Прямое и косвенное действие ионизирующих излучений Непрямое действие излучения Радиолиз воды и его продукты Инактивация макромолекул в растворах Зависимости «доза-эффект», их анализ Эффект свидетеля Формальные модели лучевого поражения Теория мишени Объяснение парадокса радиобиологии Стохастическая теория

Прямое действие ионизирующих излучений - изменения, которые возникают в результате утери или приобретения электрона молекулами - «мишенями» 1 - схема прямого действия 2 - схема непрямого действия излучения Н2О Н + OH 12 Диффузия свободных радикалов к мишеням Непрямое (косвенное) действие ионизирующих излучений - изменения молекул- «мишеней», вызванные продуктами радиолиза окружающей их воды (или др. вещества, напр. лип.) и растворенных низкомолекулярных соединений Молекула-мишень

Вода – важнейшее составляющее живого вещества вещество% от массы тела В организме в целом60 (50-70) В тканях: жировых20 костных25 печени70 мышечных75 крови79 мозга85 лимфы96 Вода в организме человека В организме человека: Доля белков – 19%, жиров – 15%, минералов – 5%, углеводов – 1%

Взаимодействие нейтронов с веществом: 1)Упругое рассеяние (для быстрых нейтронов) – в результате соударения нейтрона с ядром атома кинетическая энергия нейтрона распределяется между ним и «ядром отдачи». Чем меньше масса ядра, тем больше энергии оно получит (водород). 2)Неупругое рассеяние (при энергии больше нескольких кэВ) 3)Радиационный (нейтронный) захват (для медленных нейтронов,

РАДИОЛИЗ (от-лат. radio - излучаю и греч. lysis - разложение, распад), хим. процессы деструктивного характера, протекающие при поглощении веществом энергии ионизирующего излучения. Радиолиз воды – диссоциация молекул воды под действием ИИ - наиболее важная из всех изученных радиохимических реакций Предыстория Вода являлась наиболее удобным охладителем. Основной продукт разложения воды в активной зоне реактора - гремучий газ (смесь двух объемов водорода и одного объема кислорода) - взрывчатое вещество огромной силы Поэтому перед учеными была поставлена задача - изучить радиолиз воды и различных водных растворов и найти способы уменьшения образования гремучей смеси при облучении.

Радиолиз воды и его продукты Н 2 О H 2 O + +e - молекула воды ионизируется, теряя электрон H 2 O + + Н 2 О H 2 O + + ОН Ионизированная молекула H 2 O + реагирует с нейтральной молекулой воды, образуется высоко-реактивный гидроксил-радикал (ОН ) Высвобожденный из молекулы воды электрон взаимодействует с окружающими молекулами воды. При этом возникает возбужденная молекула H 2 O ·, которая диссоциирует с образованием двух радикалов: Н и ОН H 2 O + + e - H 2 O · Н + ОН Радикалы ОН ответственны более чем за половину радиационных повреждений молекул ДНК, т.к. они могут диффундировать на расстояние около 1 нм ( радиус ДНК) Время реакции – доли секунды Атомарный водород ( Н) и гидроксил- радикал ( ОН) неустойчивы, время их жизни не превышает миллионных долей секунды (диффундируют на разные расстояния) hעhע

ШПУРЫ - скопления первичных продуктов радиолиза воды (около 6 радикалов на шпур), их средний радиус 1,5 нм Н 2 О возбуждение Н 2 О H. + OH. Н 2 О ионизация Н 2 О + +е - + Н 2 О Н 2 О - H. + OH - + H + е - гидр + Н 2 О H.H. Атаковать растворенные молекулы могут только радикалы, которые не рекомбинируют, а выходят из шпура. (Схема образования первичных продуктов радиолиза воды из Кудряшов, 2004) В шпурах происходит рекомбинация радикалов с образованием молекулярных продуктов

Эффективность радиационно- химического выхода радикалов G Число образованных радикалов G = эВ поглощенной энергии Продукты радиолиза воды Значение G е - гидр 2,6 Н.Н. 0,6 ОН. 2,6 Н2О2Н2О2 0,75 Н2Н2 0,45 Табл. Радиационно-химический выход первичных продуктов радиолиза воды (при нейтральном рН) Методы регистрации радикалов см. Кудряшов, с.176

Устойчивые и неустойчивые продукты радиолиза воды Радикальные продукты радиолиза воды радикалы – это неустойчивые продукты (время жизни не превышает миллионных долей секунды) атомарный водород (Н·); гидроксил-радикал (ОН·), гидропероксидный (супероксид) радикал (ОН 2 ·) За время своей жизни движущиеся в воде Н· и ОН· успевают вступить во взаимодействие устойчивые в воде ионы: ионы гидроксония (Н+ или Н 3 О + ) и гидроксила (ОН*) Молекулярные продукты радиолиза воды (образуются в результате взаимодействия радикалов): молекулярный водород; перекись водорода и вода Н· + Н· --> Н 2, ОН 2 · + Н· --> Н 2 О 2 ОН· + Н· --> Н 2 О, ОН·+ ОН· Н 2 О 2 Схема тетраэдрич. координации молекулы воды; сплошные линии - ковалентные; пунктирные линии – водородные связи.

