Лекция 9. Система гемостаза и ее нарушения Для дополнительной информации смотри файл Гемостаз.doc

Гемостаз Остановка кровотечения (гемостаз, Hemostasis) при повреждении сосуда происходит прежде всего за счет сокращения (спазма) сосуда, которое является: 1) следствием рефлекторной стимуляции гладких мышц сосуда со стороны симпатической нервной системы и 2) действия сосудосуживающих веществ в частности, серотонина, секретируемого тромбоцитами, и тромбоксана А2, синтезируемого активированными тромбоцитами. Спазм сосуда ограничивает первоначальную потерю крови из раны и благоприятствует местному накоплению гемостатических веществ. Одновременно начинается взаимодействие крови со структурами поврежденного сосуда, что приводит сначала к образованию тромбоцитного агрегата в зоне дефекта сосуда, а затем к образованию сгустка крови на основе тромбоцитного агрегата.

Система гемостаза Система гемостаза – одна из защитных систем организма, обеспечивающая сохранение крови в жидком состоянии в пределах кровеносных сосудов и образования тромбов в области повреждения стенки сосудов. Включает следующие стадии: Локальная вазоконстрикция (сокращение сосудов в области повреждения) Образование тромбоцитарного тромба Стабилизация тромба фибрином Ретракция (сокращение) тромба Растворение тромба после восстановления повреждения стенки сосуда

Адгезия тромбоцитов Первый этап в процессе свертывание крови - адгезия (прилипание тромбоцитов к месту повреждения, например, к субэндотелиальному слою). После этого происходит активация и дегрануляция тромбоцитов (далее показаны некоторые из веществ, выделяемых тромбоцитами). На последнем этапе происходит агрегация тромбоцитов (связывание активированных тромбоцитов с прилипшими к месту повреждения тромбоцитами).

Активация тромбоцитов и секреция тромбоцитарных факторов

Факторы системы свертывания крови В системе свертывания крови имеются плазменные и тромбоцитарные факторы В активированной форме 6 плазменных факторов крови и калликреин – это сериновые протеазы. Механизм свертывания представляет собой каскад реакций ограниченного протеолиза белковых факторов, что в конечном итоге приводит к полимеризации последнего продукта - фибрина. Протеазные домены располагаются в С-концевых частях молекул факторов, аминокислотные последовательности в этих областях гомологичны таковым для трипсина и химотрипсина (механизм действия химотрипсина дан в приложении в конце). Селективность действия протеаз в системе гемостаза обеспечивается структурой N-концевых частей молекул.

Факторы системы свертывания крови Название Мол. масса время Функция кДа полужизни кДа полужизни Фибриноген (I) дн. структурная Протромбин (II) дн. профермент Тканевой ф-р (III) 37 активатор Ионы Са (IV) кофактор Проакцелерин (V) дн кофактор Проконвертин (VII) 50 5 ч профермент Фактор VIII (антиге- мофильный А) ч кофактор Фактор IX (антиге- мофильный B) ч профермент Фактор X 56 3 дн. профермент Фактор XI дн. профермент Фактор XII 80 3 дн. профермент Фактор XIII (тромбо- цитарный) дн профермент Прекалликреин (плазменный) 80 ф-р контактной активации ВМК110 ф-р контактной активации

Структура N-концевых частей молекул факторов плазмы крови В N-концевой части протромбина (II), факторов VII, IX, X, а также протеинов G и S содержится до 12 остатков - карбоксиглутаминовой кислоты, образующейся вследствие посттрансляционного -карбоксилирования остатков Glu под действием карбоксилазы и витамин К- эпоксидредуктазы Остатки карбокси-Glu связывают ионы Са, что стабилизирует структуру белков, необходимую для их взаимодействия с фосфолипидами. При дефиците витамина К или наличии его антагонистов, синтезируются факторы, обладающие низкой активностью (PIVKA-белки, индуцируемые антагонистами витамина К)

Карбоксилирование глутамата SH HS S-S Антагонисты витамина К (варфарин) SH HS S-S + О 2 + СО 2 эпоксиредуктаза карбоксилаза

Витамин К и его антагонист о Варфарин применяется в медицине для терапии тромбозов

