МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ И ГЕНЕТИКА ВИРУСА КОРИ С. Маркушин

1. ВВЕДЕНИЕ Вирус кори человека является членом рода Morbillivirus семейства Para- myxoviridae. В род Morbillivirus входят помимо вируса кори также вирус чумы плотоядных, вирус чумы крупного и мелкого рогатого скота, вирус чумы грызунов, вирус чумы тюленей, вирус чумы китовых ( морских свиней и тюленей), морбилливирус белых и полосатых дельфинов, морбилливирус лошадей. Корь является антропонозом.

Геном вируса кори представляет несегментированную одноцепочечную РНК отрицательной полярности длиной около нуклеотидов и молекулярной массой около 4,5x 10 kDa (Lund et al.,1984; Baczko et al.,1983). В настоящее время геном многих диких и вакцинных штаммов вируса кори отсеквенирован и первичная структура генома этого вируса нам хорошо известна.

Аккумуляция лидерной РНК в ядре инфицированных клеток поддерживает гипотезу о том, что эта РНК играет роль в down- регуляции транскрипции клетки - хозяина и может быть ответственна за супрессию синтеза иммуноглобулинов в В- клетках, инфицированных вирусом кори. Предполагается, что такие изменения в инфицированных клетках могут приводить к коревой персистентной инфекции. У большинства моноцистронных N и бицистронных N-P РНК отсутствуют лидерные последовательности.

Cообщается, что клеточные белки взаимодействуют с геномной 3- некодирующей областью и с лидерной последовательностью положительной полярности вируса кори. В клетках Vero белки клетки-хозяина связываются специфически с отдельными доменами этих двух последовательностей ( Leopardi et al., 1993).

Во время репликации вируса кори, РНК- полимеразный комплекс стартует с геномной 3- некодирующей области и транскрибирует последовательно моноцистронные m РНК или, игнорируя стоп-сигналы, расположенные между отдельными генами, синтезирует полноразмерные копии вирусного генома.

РНК вируса кори неинфекционна. Синтезированная геномная РНК контактирует с N –белком, формируя спиральную нуклеокапсидную структуру, типичную для парамиксовирусов, включающую в себя также белки L и P. N- белок накапливается в инфицированных клетках в избыточном количестве, поскольку область генома, кодирующая этот белок, расположена ближе всего к промотору. Молекулярная масса N-белка достигает 60 кДа.

Белок Р присутствует в вирионах в незначительном количестве и весьма чувствителен к действию протеолитических энзимов. В процессе образования вирионов Р- белок связывается с N-белком и геномной РНК, причем в процессе связывания с РНК большую роль играет участок Р-белка, включающий с 204 -го по 321-ый аминокислотный остаток.

Была исследована, в частности, способность V- белка регулировать экспрессию минирепликона, взаимодействовать с N- белком и связываться с РНК вируса кори ( Parks et al, 2000). Cистема изучения включала минирепликон, содержащий ген-репортер, кодирующий хлорамфениколацетил-трансферазу с промотором фага Т7, в сочетании с плазмидами, кодирующими отдельно N, P, L- белки вируса кори. Активность системы резко ингибировалась котрансфекцией вектора, несущего V- белок.

Для изучения функций неструктурных белков С и V были исследованы варианты вируса кори с делециями этих белков ( С- и V- варианты) (Patterson et al., 2000), полученные с помощью генетических методов, разработанных в лаборатории д-ра Биллетера (Radecke et al., 1995). По сравнению с родительским штаммом Edmonston, оба делеционных варианта демонстрировали нормальное размножение и наличие цитопатического эффекта в клетках Vero, и показывали сходную кинетику размножения в клетках человеческой нейробластомы SK- N-MC и первичной культуры мышиных нейронов, экспрессирующих рецептор CD46.

Cходные результаты были получены другой группой исследователей на модели имплантатов тимуса человека, вживленных в тело генетически измененных мышей, и инфицированных мутантами вируса кори, имеющими нарушения синтеза V и С – белков. Полученные результаты свидетельствуют о том, что белки С и V необходимы для эффективной репликации вируса in vivo (Valsamakis et al., 1998).

