1 МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ОЦЕНКИ НЕОПРЕДЕЛЕННОСТИ В КАЧЕСТВЕННОМ АНАЛИЗЕ В.И.Вершинин Россия, Омск, Омский государственный университет, кафедра аналитической химии univer.omsk.su

Предпосылки повышенного внимания к метрологии качественного анализа на рубеже ХХ-XXI веков 1) Резкий рост числа объектов обнаружения, особенно органических. Необходимость надежного экспрессного обнаружения супертоксикантов, лекарственных препаратов, допинга, наркотиков, взрывчатых веществ и т.п., в том числе с применением тест-методов. 2) Развитие инструментальных методов, ведущее к ситуациям, когда ошибки анализа обусловлены не процессом измерения сигнала или градуировки, а неверной идентифи- кацией компонентов пробы. 3) Компьютеризация анализа, создание больших баз данных по свойствам веществ и, на их основе, развитие систем компьютерной идентификации (СКИ). 2

Методы анализа, в которых применяют системы компьютерной идентификации (СКИ) Газовая хроматография Анализ бензинов, растворителей, пищевых продуктов и др. Жидкостная хроматография Определение пестицидов, наркотиков, анализ лекарственных препаратов и др. Хромато-масс-спектрометрия Анализ пищевых продуктов и др. Масс-спектрометрия, ЯМР Идентификация продуктов лабораторного органического синтеза Спектрофлуориметрия Обнаружение ПАУ и нитрозаминов Атомно-эмиссионный Анализ сточных вод и др. спектральный (ICP) ИК-спектрометрия Анализ лекарственных препаратов и др. Рентгенофазовый Анализ минерального сырья и др. Рентгенофлуоресцентный Анализ минерального сырья и др. Иммуноанализ Анализ биологических объектов 3

Пример выдачи на печать результатов работы системы компьютерной идентификации (СКИ) при хроматографическом анализе бензина по ASTM 5134 Peak t I I x Name % 3733,975741,1741,3 3,3 - dimethylhexane 0, ,718755,3 Toluene 11, ,944756,4 ? unidentified 0, ,367760,6760,2 2,3 - dimethylhexane 0, ,541762,0762,1 3- ethyl methylpentane 0,078 t – время удерживания, минуты I – индекс Ковача для опознаваемого пика пробы, I x - индекс Ковача для пика X i в БД, d - критерий совпадения пиков, здесь - 0,5 единицы индекса % - содержание компонента ( в % масс.). 4

Некоторые отечественные публикации в области метрологии качественного анализа Комарь Н.П. Основы качественного химического анализа. Харьков Бугаевский А.А. и др. Зав.лаборатория. Т.42, 1, с Вершинин В.И., Топчий В.А. и др. ЖАХ. Т.42, с – Зенкевич И.Г. и др. ЖАХ. Т.50, 2, с – Мильман Б.Л., Конопелько Л.А. Зав.лаборатория Т.65, Milman B.L., Konopelko L.A. Fresenius J.Anal.Chem. V.367, p Вершинин В.И., Дерендяев Б.Г., Лебедев К.С. Компьютерная идентификация органических соединений. М., Академкнига. 197 с – Решетняк Е.А. и др. Вестник ХНУ.Вып.596, 10. с – Островская В.М., Решетняк Е.А. и др. ЖАХ, т.59, 10, с – Мильман Б.Л., Конопелько Л.А. ЖАХ, т.59, 12, с

Некоторые зарубежные публикации в области метрологии качественного анализа McLafferty F.W. Interpretation of mass-spectra. Reading (USA) de Ruig W.G., Dijkstra G., e.a. Anal. Chim. Acta. V.223, p Ferrara E., Tedeschi L., e.a. J. Anal. Toxicol. V.18, p Ellison S.L.R., Gregory S., Hardcastle W. Analyst. V.123, p – Hartstra J., Franke J., e.a. J.Chromatogr. A V.30, 4, P Valcarsel M., Cardenas S., e.a. Metrology of Qualitative Chemical Analysis. Luxembourg. 166 p Bremser W. e.a. Uncertainty in Semi-Qualitative Testing. Berlin Rios A., Barselo D., e.a. ACQUAL. V.8, 2, P.68 6