Домены, присутствующие в факторах системы свертывания Крингл-домен. Протромбин (фактор XII )и ферменты системы фибринолиза содержат участки с 80 аминокислотами, имеющими форму петли в виде сплюснутого бублика (крингл-домен). Обеспечивает взаимодействие с другими факторами гемостаза ЕGF-домен. Факторы VII, X, IX и XII содержат последовательность из 50 аминокислот, гомологичную таковой фактора роста эпидермиса (EGRF). Эти домены обеспечивают связывание факторов с рецепторами поверхности клеток или рецепторными доменами факторов V и VIII. Ароматические аминокислоты. Протромбин, факторы VII, IX и X содержат последовательность Phe-Trp-X-X-Tyr, в которой ароматические боковые цепи экспонированы наружу, создавая гидрофобный участок, взаимодействующий с мембранами клеток. Домены фибронектина. Фактор XII содержит два участка, гомологичных фрагментам фибронектина типа I и II. Фрагмент типа II принимает участие во взаимодействии с коллагеном

Структура крингл-домена

Домены фибронектина

Схема основных реакций активации свертывания крови Калликреин прокалликреин Кининоген XII XIIa Тканевой Фактор (III) Внутренний путь Внешний путь VIII + VIIa XI XIa IX IXa+VIII+Ca+X Мембраны клеток тромбоциты V+Ca+Xa+протромбин Мембраны клеток тромбоциты Тромбин Фибриноген Фибрин мономер Фибрин XIIIа XIII Стабилизированный фибрин Появляется при повреждении ткани Антигемофильный А Антигемофильный В

Фактор XIII Две формы: плазменная и тромбоцитарная. Плазменная: тетрамер из двух пар цепей ( и ), тромбоцитарный содержит только -цепь. Активация фактора XIII (плазменная форма) происходит в 2 этапа: сначала под действием тромбина или Xа происходит расщепление - цепи с освобождением пептида активации, а затем тетрамер распадается с образованием активного димера из состоящего из 2 -цепей. Активированный фактор XIII катализирует образование -( Активированный фактор XIII катализирует образование -( -глутамил)-лизиновых связей между полипептидами в комплексах белков. Под действием фактора XIII происходит «сшивание» мономеров фибрина в полимер, а также «пришивание» 2-антиплазмина, коллагена и фибронектина.

Белки – активаторы протеаз системы свертывания крови Факторы V и VIII (антигемофилийный А) выполняют сходные функции. Они обеспечивают связывание витамин К-зависимых активированных факторов IX и X с фосфолипидами. Наличие таких взаимодействий увеличивает эффективность реакций активации в раз. Факторы V и VIII синтезируются как полипептиды. Оба белка содержат по 2 домена, гомологичных церулоплазмину, по 2 гомологичных C-домена и большой B-домен, который отщепляется при активации факторов. Фактор VIII подвергается протеолизу в С-концевой части В-домена, в крови присутствует в виде набора гетеродимеров, взаимодействующих с ионами Са.

Белки – активаторы протеаз системы свертывания крови Факторы V и VIII активируются под действием тромбина или фактора Xa. Тромбин расщепляет фактор V по остаткам аргинина (709, 1018, 1545), а фактор VIII – по остаткам Arg 372, 740 и В активированной форме фактор V – гетеродимер (A1-A2/A3-C1-C2), а фактор VIII – гетеротример (А1/А2/А3-С1-С2), субъединицы которых взаимодействуют при участии ионов Ca. С-концевые участки этих факторов взаимодействуют с фосфолипидами.

Фактор фон Виллебранда В плазме крови фактор VIII циркулирует в виде комплекса с фактором фон Виллебранда (vWF) – адгезивным белком, обеспечивающим связывание тромбоцитов с субэндотелиальными структурами и склеивание тромбоцитов при агрегации. Кроме того, vWF повышает стабильность фактора VII и его защиту от инактивации протеином С. Синтезируется как полипептид из 2050 аминокислот, а затем полимеризуется с образованием комплексов с молекулярной массой до Димеры vWF постоянно секретируются в плазму, а мультимеры присутствуют в - гранулах тромбоцитов и секретируются из них при активации. Мультимеры vWF играют ведущую роль в адгезии тромбоцитов и образовании тромбоцитарных агрегатов в условиях высокого напряжения сдвига, которое характерно для узких сосудов и стенозированных участков артерий.