Белковые компоненты оболочки вириона включают М-белок и Н и F- гликопротеины. Гемагглютинин ( H-белок ) ответственен за ассоциацию вирусной частицы с рецепторами клеточной поверхности. Он является гемагглютинирующим белком, трансмембранным гликопротеином II типа и на поверхности инфицированных клеток и вирионов представлен в виде гомодимера, имеющего дисульфидные связи ( Alkhatib and Briedis, 1986; Hardwick and Bussell, 1978).

Н-белок штамма Edmonston имеет несколько потенциальных мест гликозилирования. Постоянный характер гликозилирования наблюдается в позициях 168, 187, 200 и 238. (Сattaneo and Rose,1993; Hu and Norby, 1995). Дополнительный сайт гликозилирования выявлен у недавно выделенных диких штаммов вируса кори в позиции 416 ( Rota et al.,1992; Lingyun and Yipeng, 1998). Цистеиновые остатки в позициях 287, 300, 381, 394, 494, 579 и 583 участвуют в образовании внутримолекулярных и межмолекулярных дисульфидных связей ( Hu and Norrby, 1995).

Белок слияния ( F-белок) является трансмембранным белком 1 типа. Он обладает высокой консервативностью ( Buckland et al.,1987). Исходно он синтезируется как функционально неактивный полипротеин с молекулярной массой около 60 кДа. Обнаружено, что m РНК, кодирующая полипротеин F0, имеет 5- концевую нетранслируемую область длиной нуклеотидов. Нетранслируемая область имеет сложную вторичную структуру, поскольку она содержит много G и С – нуклеотидов ( Richardson et al., 1986; Evans et al., 1990 ).

М-белок вируса кори содержит 335 аминокислотных остатков ( Bellini et al., 1986) и имеет положительный заряд при физиологических значениях рН. Обнаружено взаимодействие этого белка с цитоплазматическими доменами гликопротеинов вируса кори. Полипептидная цепь М-белка содержит 3 гидрофобные области. Предполагается по меньшей мере два функциональных домена у молекулы М-белка.

Ген, кодирующий L-белок, имеет одну рамку считывания, которая позволяет считывать полипептид с молекулярной массой около 247 кДа. Наличие аминокислотных остатков Met-Asp на NH-конце L-белка позволяет предполагать повышенную нестабильность этого белка в цитоплазме инфицированных клеток, однако L- белок характеризуется нормальной стабильностью.

3. МОРФОЛОГИЯ ВИРИОНОВ ВИРУСА КОРИ Вирионы вируса кори в подавляющем большинстве представляют собой плеоморфные, сферические, покрытые липидной оболочкой частицы, имеющие в диаметре nm. Липидная оболочка обволакивает спиралевидную нуклеокапсидную структуру, состоящую из РНК и белка.

Молекулярная структура Н- белка вируса кори сходна с молекулярной структурой нейраминидазы, однако не обладает нейраминидазной активностью (Langedijk et al.,1997). Многие аспекты морфогенеза Н-белка вируса кори остаются недостаточно изученными. Нуклеокапсид вируса кори представляет собой спиралевидную структуру с диаметром nm, центральным отверстием размером 5nm, и винтовым шагом, также равным 5 nm.

4. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ВИРУСА КОРИ С КЛЕТОЧНЫМИ РЕЦЕПТОРАМИ Первичное взаимодействие вируса кори с организмом хозяина встречается в процессе аэрозольной передачи и начальной инфекции слизистой оболочки рта и респираторного тракта (Norrby and Oxman, 1990). Далее вирус распространяется по всему организму, используя лимфоидную систему (Griffin and Bellini, 1996).

В настоящее время структура и регуляторная активность СD46 хорошо охарактеризованы. Экстрацеллюлярный домен CD46, начиная с NH2- конца, состоит из 4-х консервативных модулей - так называемых коротких согласованных повторов ( SCRs), которые были найдены у всех членов семейства регуляторов активации комплемента (Liscewski et al., 1991). Каждый SCR -модуль состоит из 60 аминокислотных остатков в длину и содержит 4 консервативных цистеина,которые образуют дисульфидные связи, при этом первый и третий цистеин образуют связь C1-C3, а второй и четвертый- вторую связь С2-С4 (Barlow et al.,1991).