Рабочая группа Eurachem / CITAC по метрологии качественного анализа Ellison S. (Великобритания) – председатель Salit M. (США), Bremser W. (Германия) Kuselman I. (Израиль) Ferrara E. (Италия), Suchanek M.(Чехия), Pikkarainen A.L.(Финляндия) и др. Принятый документ: QAWG/03/06 Eurachem/CITAC Guide: The Expression of Uncertainty in Qualitative Testing (September 2003) Содержание документа: постановка проблемы, обзор методологических подходов к оценке неопределенности в качественном анализе, рекомендации по терминологии, обсуждение алгоритмов оценки достоверности идентификации, примеры метрологических оценок при идентификации веществ в масс-спектрометрии, в ИК-спектроскопии, в иммуноанализе. 7

Предпосылки повышенного внимания к метрологии качественного анализа на рубеже ХХ-XXI веков 4) Возникновение в метрологии концепции неопределенностей, более общей, чем концепция погрешностей. В рамках этой концепции возможна оценка неопределенности идентификации с помощью вероятностных алгоритмов. Необходимо по отдельности рассчитать обе составляющие неопределенности: α - вероятность ложной идентификации отсутствующего вещества β - вероятность необнаружения реально присутствующего вещества Возможны как статистические (апостериорные, эмпирические) так и априорные оценки неопределенности результатов качественного анализа. 8

Максимально допустимые уровни составляющих неопределенности для методик разного типа Тип методики Вероятность ложного результата положительного (α)отрицательного (β) Скрининг < 0,2< Подтверждающая < Референтная < < Снижения α и β до нужной степени можно достичь, применяя одновременно m независимых идентификационных признаков. В этом случае α m и β m рассчитывают по формулам Байеса или Бернулли.

Возможные подходы к метрологической оценке неопределенности в качественном анализе 1. Статистические оценки Используют N образцов известного состава, из которых N1 не содержат Х, а N2 – содержат Х. С учетом критериев идентификации рассчитывают: частоту ложной идентификации Х (false positive rates, FPR, ПЛП) и частоту необнаружения Х, когда он присутствует (false negatives rates, FNR, ЛО). Если в FP случаях ответ положителен и неправилен, в TN случаях – ответ отрицателен и правилен, в TP - ответ положителен и правилен, в FN - ответ отрицателен и неправилен: тогда α FPR = FP / (FP+TN) β FNR = FN / (TP + FN) Для 200 проб, не содержащих Х, получено 8 положительных и 192 отрицательных ответа. Для 300 проб, содержащих Х, получено 297 положительных и 3 отрицательных ответа: α 8 / (8 +192) = 0,04 β 3 / ( ) = 0,01 10

Реализация статистического подхода Ожидаемая вероятность ложных идентификаций Минимальное число анализируемых проб (N1) для обеспечения заданного уровня надежности (P) при аттестации методики P = 95%P = 99% 0, , , Считают, что FPR и FNR – случайные величины, имеющие биномиальное распределение. Тогда о бъем исследуемой выборки «холостых» проб ( N1 ) при оценке α по единичному признаку должен с надежностью P обеспечить появление хотя бы одной ошибки. При оценке β величина N2 имеет тот же порядок, что и N1. 11 Отсутствие ложных идентификаций при испытании 59 «холостых» проб доказывает, что α < 0,05 (P = 0,95). Чем надежнее методика идентификации - тем труднее оценить ее неопределенность!

12 Связь неопределенности идентификации с концентрацией аналита М 1 - вероятность необнаружения М (β ), 2 – вероятность обнаружения М. Обнаружение тяжелых металлов с применением тест-метода По данным Е.А.Решетняк и соавторов (2003)

Преимущества и ограничения статистических оценок неопределенности в качественном анализе Алгоритмы статистической оценки неопределенности: универсальны, объективны, просты; хорошо отработаны в клиническом анализе; пригодны для характеристики бинарных тест-методов; применимы для достоверного определения пределов обнаружения; не требуют информации о характере распределения экспериментальных данных и о факторах, ведущих к идентификационным ошибкам. трудоемки и длительны; требуют либо наличия множества эталонов известного состава, либо наличия референтной методики качественного анализа Поэтому статистические оценки следует применять для метрологической аттестации методик анализа, но не для создания или оптимизации работы СКИ. 13