Фактор фон Виллебранда Недостаточность этого фактора приводит к увеличению риска кровоизлияния (болезнь фон Виллебранда), в сочетании с гипертонией увеличивает риск мозгового кровоизлияния. Болезнь фон Виллебранда врождённое отсутствие мультимерных форм фактора фон Виллебранда, необходимых для агрегации тромбоцитов. Проявляется как геморрагический синдром, характеризующийся тенденцией к кровотечению из слизистых оболочек, увеличением времени кровотечения.

Тканевой фактор (III) Трансмембранный гликопротеид, выполняющий функции рецептора фактора VII, модулирующий его активность. Активность фактора III зависит как от белка, так и от фосфолипидов мембраны клеток. Связывание одноцепочечной формы фактора VII с фактором III изменяет структуру фактора VII так, что становится возможным его расщепление на двухцепочечную форму, которая в комплексе с фактором III активирует X и XI факторы свертывания крови, что инициирует каскад коагуляции. Высокое содержание фактора III характерно для мозга, миокарда, клеток эпидермиса и эпителия, выстилающего слизистые оболочки. Клетки эндотелия и моноциты могут экспрессировать фактор III под действием цитокинов, эндотоксина, окисленных ЛНП и иммунных комплексов, обеспечивая образование внутрисосудистых тромбов при ряде заболеваний. Фактор III состоит из 263 аминокислот, отдаленный родственник суперсемейства белков, включающего рецепторы гормона роста, ИЛ Связывание фактора VII с фактором III стимулирует миграцию ГМК, рост и метастазирование опухолей. Избирательное повреждение гена фактора III приводит к аномалиям в развитии сосудов.

Фибриноген (I) Фибриноген состоит из трех пар неидентичных полипептидных цепей: А, В и (67, 52 и 47 кДа). Молекула фибриногена симметрична, слегка изогнута, размер 7x48 нм. N-концевые части всех трех субъединиц образуют центральную область взаимодействия двух половин молекулы фибриногена (Е-домен), которые связаны тремя дисульфидными связями. S-S-связи гамма-цепь бета альфа Далее следует область, где три субъединицы закручены в суперспираль. Примерно посередине имеется неспиральная область специфического расщепления плазмином. С-концевые фрагменты и образуют на концах глобулы Область расщепления плазмином Е-доменD-домен Фибринопептиды В и А суперспираль

Полимеризация фибрина Полимеризация фибрина начинается после отщепления тромбином N-концевого 16 членного фибринопептида А в - цепи, в результате чего открывается участок Gly-Pro-Arg, взаимодействующий с участком С-концевой части -цепи. Этим инициируется самосборка протофибрилл, в которой D- домен одной молекулы взаимодействует с Е-доменом второй D E D E D DD E D Отщепление от N-конца В-цепи 14 членного пептида и экспозиция участка Gly-His-Arg ускоряет процесс сборки и латеральную ассоциацию протофибрилл. Ветвление с образованием трехмерной сетки обусловлено C-концевыми -цепи. доменами -цепи. Механическая стабильность повышается, когда под действием фактора XIII образуются ковалентные связи между смежными мономерами фибрина в полимере. Сначала попарно сшиваются -цепи. в полимере. Сначала попарно сшиваются -, а затем - -цепи.

