Тема Методы выделения и очистки ферментов

План Методы выделения ферментов Получение ферментов Разрушение клеток и экстракция Фракционирование и очистка белков Фракционирование солями Высаливание Электрофорез Диализ Хромотаграфия

Получение ферментов. Обычно ферменты вьделяют из тканей животных, растений, клеток и культуральных жидкостей микроорганизмов, биол. жидкостейтканейклетокжидкостей микроорганизмовбиол жидкостей

Способы разрушения клеток можно разделить на следующие группы: 1. Мягкое воздействие, которое включает лизис клеток с помощью осмотического шока, разрушение под действием ферментов(лизоцима идр.), химическую солюбилизацию (например, экстракция дрожжей толуолом, при которой частично растворяется клеточная стенка), гомогенизацию вручную (клетки продавливают через зазор). 2. Воздействие средней силы, при котором используют лопастной гомогенизатор или растирание с абразивом (песком,стеклянными шариками).

Пробирка с диспергирующим элементом (ротор-статор ) гомогенизация тканей белкового происхождения

Сильное воздействие 3. Сильное воздействие с помощью пресса, ультразвука или шаровой мельницы. Выбор раствора для экстракции зависит от особенностей исследуемого белка. Для растворимого белка используют буферные растворы.Обычно объем раствора в 2–3 раза превышает объем

Центрифугирование

Экстракция Экстракция разделение смеси веществ на основе различий в растворимости. О том, что растворимость веществ в разных растворителях различна, хозяйки хорошо знают на примере ванилина, который плохо растворим в воде и хорошо в спирте. При жидкостной экстракции происходит распределение растворённого вещества между двумя жидкими несмешивающимися фазами. Обычно одна фаза это вода, а другая органический растворитель

Фракционирование и очистка белков После достижения полной экстракции белков, т.е. перевода белков в растворенное состояние, приступают к разделению – фракционированию смеси белков на индивидуальные белки. Для этого применяют разнообразные методы: высаливание, тепловую денатурацию, осаждение органическими растворителями, хроматографию, электрофорез, распределение в двухфазных системах, кристаллизацию

Фракционирование солями Метод фракционирования солями очень широко используется приочистке ферментов. Различные белки выпадают в осадок при разной концентрации соли в растворе. Постепенно повышая концентрацию, можнополучить ряд отдельных фракций с преимущественным содержанием выделяемого фермента в одной из них. Наиболее часто для фракционирования белковых смесей употребляют сульфат аммония.

Высаливание Высаливанием белков обычно пользуются в клинической практике при анализе белков сыворотки крови и других биологических жидкостей, а также в препаративной энзимологии для предварительного осаждения и удаления балластных белков или выделения исследуемого фермента. Используя различие в растворимости, можно с помощью обычных солей, например (NН4)2SО4, разделить (фракционировать) смесь белков.

Электрофорез Электрофорез занимает центральное место среди методов исследования белков Метод позволяет разделять макромолекулы, различающиеся по таким важнейшим параметрам, как размеры (или молекулярная масса), пространственная конфигурация, вторичная структура иэлектрический заряд, причем эти параметры могут выступать как порознь,так и в совокупности.

Для характеристики электрофоретической подвижности белков в данных условиях электрофореза принято указывать отношение расстояния,пройденного белковой полосой от начала рабочего геля, к аналогичномурасстоянию до полосы красителя в этом же геле. Это отношение, как и вхроматографии, обозначают Rf.

Диализ Для отделения низкомолекулярных примесей или замены состава среды используют диализ. Метод основан на том, что молекулы белка из-за своих размеров не могут проходить через полупроницаемые мембраны, в то время как низкомолекулярные вещества равномерно распределяются между объемом, ограниченным мембраной, и окружающим раствором. После многократной замены внешнего раствора состав среды в диализном мешочке (концентрация солей, величина pH и др.) будет тот же, что и в окружающем растворе.

. Хроматографические методы анализа. Хроматография Хроматография (от греч. chroma, chromatos - цвет, краска), физико- химический метод разделения и анализа смесей, основанный на распределении их компонентов между двумя фазами - неподвижной и подвижной (элюент), протекающей через неподвижную.

История метода: Хроматографический метод анализа был впервые применён русским учёным-ботаником Михаилом Семеновичем Цветом в 1900 году. Он использовал колонку, заполненную карбонатом кальция для разделения пигментов растительного происхождения. Первое сообщение о разработке метода хроматографии было сделано Цветом 30 декабря 1901 года на XI Съезде естествоиспытателей и врачей в С.-Петербурге. Первая печатная работа по хроматографии была опубликована в 1903 году, в журнале Труды Варшавского общества естествоиспытателей. Впервые термин хроматография появился в двух печатных работах Цвета в 1906 году, опубликованных в немецком журнале Berichte der Deutschen Botanischen Gesellschaft. В 1907 году Цвет демонстрирует Немецкому Ботаническому обществу образец хроматографа прибора для осуществления процесса хроматографии. В годы метод был незаслуженно забыт и практически не развивался. В 1952 году Дж. Мартину и Р. Синджу была присуждена Нобелевская премия по химии за создание метода распределительной хроматографии. С середины 20 века и до наших дней хроматография интенсивно развивалась и стала одним из наиболее широко применяемых методов анализа.

Ионообменная хроматография позволяет разделить молекулы, основываясь на ионных взаимодействиях. Неподвижная фаза имеет заряженные функциональные группы, которые взаимодействуют с анализируемыми ионизированными молекулами противоположного заряда. Этот вариант хроматографии классифицируется на два типа катионную и анионную ионообменную хроматографию: Ионообменная хроматография.

Катионная ионообменная хроматография задерживает положительно заряженные катионы, так как неподвижная фаза имеет отрицательно заряженные функциональные группы, например, фосфат (PO43). Анионная ионообменная хроматография задерживает отрицательно заряженные анионы, так как неподвижная фаза имеет положительно заряженные функциональные группы, например, +N(R)4.

Аффинная хроматография Аффинная хроматография (хроматография по сродству). Основана аффинная хроматография на принципе избирательного взаимодействия белков (или других макромолекул) с закрепленными (иммобилизованными) на носителе специфическими веществами – лигандами, которыми могут быть субстраты или коферменты (когда выделяют какой-либо фермент), антигены (или антитела), гормоны или рецепторы и т. д.

Гель-хроматография В препаративных целях, особенно при очистке белков от примесей, широко используют метод молекулярных сит, или гель- хроматографию. При обработке эпихлоргидрином полисахарида дек- страна образуются различной степени выраженности поперечные связи, приводящие к формированию крупных гидрофильных зерен, нерастворимых в воде и называемых сефадексами.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот / Л.А. Остерман. – М. : Наука, – 536 с.2. Практикум по биохимии / под ред. С.Е. Северина, Г.А. Соловьевой. – М. : Изд-во МГУ, – 509 с.3. Практикум по биохимии растений / С.М. Щипарев [и др.]. – СПб. : Изд-во СПб. ун-та, – 200 с.4. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии / Г.А. Ко- четов. – М. : Высш. шк., – 272 с.5. Клиническая биохимия / В.Н. Бочков [и др.]. – М. : Изд-во МГУ, – 506 с.6. Чиркин А.А. Практикум по биохимии / А.А. Чиркин. – Минск : Новое знание, – 512 с.7. Пустовалова Л.М. Практикум по биохимии / Л.М. Пустовалова. – Ростов н/Д. : Феникс, – 540 с.