«ГАЗОВАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ В СОЧЕТАНИИ С МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИМ ДЕТЕКТИРОВАНИЕМ КАК НОВЫЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОСНОВНЫХ МЕТАБОЛИТОВ АДРЕНАЛИНА, НОРАДРЕНАЛИНА, ДОФАМИНА И СЕРОТОНИНА У БОЛЬНЫХ НАРКОМАНИЯМИ». ГОУ ВПО Российский государственный медицинский университет, кафедра «Клинической лабораторной диагностики ФУВ» Глаговский Павел Борисович

Введение в масс-спектрометрию «Масс спектрометрия» - метод определения молекулярной массы вещества В основе его лежит исследование движения заряженных частиц (ионов) анализируемого вещества под воздействием электрического или магнитного полей Он широко используется в медицине, исследованиях окружающей среды, сельском хозяйстве, нефтяной промышленности, металлургии, археологии и других областях

Блок-схема основных частей масс-спектрометра

Прямой ввод парообразных образцов Газовая хроматография Жидкостная хроматография Прямой ввод (DIP) Прямая ионизация объекта исследования Система ввода образца основные типы

Методы ионизации Все методы ионизации нейтральных незаряженных молекул анализируемого вещества делятся на две группы: – –Методы, приводящие к потере молекулой электрона и образованию иона (М + ) (электронный удар) – –Методы, в результате химических реакций приводящие к образованию ассоциата нейтральной молекулы анализируемого вещества и заряженного аниона, чаще всего, протона (МН + ) (химическая ионизация)

Масс анализатор Основной задачей масс анализатора является разделение ионов, образовавшихся в источнике ионов из анализируемого вещества, в соответствии с их зарядом (отношением масс к заряду, m/z) и доставке их к детектору. Основными характеристиками масс анализатора считаются: – –Разрешающая способность – –Динамический диапазон масс – –Быстродействие – –Предел обнаружения Масс анализаторы делятся на две категории: – –Постоянного типа действия (квадрупольные и магнитные) – –Пульсационные (времяпролетные, спектрометры ионного циклотронного резонанса, квадрупольные типа «ионная» ловушка)

Детектор масс В масс спектрометрии применяются детекторы заряда или движения. В современных приборах используют фото- или электроноумножители, многоканальные детекторы Некоторые современные детекторы способны обнаруживать сигнал одиночных ионов вещества

Система обработки данных

Объект исследования: Суточная моча больных различными видами наркоманий с абстинентным синдромом клиники Национального научного центра Наркологии Росздрава. контрольная группа больных героиновой наркоманией больных амфетаминовой наркоманией

Методы исследования: Исследование образцов суточной мочи производилось 2 методами: 1.Метод газовой хроматографии – масспектрометрии (ГХ-МС) 2.Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)

Методы исследования: Газовая хроматография масс-спектрометрия (ГХ-МС) Прибор – GC-MS Shimadzu QP5050A

Методы исследования: Высокоэфективная жидкостная хроматография Прибор – Shimadzu LC 10 Avp

Терминология Ванилилминдальная кислота (VМА) - основной метаболит адреналина и норадреналина Ванилилминдальная кислота (VМА) - основной метаболит адреналина и норадреналина Гомованилиновая кислота (НVА) - основной метаболит дофамина. Гомованилиновая кислота (НVА) - основной метаболит дофамина. 5-гидроксииндолуксусная кислота (5-НIАА) - основной метаболит серотонина. 5-гидроксииндолуксусная кислота (5-НIАА) - основной метаболит серотонина.