Фибриноген Последовательность каждой из цепей кодируется своим геном, которые возникли в результате дупликации одного гена- предшественника. -цепь существует также в минорной форме (около 10%), у которой в результате альтернативного сплайсинга С-концевой тетрапептид заменен на 20-членный пептид. Фибриноген с удлиненной цепью менее эффективно взаимодействует с тромбоцитами. -цепь существует также в минорной форме (около 10%), у которой в результате альтернативного сплайсинга С-концевой тетрапептид заменен на 20-членный пептид. Фибриноген с удлиненной цепью менее эффективно взаимодействует с тромбоцитами. Обнаружены полиморфные участки в А -цепи (Thr/Ala312) и в В-цепи (Arg/Lys448). У мужчин, гомозиготных по Arg 448 уровень фибриногена в крови ниже, чем у гетерозигот и гомозигот по Lys448. Кроме того, есть полиморфизм в области промотора В-гена. Т.о. уровень фибриногена частично определяется генетически. Фибриноген подвергается множественной посттрансляционной модификации: гликозилированию, фосфорилированию, сульфатированию (Tyr 418, 422) минорных -цепей и гидроксилированию Pro31 в -цепи. В А -цепи фосфорилируются Ser3 и Ser 345. Степень фосфорилирования второго Ser влияет на структуру фибринового геля: дефосфорилированный белок образует при полимеризации более толстые нити, фосфорилированный белок более устойчив к протеолизу.

Фибриноген Фибриноген связывает три иона Са c Кд около 1 мкМ и около 10 ионов Са с Кд около 1 мМ. Участки высокого сродства гомологичны центрам связывания Са на кальмодулине (находятся в С-концевой области -цепи). Мутации в этой области приводят к нарушению полимеризации фибрина. С низким сродством Са связывается с участками сиаловых кислот. Молекула фибриногена содержит 2 участка гликозилирования, от которых отходят 4 раздваивающиеся углеводные цепи с сиаловыми кислотами на концах. Они играют важную роль в полимеризации: при их отщеплении скорость полимеризации фибрина возрастает, отщепление всех углеводов устраняет влияние Са на полимеризацию. Увеличение содержания сиаловых кислот, связанное с увеличением активности сиалтрансферазы, приводит к дисфибриногенемии. Дисфибриногенемия – нарушение функций фибриногена. Описано более 80 вариантов мутаций. которые влияют на отщепление фибринопептидов, полимеризацию, взаимодействие с тромбоцитами и эритроцитами, нарушение сшивания и разрушение фибрилл.

Фибриноген Синтез фибриногена значительно повышается при многих заболеваниях, его синтез стимулируется ИЛ-6. Уровень фибриногена в крови увеличивается 1) с возрастом, 2)при гиперлипидемии, 3) курении и 4) приеме пероральных контрацептивов. Максимальная концентрация фибриногена в крови в зимние, минимальная – в летние месяцы. Увеличение уровня фибриногена рассматривают как фактор риска возникновения сердечно- сосудистых осложнений. Фибриноген влияет на вязкость крови, повышает агрегацию тромбоцитов и эритроцитов. Он накапливается в области атеросклеротических бляшек. Фибрин и продукты его расщепления стимулируют пролиферацию ГМК и моноцитов.

Активация свертывания крови Свертывание крови – результат серии реакций, в которых путем ограниченного протеолиза образуются активные компоненты системы свертывания. Многоступенчатость и ферментативная природа реакций активации обеспечивает возможность мощного «усиления сигнала» и эффективность контроля, который должен происходить локально в области повреждения стенки сосуда Существуют два пути активации свертывания крови: внутренний и внешний.

Схема основных реакций активации свертывания крови Калликреин прокалликреин Кининоген XII XIIa Тканевой Фактор (III) Внутренний путь Внешний путь VIII + VIIa XI XIa IX IXa+VIII+Ca+X Мембраны клеток тромбоциты V+Ca+Xa+протромбин Мембраны клеток тромбоциты Тромбин Фибриноген Фибрин мономер Фибрин XIIIа XIII Стабилизированный фибрин Появляется при повреждении ткани Антигемофильный А Антигемофильный В

Кинин-калликреиновая система Кинин-калликреиновая система состоит из небольших полипептидов, а также набора активирующих и деактивирующих компоненты ферментов. ферментов Освобождение кининов из кининогенов происходит под действием трипсиноподобных сериновых протеиназ - калликреинов, локализованных в плазме крови (плазменный калликреин) и в тканях некоторых органов Это группа белков крови, играющих роль в воспалении, контроле артериального давления, коагуляции и возникновении болевых ощущений. Важнейшими компонентами данной системы являются брадикинин и каллидин воспалении артериального давления брадикининкаллидинвоспалении артериального давления брадикининкаллидин Высокомоллекулярный кининоген (ВМК )синтезируется в печени наряду с прекалликреином. Не обладает каталитической активностью. печенипрекалликреиномпеченипрекалликреином Низкомолекулярный кининоген (НМК) синтезируется местно, многими тканями и секретируется вместе с тканевым калликреином. калликреином ВМК и НМК образуюстя в результате альтернативного сплайсинга одного гена. альтернативного сплайсингагенаальтернативного сплайсингагена Прекалликреин - предшественник калликреина плазмы крови является гликопротеином, представленным одной пептидной цепью, состоящей из 619 аминокислотных остатков. Синтезируется прекалликреин в гепатоцитах.

