкопряд, пчела 5.Шпорцевая лягушка 6.Курица 7.Собака, кошка 8.Кенгуру 9.Шимпанзе

Среди различных подходов в функциональной геномики рассмотрим два метода, которые позволяют одновременно анализировать экспрессию всех или хотя бы большинства генов в геноме. Речь пойдет о ДНК-микроэррей и РНК-интерференции.

ДНК-микрочипы позволяют одновременно анализировать информацию об экспрессии многих тысяч генов. Основными типами ДНК-микрочипов являются кДНК-микрочипы или синтетические олигонуклеотидные чипы. Microarray-анализ

Что можно изучать с использованием ДНК-микрочипов? экспрессию генов в различных тканях изменение экспрессии генов с течением времени как результат внешнего воздействия (взаимодействие клетки с патогеном, лекарством). экспрессию генов в норме и при патологии: в нормальных и мутантных клетках, в нормальных и раковых клетках. Если с помощью микроэррей-анализа сравнить экспрессию генов в опухолевой и нормальной тканях, то можно выявить гены, которые специфически экспрессируются в опухоли. Также можно выявлять экспрессию генов, специфическую для определенного заболевания. Каждое заболеванние может иметь собственный профиль экспрессии – так называемый штрих-код.

Технология микроэррей-анализа Получение организмов с альтенативными характеристиками Получение образцов РНК, и затем кДНК Мечение образцов кДНК флуоресцентными красителями Гибридизация с олигонуклеотидами ДНК, фиксированными на подложке. Каждый олигонуклеотид имеет определенные координаты на подложке Анализ

Сканированный ДНК-чип

YELLOW - если ген экспрессируется и в клетках больного (Cy5) и в клетках здорового (Cy3) человека, то в данном пятне будет гибридизоваться ДНК, меченная и красной и зеленой красками, и в результате получится желтый цвет; RED - если ген экспрессируется только в клетках больного (Cy5), то в данном пятне будет гибридизоваться только ДНК, меченная красной краской; GREEN - если ген экспрессируется только в здоровых клетках (Cy3), то в данном пятне будет гибридизоваться только ДНК, меченная зеленой краской; BLACK – если ген не экспрессируется ни в больных, ни в здоровых клетках. кДНК микрочипы

РНК-интерференция (RNA silensing) РНК-интерференция (RNA silensing) – это подавление экспрессии генов у эукариот (замалчивание генов) на посттранскрипционном уровне, индуцированное короткими интерферирующими РНК (small interfering RNA – siРНК).

Проявления функций малых РНК разрезание матричной РНК (mРНК) репрессия трансляции ремоделирование хроматина регуляция экспрессии генов на транскрипционном и посттранскрипционном уровнях

История открытия 1995 г. Guo S. and Kempues K.J. Метод антисмысловых РНК В цитоплазму эмбрионов нематоты Caenorhabditis elegans вводили РНК в антисмысловой ориентации к гену par-1. Контроль: РНК в смысловой ориентации (соответствующая мРНК) к тому же гену. Результат: замалчивание гена вызывала и антисмысловая РНК, и смысловая РНК

Продемонстрировали: именно двунитевая РНК является непосредственным агентом в подавлении экспрессии генов, которая присутствовала в препаратах с однонитевыми молекулами как примесь. агент, инициирующий замалчивание генов dsRNA (double-strained RNA) История открытия 1998 г. Fire A. and Mello C. Объект: Caenorhabditis elegans Нобелевская премия по физиологии и медицине в 2006 г. Эндрю Файер Крэйг Меллоу

Основные свойства РНК- интерференции Специфичность (подавляется экспрессия только того гена, нуклеотидная последовательность которого полностью соответствует нуклеотидной последовательности вводимой dsРНК). РНК-интерференция реализуется на посттранскрипционном уровне: фрагменты dsРНК, соответствующие последовательностям промотора или интрона не вызывали РНК-интерференцию. Эффект РНК-интерференции, возникший в каком-либо участке тела С. elegans может распространяться по всему организму и передаваться по наследству потомкам.

РНК-интерференцию обнаружили у большинства эукариотических организмов в частности у простейших кишечнополостных насекомых грибов растений млекопитающих

Механизм РНК-интерференции Появление в клетке dsРНК вызывает каскад событий, известный как РНК- интерференция. 1. Эндонуклеаза Дайсер (Dicer) связывается с dsРНК и разрезает ей на короткие фрагменты в п.н. – siРНК (short interfering RNA).

Механизм РНК-интерференции Появление в клетке dsРНК вызывает каскад событий, известный как РНК- интерференция. 2. siРНК связываются с ферментативным комплексом RISC (RNA- induced silencing complex), который использует одну ее цепь (комплементарную мРНК) для связывания с мРНК.

Механизм РНК-интерференции Появление в клетке dsРНК вызывает каскад событий, известный как РНК- интерференция. 3. Нуклеазная активность комплекса RISC деградирует мРНК.

Caenorhabditis elegans-идеальный объект для генетических исследований размер 1мм гермафродит короткий жизненный цикл (50 часов!) Известное число клеток (959 клеток) гаплоидный набор 5 аутосом + Х-хромосома, геном секвенирован, ~10 млн.п.н., генов хранение мутантных особей криогенным способом Современные методы функциональной геномики РНК-интерференция получение делеционных мутантов

РНК-интерференция как инструмент функциональной геномики C. elegans Kamath et al. и Ashafi et al. (2003)

РНК-интерференция как инструмент функциональной геномики C. elegans NATURE 2003 |VOL 421 | Р

Биологическая роль РНК-интерференции подавление активности мобильных генетических элементов контроль развития организма участие в детерминации клеток изменение структуры гетерохроматина (РНК-зависимое метилирование) Посттранскрипционное замолкание генов (PTSG; мишень РНК) Транскрипционное замолкание генов (TSG; мишень ДНК) защита от ДНК- и РНК- содержащих вирусов (растения)

Выводы: РНК-интерференция - это подавление экспрессии генов у эукариот на посттранскрипционном уровне, индуцированное короткими интерферирующими РНК. Биологическая роль РНК-интерференции заключается в - антивирусной защите (растения) - контроле перемещения МГЭ - участии в регуляции процессов развития - ремоделировании хроматина - участие в процессе детерминации клеток Этот процесс является многоэтапным, контролируется набором генов, кодирующих белки семейства Argonaut, Dicer и др. РНК-интерференция – экспериментальный метод функциональной геномики эукариот и генотерапии.

МикроРНК: регуляция экспрессии генов микроРНК (miRNA) Консервативны у отдаленных видов. Одноцепочечные РНК длиной около 22 нуклеотидов. Комплементарно (или частично комплементарно) связываются с мРНК, что приводит к ее разрушению или к ингибированию трансляции.

микроРНК: особенности структурной и геномной организации Одинаковая последовательность может кодироваться разными генами. Гены миРНК чаще всего располагаются между полипептид-кодирующими генами. Могут располагаться в интронах полипептид-кодирующих генов. Транскрипция происходит параллельно с транскрипцией пре-мРНК данного гена. Гены миРНК организованны в кластеры, транскрибируемые как мультигенные РНК-продукты.

Перспективы использования геномики в практике 1. Создание лекарств нового поколения. Вакцины и иммунофакторы нового типа. 2. Создание новых форм растений и животных, устойчивых к стрессовым факторам. 3. Создание продуцентов для биотехнологии. Идентификация новых «полезных» генов. 4. Применение методов геномики для оценки и мониторинга биоресурсов. 5. Идентификация генов, ответственных за предрасположенность к болезням. Новый уровень диагностики и профилактики. Генотерапия.