Метаболизм катехоламинов: Тирозин Гидроксилаза ДОФА-дкарбоксилаза Дофамин-бета-гидроксилаза Фенилэтаноламин- N-метилтрасфераза Дигидрокси Фенилаланин (ДОФА)

N C N CNH 2 COOH NH 2 OH N CNH 2 OH H АК - Триптофан5-гидрокситриптофан Серотонин (5-Гидрокситриптамин) N CCOOH 5-OH Индол Ацетальдегид 5-ГидроксиИндол Уксусная кислота (5-HIAA) Триптофан гидроксилаза 5-OH Триптофан декарбоксилаза+ вит В6 (пиридоксин) MAO Альдегиддегидрогиназа Метаболизм серотонина:

Cлева нормальный режим работы дофаминергического терминала, справа в присутствии амфетамина: везикулы опустошаются, везикулярный выброс дофамина уменьшается, содержимое везикул выбрасывается в цитоплазму и далее в синаптическую щель. DAT дофаминовый транспортер, VMAT везикулярный транспортер моноаминов.дофаминергическоговезикулярный транспортер моноаминов Механизм стимулирующего действия амфетамина и его аналогов.амфетамина

Таким образом При первичных пробах наркотических веществ происходит активация системы положительного подкрепления, которая, в первую очередь, проявляется в быстрых рецепторных и метаболических изменениях, в основном в системах моноаминов и опиоидов. По-видимому, эти изменения и приводят к формированию патологического влечения. При длительном употреблении наркотиков может развиться дефицит нейромедиаторов, сам по себе угрожающий жизнедеятельности организма. В качестве механизма компенсации этого явления выступают усиленный синтез катехоламинов и подавление активности ферментов их метаболизма, в первую очередь моноаминоксидазы и дофамин-b-гидроксилазы, контролирующих превращение дофамина в норадреналин. Таким образом, стимулируемый очередным приемом наркотиков выброс катехоламинов и их ускоренное, избыточное разрушение сочетаются с компенсаторно-усиленным синтезом этих нейромедиаторов. Формируется ускоренный кругооборот катехоламинов. Теперь при прекращении приема наркотика, т.е. при абстиненции, усиленного высвобождения катехоламинов из депо не происходит, но сохраняется их ускоренный синтез. Вследствие изменения активности ферментов в биологических жидкостях и тканях (главным образом в мозге) накапливается дофамин. Именно этот процесс обусловливает развитие основных клинических признаков абстинентного синдрома - высокой тревожности, напряженности, возбуждения, подъема артериального давления, учащения пульса, появления других вегетативных расстройств, нарушения сна и др. Иными словами, описанные выше изменения нейрохимических функций мозга формируют физическую зависимость от наркотических препаратов.

Уровень дофамина в крови четко коррелирует с клинической тяжестью абстинентного синдрома: в начальном ее периоде он несколько повышен, затем, как правило, опускается ниже нормы. Очевидно, дефицит дофамина в структурах мозга, связанных с подкреплением, является основой остающегося патологического влечения к наркотикам и высокой вероятности рецидива заболевания. Действие дофамина и серотонина связано с настроением, эмоциями, мотивациями, целенаправленным поведением, вниманием, процессом мышления перед тем, как что-то делать... Если обмен серотонина нарушен, изменен баланс серотонина и дофамина, все эти важнейшие психические функции пострадают, а организм начнет искать способ устранить неприятные ощущения: возникнет тяга к алкоголю, наркотикам, сладостям, сигаретам... Разными биохимическими путями никотин, наркотики, алкоголь, глюкоза могут на время снизить или даже полностью компенсировать эмоциональное напряжение, плохое настроение, отвлечь от ощущения невозможности достичь какой-то цели; и здоровые люди на себе это испытывали.