Кининогены В плазме крови человека присутствуют два кининогена: высокомолекулярный кининоген (ВМК) и низкомолекулярный кининоген (НМК), синтез которых кодируется единым геном, локализованным в хромосоме 3. Ген кининогена содержит 11 экзонов, девять из них образуют три триплетных экзона. Экзон 10 содержит общую для двух кининогенов кининовую последовательность (экзон 10a) и особую С - концевую последовательность ВМК (экзон 10b), а экзон 11 кодирует уникальную С - концевую последовательность НМК. Альтернативный сплайсинг первичного транскрипта кининогенового гена образует две различные мРНК, специфичные соответственно для ВМК и НМК Кининогены могут обратимо связываться с тромбоцитами, нейтрофилами и эндотелиальными клетками Во всех случаях для связывания кининогенов с клетками необходим Zn 2+. При связывании с клетками ВМК контролирует их функции. Взаимодействие ВМК (D3) с тромбоцитами, скорее всего через тромбоспондин, угнетает активность тромбоцитарного кальпаина и подавляет агрегации тромбоцитов, стимулированной тромбином, препятствуя тем самым связыванию последнего с клетками

Внутренний путь Связывание фактора XII (фактора Хагемана) с компонентами субэндотелиального слоя, активированными тромбоцитами, мицеллами из фосфолипидов или бактериальными полисахаридами изменяет его конформацию, так что: 1) он становится чувствительным к расщеплению калликреином; 2) в комплексе с кининогеном повышает активацию прекалликреина, т.е образуется большое количество фактора активированного фактора XIIa Начальный этап – расщепление фактора XII по Arg353 с образованием фермента, состоящего из двух полипептидных цепей, соединенных дисульфидными связями. Протеазная активность находится в легкой цепи, а в тяжелой – домены взаимодействия. Калликреин может расщеплять далее по Arg334 и Arg343, что приводит к потере второй цепи и способности взаимодействовать с партнерами.

Активация фактора XI Далее фактор XIIa активирует фактор XI, расщепляя в нем связь с Arg369, образуя легкую и тяжелую цепи, соединенные дисульфидными мостиками (как и в случае с калликреином). Наследственный дефицит фактора XII и каллекреина не проявляется как повышенная кровоточивость

Активация фактора IX Фактор XIa активируется в результате расщепления связей Arg145-Ala146 и Arg180- Val181 с освобождением пептида активации. Может происходить как под действием XIа, так и комплекса фактора VII с тканевым фактором в присутствии Са, причем оба пути примерно одинаково эффективны. Симптомы кровоточивости у больных с дефицитом фактора XI менее выражены, чем у больных с дефицитом факторов IX или VIII, что свидетельствует об их физиологической значимости.

Схема основных реакций активации свертывания крови Калликреин прокалликреин Кининоген XII XIIa Тканевой Фактор (III) Внутренний путь Внешний путь VIII + VIIa XI XIa IX IXa+VIII+Ca+X Мембраны клеток тромбоциты V+Ca+Xa+протромбин Мембраны клеток тромбоциты Тромбин Фибриноген Фибрин мономер Фибрин XIIIа XIII Стабилизированный фибрин Появляется при повреждении ткани Антигемофильный А Антигемофильный В

Активация фактора X Активация фактора X под действием фактора IXa происходит на поверхности фосфолипидов при участии ионов Са и фактора VIIIa, который обеспечивает связывание и оптимальное взаимодействие факторов XIa и X, увеличивая скорости реакции в раз. И вновь фактор X состоит из двух цепей, взаимодействующих за счет образования дисульфидных связей, образуются они вследствие расщепления связей Arg139-Arg140 и/или Arg142- Ser143. Активация фактора X происходит вследствие расщепления связи Arg194-Ile195 в N- концевой части цепи с освобождением пептида активации. Другой важный компонент активации фактора X –комплекс тканевого фактора и фактора VIIa