Возможные подходы к метрологической оценке неопределенности в качественном анализе 2. Априорные оценки И сследуют характер распределения экспериментальных данных, выявляют факторы, приводящие к идентификационным ошибкам, оценивают неопределенность исходных данных. Значения α и β рассчитывают априорно – с учетом критериев идентификации. Полученные оценки позволяют: быстро судить о достоверности идентификации; оптимизировать методики анализа и подбирать критерии идентификации; рассчитывать пределы обнаружения компонентов; не требуют стандартных образцов состава или референтных методик; пригодны для оптимизации работы СКИ любого типа. Однако априорные оценки: не универсальны (непригодны для визуальных методов); зависят от выбора модели, то есть в какой-то степени субъективны; позволяют оценить лишь нижний предел неопределенности; алгоритмы оценки должны создаваться отдельно для каждого метода. 14

Модель для априорной оценки неопределенности в качественном хроматографическом анализе Концентрации всех компонентов пробы (Х) выше, чем их пределы обнаружения с данным детектором. Все пики на хроматограмме хорошо разрешены, положение пика определяется только характеристикой удерживания (t). t – нормально распределенная случайная величина с известным стандартным отклонением. Значения для всех пиков близки. Математическое ожидание каждого t совпадает с константой t x в БД ( нет систематических расхождений между измеренными и табличными значениями характеристик удерживания Х). БД включает значения t x для всех предполагаемых компонентов пробы и не содержит совпадающих t x для разных Х. В рамках этой модели и ложные идентификации, и необнаружение присутствующих компонентов определяются лишь случайными сдвигами пиков на хроматограмме пробы (неопределенностью t ). 15

Алгоритм расчета составляющих неопределенности в рамках данной модели 1)Если случайный сдвиг пика X из «окна» (t x - d, t x + d) - единственная возможная причина необнаружения Х, тогда = Ф(d/ ) 2) Если случайный сдвиг пика другого компонента пробы (Y) в указанное окно – единственная возможная причина ложной идентификации Х, то В приведенных формулах - стандартное отклонение случайной величины t; Ф – функция Лапласа; 1 and 2 - оценки селективности t x в используемой БД; 1 = t x – t Y1 2 = t Y2 - t x d – критерий совпадения пиков. Вещества Y 1 и Y 2 - ближайшие к Х по характеристике t, причем t Y2 > t x > t Y1. 16

17 Оптимизация критерия d при опознании веществ с разной селективностью характеристик удерживания 1 -, 2,3,4 - 1 = 2 = 3 (2), 1 = 2 = 5 (3), 1 = 2 = 10 (4); Если при - const критерий d 0, 1, 0; если же d, тогда 1, 0. Оптимальное значение d = 3

Число веществ, соответствующих единичному пику на хроматограмме, при разных режимах работы СКИ ( оптимизация критерия совпадения пиков ) ПикВремя удерживания, мин. Число опознанных веществ для разных значений критерия d d = d=3 d=5 d = 10 d = , , , , Однозначность идентификации достигается при d 3 18

Априорная оценка неопределенности идентификации индивидуальных углеводородов при хроматографическом анализе бензина с помощью СКИ ПикtIIxIx Name % 3733,975741,1741,33,3 - dimethylhexane 0,610,22 0, ,718755,3 toluene 0, 020,21 11, ,944756,4unidentified0, ,367760,6760,22,3 - dimethylhexane 0,140,21 0, ,541762,0762,13-ethyl –2 -methylpentane 0,030,24 0,078 - вероятность случайной ложной идентификации данного вещества (в рамках выбранной модели); - вероятность случайного необнаружения данного вещества при повторном проведении анализа той же пробы по той же методике, 19

Алгоритм обратного поиска при работе систем компьютерной идентификации (СКИ) 1.Ввод данных ( спектра или хроматограммы пробы ); 2.Сравнение по единичному признаку : 3.признак образца сравнения (вещества Х из БД) сопоставляется с признаками пробы (с учетом критерия d); 4.Регистрация и подсчет совпадений. Повторение операции 2 для всех N признаков Х, обнаружение n совпадений; 5.Расчет сигнала присутствия Х в пробе (в простейшем случае сигнал S=n); 6.Повторение операций 2-4 для всех M предполагаемых компонентов робы; 7.Сравнение сигналов с заранее выбранным критерием К. При S > K вещество Х считается опознанным, при S K отбраковывается; 8.Формирование списка опознанных веществ, ранжированного по S; 9.Вычисление количественного содержания опознанных компонентов пробы (лишь в некоторых СКИ). 10.Выдача результатов пользователю. 20