Известно, что область взаимодействия H-белка вируса кори с СD46 расположена в пределах аминокислотных остатков ( Hummel and Bellini, 1995), при этом особое значение имеют аминокислотные остатки 451 и 481 ( Lecouturier et al., 1996). Обнаружено, что один димер Н-белка взаимодействует с одним мономером CD46 ( Devaux et al., 1996).

Было проведено картирование участков взаимодействия Н-белка вируса кори с SCR1 и SCR2, используя ингибирование взаимодействия вируса с рецептором CD46 c помощью набора синтетических пептидов и направленного мутагенеза. При использовании серии перекрывающихся пептидов, соответствующих определенному участку SCR1 и SCR2 было обнаружено 2 рецепторных домена, которые взаимодействовали с вирусом кори. Один домен был найден внутри SCR1 (внутри SCR2 (аминокислотные остатки ) ( Manchester et al., 1997).

Дальнейшие исследования показали, что эритроциты и лимфоциты обезьян нового света не содержат SCR1 - модуля в составе CD46 ( Hsu et al.,1997) и, следовательно, не вступают во взаимодействие с Н- белком вируса кори. Детальное изучение гемагглютинации эритроцитов различных обезьян старого света вирусом кори показало различную степень эффективности гемагглютинации. Исследования в этом направлении свидетельствуют о том, что сниженная способность к гемагглютинации вирусом кори эритроцитов отдельных видов бабуинов объясняется мутацией в позиции 103 SCR-1 модуля СD46.

Известно, что многие вирусы могут использовать для прикрепления к клеткам альтернативные рецепторы. Вирус кори не является в этом отношении исключением. Обнаружено, что белок CD46 не присутствует на поверхности некоторых клеточных линий, чувствительных к заражению вирусом кори. Было показано, что один из белков клеточной мембраны- моэзин преципитируется моноклональным антителом, которое специфически ингибирует коревую инфекцию в некоторых клетках ( Dunster et al., 1994).

Вполне вероятно, что несколько клеточных белков могут играть роль рецепторов вируса кори. Предполагают, что первым этапом взаимодействия вируса кори с клеткой является связывание Н-белка вируса с первым клеточным рецептором. Затем F - белок вируса связывается со вторым клеточным рецептором, что приводит к слиянию вирусной и клеточной мембран.

Было проведено детальное изучение взаимодействия CD46 и моэзина на поверхности клеток, инфицированных вирусом кори, с целью понять, являются ли CD46 и моэзин независимыми альтернативными рецепторами, или они осуществляют координированное взаимодействие с вирусом (Schneider-Schaulies et al., 1995). В первом случае воздействие моноклональных антител против каждого из двух рецепторов должно было незначительно ингибировать взаимодействие вируса с клеткой, поскольку исключение одного из рецепторов оставляло второй рецептор способным к связыванию с вирусом.

В соответствии со второй моделью, когда CD46 и моэзин осуществляют кооперативное взаимодействие, добавление единичного моноклонального антитела к предполагаемому комплексу должно было вызывать высокий процент ингибиции взаимодействия вируса с клеткой, а комбинированное действие моноклональных антител к каждому из рецепторов должно было вызывать аддитивный эффект при низкой концентрации антител. Как оказалось, полученные результаты подтвердили истинность второго предположения ( Schneider-Schaulies et al., 1995).

Интересные данные о судьбе вирусспецифического рецептора в клетках, инфицированных вирусом кори были получены группой Naniche ( Naniche et al., 1993). Было показано, что вирусспецифический рецептор gp57/67 ( аналог CD46), распознаваемый моноклональным антителом MC120.6 исчезал с поверхности клетки-хозяина после инфекции вирусом кори.

Кинетика интернализации gp57/67 обратно пропорциональна экспрессии Н-белка на поверхности клеток, инфицированных вирусом кори, что указывает на важную роль клеточных вирусспецифических рецепторов в образовании симпластов на поздней стадии литической инфекции или в процессе персистентной инфекции, где наблюдается сниженная экспрессия вирусспецифических рецепторов на клеточной повверхности.