Внешний путь активации При контакте крови с клетками, экспрессирующими тканевой фактор (ТФ), фактор VII связывается с ТФ с Kd 3 нм. Образование комплекса увеличивает чувствительность фактора VII к протеолизу, приводящему к расщеплению связи Arg152-Ile153. Активация происходит под действием следов факторов X и IX, а также вследствие аутоактивации. В плазме около 1% фактора VII постоянно находится в двухцепочечной форме, которая без ТФ не ингибируется антитромбином III и не может активировать свои естественные субстраты: факторы X и IX. Фактор VII может активироваться и под действием фактора XIIa

Образование тромбина Фактор X, активированный на поверхности фосфолипидов комплексом IXa-VIIIa или комплексом фактор VIII- TФ, образует комплекс с фактором V и протромбином. В результате последовательного расщепления двух связей в молекуле протромбина (Arg320-Ile321) образуется мейзотромбин, состоящий из двух половин молекулы, соединенных дисульфидной связью. Мейзотромбин связывается с протеином С и активирует вазоконстрикцию. После гидролиза в мейзотромбине связи Arg271-Thr образуется N-концевой фрагмент активации протромбина и молекула -тромбина, состоящая из двух цепей, соединенных дисульфидной связью. А цепь состоит из 49 аминокислот, но у человека от нее может отщепляться 13 аминокислот без изменения активности. Протеазный и субстрат- связывающие центры находятся на В-цепи (259 аминокислот). После протеолиза тромбин диссоциирует из комплекса и обеспечивает следующие функции: прокоагулятная антикоагулянтная, вазоактивная и митогенная. Он обеспечивает превращение фибриногена в фибрин и активирует фактор XIII, стабилизирующий фибрин. Кроме того, он активирует свое образование, оказывая прокоагулянтное действие.

Положительные обратные связи Тромбин ускоряет свое образование, активируя тромбоциты, факторы V и VIII, и возможно VII и IX. Он самый мощный из факторов активации тромбоцитов, это ведущий путь образования артериальных тромбов. Активация происходит через мембранный рецептор (7ТМ), от которого отщепляется N-концевой пептид, который и активирует рецептор. В этом случае одна молекула может активировать несколько рецепторов. В двух ключевых реакция факторы Va и VIIIa обеспечивают образование на поверхности мембраны комплексов, в которых каталитическая эффективность kcat/Km увеличивается в сотни тысяч раз. Способность к образованию фосфолипид-зависимых комплексов появляется после расщеплении в этих факторов минимум трех связей. Активация фактора VIII необходима для его диссоциации из комплекса с vWF. Положительные обратные реакции факторов Xa и IXa – активация фактора VII. Положительные обратные реакции факторов Xa и IXa – активация фактора VII.

Схема основных реакций активации свертывания крови Калликреин прокалликреин Кининоген XII XIIa Тканевой Фактор (III) Внутренний путь Внешний путь VIII + VIIa XI XIa IX IXa+VIII+Ca+X Мембраны клеток тромбоциты V+Ca+Xa+протромбин Мембраны клеток тромбоциты Тромбин Фибриноген Фибрин мономер Фибрин XIIIа XIII Стабилизированный фибрин Появляется при повреждении ткани Антигемофильный А Антигемофильный В

Функции фосфолипидов Ограничение свертывания крови участком повреждения достигается за счет локализации участников реакции на поверхности поврежденных или стимулированных клеток. При этом необходимо участие клеток, содержащих ТФ, и активированных тромбоцитов. Наружный слой мембраны содержит холиновые фосфолипиды, внутренний - фосфатидилсерин и фосфатидилэтаноламин, обладающие прокоагулянтными свойствами. Асимметричное распределение определяется флиппазой и АВС- транспортером. Повышение внутриклеточной концентрации Са ингибирует транспортер, снижает поверхностный уровень прокаогулянтных фосфолипидов.