Пример хроматограммы суточной мочи пациентов методом ГХ-МС:

Пример полученных результатов (ГХ-МС):

Пример хроматограммы суточной мочи пациентов методом ВЭЖХ:

Полученные данные показывают четкое отличие содержания метаболитов катехоламинов у здоровых и больных наркоманией. Полученные результаты

При ургентном состоянии пациентов (с абстинентным синдромом) с амфетаминовой наркоманией средняя концентрация метаболитов ГВК, ВМК и 5-HIAA, определённая методом ГХ-МС и ВЭЖХ, оказалась статистически выше, чем в контрольной группе. Полученные результаты

У пациентов с героиновой наркоманией (с синдромом отмены) средняя концентрация метаболита ГВК, определённая методом ГХ-МС и ВЭЖХ, статистически значимо была выше, чем в контрольной выборке. Концентрация метаболитов ВМК и 5-ГИУК не отличалась. Полученные результаты

Коэффициент корреляции r=0.99, p

Полученные результаты МетаболитСредний разброс значений, ±мг/cут ГХ-МСВЭЖХ ВМК0,020,5 ГВК0,030,7 5-ГИУК0,030,9 Для метода ВЭЖХ разброс значений при измерениях концентраций метаболитов катехоламинов и серотонина (пересчитанный в мг/сут) составляет десятые доли, а для метода ГХ-МС – сотые доли, что говорит о том, что метод ГХ-МС на порядок точнее метода ВЭЖХ. Таким образом, для точной диагностики различных наркоманий путём измерения динамики концентраций метаболитов катехоламинов и серотонина предпочтителен метод ГХ-МС.

Выводы 1. В ходе исследования были подобраны оптимальные условия для одновременного определения основных метаболитов катехоламинов и серотонина (гомованилиновая, ванилилминдальная и 5- гидроксииндолусксная кислоты) методами ВЭЖХ и ГХ-МС. 2. Полученные данные показывают четкое отличие содержания метаболитов катехоламинов у здоровых и больных наркоманией. 3. При ургентном состоянии пациентов с амфетаминовой наркоманией средняя концентрация метаболитов ГВК, ВМК и 5-HIAA, определённая методом ГХ-МС и ВЭЖХ, оказалась статистически выше, чем в контрольной группе. 4. У пациентов с героиновой наркоманией (с синдромом отмены) средняя концентрация метаболита ГВК, определённая методом ГХ- МС и ВЭЖХ, статистически значимо была выше, чем в контрольной выборке. Концентрация метаболитов ВМК и 5-ГИУК не отличалась.

Выводы 5. Сравнительный анализ методов ВЭЖХ и ГХ-МС для определения метаболитов катехоламинов и серотонина при различных типах наркоманий выявил преимущество метода газовой хроматографии с масс-селективным детектором (ГХ-МС). 6. Для объективной оценки состояния симпатоадреналовой системы целесообразно проводить анализ содержания основных метаболитов катехоламинов и серотонина у ургентных больных с наркотической зависимостью (с синдромом отмены)

Основные сферы применения в других областях медицины Основные сферы применения: Эндокринология. Диагностика феохромоцитом (VМА) и нейробластом (VМА и НVА) - опухолей, проявляющихся артериальной гипертензией. При этом экскреция метаболитов возрастает в 4-10 раз. Кардиология. Установление вероятных причин артериальной гипертензии и гипотензии, недостаточности кровообращения, нарушений ритма сердца, стенокардии и инфаркта миокарда. Гастроэнтерология. Демпинг-синдром, дискинезии желчных путей и кишечника.

Основные сферы применения (продолжение): Неврология Диагностика нейробластом у детей (в Японии скрининг на нейробластому является обязательным у всех новорожденных), нейрохимические нарушения при паркинсонизме (НVА), экстрапирамидных гиперкинезах (НVА и VМА), мигрени и других нарушениях мозгового кровообращения (VМА, НVА и 5-НIАА), гипоталамическом синдроме, миоклонической эпилепсии (5-HIAA) и судорогах неясной этиологии. Онкология. Злокачественные опухоли желудочно-кишечного тракта, особенно с метастазами злокачественного карциноида в печень (серотонин и 5-HIАА являются маркерами злокачественности). Психиатрия. Психические депрессии (VМА и 5-HIAA), контроль за эффективностью терапии антидепрессантами (VМА и 5-HIAA) и нейролептиками.