Дополнительные операции, возможные для СКИ, в которых используются алгоритмы априорной оценки неопределенности 1. Автоматическое вычисление значений критериев - отдельно для каждого предполагаемого компонента пробы, с учетом допустимой вероятности случайных ошибок идентификации 2. Оценка достоверности идентификации каждого опознанного компонента пробы и сообщение этой информации пользова- телю СКИ (в виде и по отдельности, либо их суммы). 21

Оценка неопределенности для методик анализа, включающих n единичных испытаний (в разных условиях) n n n P = n + n 10,20,200,40 20,040,490,53 5

Оценка n для методов, основанных на подсчете количества спектральных совпадений пробы и эталона Модель предполагает равную точность измерения длин волн в интервале ( 1, 2 ), где спектр пробы содержит M линий, а спектр эталона X - N линий. Критерий совпадения d = одинаков для всех линий. Условие идентификации – реальное число совпадений больше заданного критерия K. Вероятность случайного совпадения одной линии в спектре пробы и какой-либо из линий эталонного спектра: Вероятность одновременного случайного совпадения n линий в спектре пробы с линиями эталонного спектра вычисляется по формулам Бернулли: Вероятность случайного совпадения спектров пробы и эталона более, чем по К линиям : n - искомая оценка вероятности случайной ложной идентификации для любого целочисленного К. 23

Расчет критерия идентификации в спектральном анализе где t кр находят из условия Г(t) = 1- n, где Г (t) - интеграл Гаусса. Так, для n = 0,05 t кр =1,65. Пример: в спектре пробы 40, а в спектре эталона Х - 20 линий. Оба спектры сняты в интервале шириной нм. Округленные значения критерия n кр, обеспечивающие n < 0,05, при разной точности измерения длин волн равны:, нм n кр 0,010,0021 0,050,0102 0,200, Для снижения n до желаемого уровня рекомендуется критерий: При постоянной величине значения n кр для разных веществ должны быть различны, чтобы обеспечить одну и ту же заданную надежность идентификации. Причина – разное число линий в эталонных спектрах разных веществ (разные N).

Результаты компьютерного качественного анализа бинарной смеси ПАУ Расшифровка спектра низкотемпературной люминесценции пробы. Компонент XNnK = n крит Фенантрен Трифенилен Хризен (?) 1443 N - число линий в эталонном спектре Х; n - число линий Х, обнаруженных (d = 0,1 нм) в спектре пробы, K (или n крит ) – оптимизированный критерий идентификации, рассчитанный для n = 0,05; Названия действительно присутствующих (10 -7 г/мл ) компонентов подчеркнуты. 197 предполагаемых компонентов, для которых наблюдались совпадения линий, но у которых n 0,05 ), - отбракованы. 1325

Идентификация индивидуальных ПАУ в 12-компонентной модельной смеси в условиях спектрального фракционирования 26

Некоторые нерешенные проблемы метрологии качественного анализа В рамках статистического подхода: унификация терминологии и вычислительных алгоритмов, разработка специальных стандартных образцов, создание алгоритмов для оценки пределов обнаружения с учетом, создание алгоритмов для оптимизации критериев идентификации. В рамках априорного подхода: создание обоснованных теоретических моделей, исследование бюджета неопределенности, учет селективности поисковых признаков Наиболее перспективным направлением исследований представляется постепенное сближение обоих подходов 27

28 Основные публикации автора по теме доклада 1)Вершинин В.И., Топчий В.А., Наумов С.Е. Число спектральных совпадений как критерий идентификации компонентов пробы. Ж.аналит.химии Т.42, 5, с )Вершинин В.И. Методология компьютерной идентификации веществ с применением информационно-поисковых систем. Ж.аналит.химии. 2000, Т.55, 5, С )Соколова О.В., Ильичева Н.Б., Вершинин В.И. Достоверность компьютерной идентификации углеводородов при хроматографическом анализе бензинов. Аналитика и контроль. 2000, 4, с )Вершинин В.И., Топчий В.А., Медведовская И.И. Критерии совпадения пиков в качественном хроматографическом анализе. Ж.аналит.химии. 2001, Т.56, 4, с )Вершинин В.И., Дерендяев Б.Г., Лебедев К.С. Компьютерная идентификация органических соединений M. Академкнига, 197 с. 6)Медведовская И.И., Вершинин В.И. Сходимость характеристик удерживания как условие достоверной идентификации. Зав.лаборатория Т.70, 7, с.18. 7)Vershinin V.I. A priori method of evaluating uncertainties in qualitative chromatographic analysis:(probabilistic approach). Accreditation and Quality Assurance V.9, 7.P.415 – 418.