Система противосвертывания: Аннексин V: секретируется из эндотелиальных клеток и оказывает локальное антикоагулянтное действие, связываясь с прокоагулятными фосфолипидами (напр. Фосфатидилсерином) Ингибиторы сериновых протеаз: в основном из семейства «серпинов», кроме того, ИПТФ (ингибитор пути тканевого фактора) и - макроглобулин.

Серпины Серпины (включая овальбумин, ангиотензиноген, тироксин-связывающий белок) состоят из около 400 аминокислот, различия в м.м. обусловлены гликозилированием. Участок взаимодействия с протеазами находится в С- концевой части, N-концевая часто отщепляется. В случае антитромбина это приводит к изменению связывания гепарина. Механизм действия заключается в образования стехиометрического комплекса протеаза- ингибитор, в котором после расщепления получающийся пептид остается ковалентно связанным с активным центром. Комплекс выводится из кровотока и разрушается.

Антитромбин III Антитромбин III ингибирует все протезы системы свертывания, а также плазмин, трипсин и CIs компонент системы комплемента. Состоит из 442 аминокислот, три S-S связи и 4 участка гликозилирования. Ковалентно связывается с Ser активного центра протеаз. Скорость ингибирования существенно повышается в присутствии сульфатированных сахаров, в частности гепарина (минимально –пентасахар). В антитромбине III петля, содержащая активный центр, частично погружена внутрь белка, она экспонируется наружу после взаимодействия с гепарином. В антитромбине III петля, содержащая активный центр, частично погружена внутрь белка, она экспонируется наружу после взаимодействия с гепарином. Антитромбин III связывается с гепарином стехиометрически с высоким сродством за счет взаимодействия с положительно заряженными остатками Arg47, Lys125, Arg129, Arg132, Lys 133. За счет связывания с гепарином увеличивается константа скорости ингибирования: от 1 Мс(-1) до 10(7) мс(-1). В кровеносных сосудах функцию гепарина могут осуществлять глюкозаминогликаны и гликопротеины поверхности эндотелия.

Гепарин Повторяющиеся дисахариды Глюкозаминогликан Число дисахаридов на цепь Гепарин

Гиалуроновая кислота

Дефицит антитромбина Частота наследственного дефицита антитромбина III в популяциях (аутосомно-доминантный признак) составляет 1/ Клинические проявления – тромбозы глубоких вен и тромбоэмболия легочной артерии. Вероятность тромботических осложнений в 15 лет менее 10%, после 50 лет около 85%. При этом травмы, операции инфекции увеличивают риск тромбоза. Тип 1 дефицита – снижена активность и концентрация антитромбина III Тип II – концентрация в пределах нормы, но изменены свойства: мутация Pro429-Leu (Ia) – не образуется дисульфидная связь, что изменяет способность к взаимодействию с протеазами и гепарином, в двух других группах нарушено взаимодействие с протеазами (IIb), либо с гепарином (IIc). Приобретенный дефицит –снижение синтеза (заболевания печени), либо повышенные потери белка в результате нефротического синдрома и заболевания ЖКТ.

Система протеина С Протеин С – профермент, который после активации тромбином расщепляет факторы Vа и VIIIa, прерывая каскад Тромбомодулин - трансмембранный гликопротеид (557 аминокислот). На N-конце домен, гомологичный лектинам, за ним 6 EGF-доменов, участки гликозилирования и ТМ домен. Связывает тромбин с высоким сродством (EGF 5 и 6) и углеводной цепью. Связывание тромбина с ТМ увеличивает эффективность реакции активации ПрС примерно в раз и ингибирует прокоагулятные свойства тромбина: активацию тромбоцитов, фактора V. Стимулирует разрушение тромбина лизосомальными ферментами.

Протеин S Увеличивает скорость инактивации протеином C факторов Va и VIII в составе протромбиназного комплекса с X –фактором, но только в присутствии фосфолипидов.

Дефицит протеина С и S Дефицит этих белков приводит к развитию венозных тромбозов и тромбоэмболии. При гетерозиготной форме тромбозы появляются после 14 лет, но вероятность их развития увеличивается с возрастом, а также при травмах, операциях, иммобилизации и использовании пероральных контрацептивов. При дефиците этих факторов увеличивается риск тромбофлебитов, при дефиците прС/прS риск тромбозов при беременности у носителей с дефицитом антитромбина III. Частота 1 на 300 человек.

Резистентность к протромбину С и тромбозы Резистентность к прС отмечется у % больных, страдающих тромбозом глубоких вен. Наиболее часто причина – замена Arg 506 на Gln, а также наличие полимофрных участков в экзоне 13.

Система фибринолиза: плазминоген и плазмин Фермент, расщепляющий фибрин – плазмин, образуется при активации плазминогена (24 S-S связи, 5 крингл- доменов). Крингл-домены связывают плазминоген с фибрином. От молекулы плазмина освобождается N-концевой пептид, что активирует гидролиз фибрина. Рабочая форма плазмина –две цепи с соединенные дисульфидными связями. Наиболее чувствительна к протеолизу плазмином С-концевая часть цепи фибрина. Полная потеря свертываемости – после отщепления одного из D- доменов, являющегося периферическим участком полимеризации. Один из тканевых активаторов плазминогена –урокиназа (EGF, крингл и каталитический домен). Культура гемолитического стрептококка производит стрептокиназу, образующую комплекс с плазминогеном, в результате чего формируется активный центр протеазы.

Специфичность действия различных пептидаз ( приложение ) Трипсин Lys, Arg (C-конец) Химотрипсин Phe, Trp, Tyr (C) V8 (Staphylococcus aureus) Asp, Glu (C) Пепсин Phe, Trp, Tyr (N)

Механизм действия химотрипсина (приложение) цепь Химотрипсин – протеаза, катализирующая гидролиз пептидной связи, рядом с которой находится ароматическая аминокислота (Trp, Phe,Tyr). Реакция, катализируемая химотрипсином, иллюстрирует принцип стабилизации переходного состояния и является классическим примером общего кислотно-основного катализа и ковалентного катализа. Каталитический цикл состоит из двух фаз, в первой из которых разрывается пептидная связь субстрата и образуется эфирная связь между карбонильным углеро- дом пептида и OH- группой Ser 195 : форми- руется ацил-фермент (интермедиат). Во второй фазе происхо- дит гидролиз эфирной связи регенерация свободного фермента субстрат Аминокислоты активного центра химотрипсина

Активный центр и субстрат химотрипсина Активный центр химотрипсина Субстрат (полипептид ) Гидрофобный карман Активный центр карман для оксианиона

Стадия 1: образование комплекса ES комплекс Взаимодействие Ser 195 и His 57 приводит к образованию сильного нуклеофила (электронная пара кислорода), который атакует карбонильную группу пептида, образуя тетраэдрический ацил- фермент. На атоме кислорода карбонильной группы сосредотачивается короткоживущий отрицательный заряд, который стабилизируется атомами Н от NH групп Gly 193 и Ser 195

Стадия 2: освобождение продукта 1 Освобождение первого продукта Нестабильность, обусловленная наличием заряда на карбонильном кислороде субстрата, приводит к распаду тетраэдрического комп- лекса с восстановлением двойной связи кислорода с углеродом и разрыву пептидной связи. Уходящая иминогруппа протонируется His 57. Продукт 1 См. следующий слайд

Стадия 3: образование ацилфермента Ацилированный фермент После ухода первого продукта оставшаяся часть полипептидной цепи остается связан- ной с Ser 195 ковалент- ной связью (ацил- фермент).

Стадия 4: связывание воды Приходящая молекула воды депротонируется за счет взаимодействия с His 57, образуя нуклео- фильный гидроксид-ион. Этот ион атакует эфирную связь ацилфермента: об- разуется второй тетраэд- рический интермедиат с кислородом, несущим отрицательный заряд

Стадия 5: деацилирование При распаде второго ин- термедиата об- разуется второй продукт, карбогидрат- анион, и Н от Нis 57 перемещается к Ser 195.

Стадия 6: образование комплекса фермент-продукт и освобождение продукта Комплекс фермент-продукт Продукт 2 После освобожде- ния второго про- дукта происходит регенеция свобод- ного фермента