Характеристика свободных радикалов: Содержат неспаренные электроны характеризуются высокой реакционной способностью время жизни от до долей секунды в веществе либо рекомбинируют друг с другом, либо реагируют с органическим соединениями «цель» радикала - освободиться от неспаренного электрона - передать его другой молекуле или отнять у нее электрон для образования пары и тем самым превратиться в стабильную молекулу.

Цепочка последовательных превращений при радиолизе воды: вода ионы (Н 2 О +, е - ) радикалы (Н · и ОН · ) молекулярные продукты (Н 2, Н 2 О 2 ) Молекулярные продукты при облучении очень чистой воды накапливаются в очень малой концентрации - не более 0,0001 % от количества исходного вещества. Причина этого - в разрушении образующихся соединений радикалами Н · и ОН ·. Н 2 О 2 + Н· Н 2 О + ОН· Н2 + ОН· Н 2 О + Н·, Так что радикалы, порождая молекулярные продукты, их же и разрушают. Происходит круговорот: вода продукты радиолиза вода.

Молекулярные продукты радиолиза превращаются не только в воду Кроме приведенных выше реакций протекают еще две Н 2 О 2 + ОН · Н 2 О + НО 2 ·, НО 2 · + НО 2 · -> Н 2 О 2 + О 2 В результате всех этих превращений в воде остается только малое количество молекулярного кислорода и молекулярного водорода.

НО 2 + НО 2 H 2 O 2 + 2О Н + О 2 НО 2 Свойства продуктов радиолиза воды 1. Окислительные продукты радиолиза (образуются в присутствии кислорода) Гипероксидный (супероксид) радикал (НО 2 ) Перекись водорода (Н 2 О 2 ) – один из наиболее сильных окислителей, сильнее, чем хлор, диоксид хлора и перманганат калия. Aтомарный кислород гипотеза : на ранних стадиях развития Земли, когда уровень радиации был на два порядка выше, чем в настоящее время, радиолиз воды мог быть принципиальным источником атмосферного кислорода, необходимого условия для возникновения и развития жизни (Pedersen, 1999).

Восстановительные продукты радиолиза Гидратированый (сольватированный) электрон (е - aq ) - стабилизированная форма электрона - обладает высокой реакционной способностью в качестве восстановителя электроны захватывают молекулы воды и становятся гидратированными: e - e - aq Гидратированный электрон превращает ион водорода в атом (радикал) в присутствии третьей частицы: H+ e - aq + M4 H + M4 В результате среда становится сильно восстановительной, и количество восстановителей равно числу впрыснутых электронов. Aтомарный водород ( e - + H 2 O H 2 O - H + OH - ) неустойчив, время жизни не превышает миллионных долей секунды. За это время движущиеся в воде радикалы Н · успевают вступить во взаимодействие. В результате этих реакций вновь образуется вода ОН + Н Н 2 О и появляются уже устойчивые соединения - молекулярный водород Н + Н Н 2.

Непрямое действие радиации в водных растворах

Прямая и косвенная инактивация ферментов Радиочувствительность рибонуклеазы в водном растворе выше, чем в сухом препарате В разбавленных водных растворах биомолекул большую часть энергии излучения поглощают молекулы воды Биомолекулы поражаются как в результате прямого взаимодействия с излучением, так и в результате опосредованного действия продуктов радиолиза воды. Рис. Инактивация γ-излучением рибонуклеазы в сухом состоянии (верхняя кривая) и в водном растворе (нижняя кривая)

Пример: эффективность радиационно- химического выхода поврежденных молекул РНКазы в сухом препарате G = 0,89, в водном растворе G = 1,68

Открытие и экспериментальное исследование непрямого действия радиации 1930-е годы (радиохимические изменения в растворах неорганических и простых органических соединений) Экспериментальный парадокс: в водных растворах ферментов число измененных излучением молекул не было прямо связано с их концентрацией в растворе - выдвинута гипотеза непрямого (или косвенного) действия излучения

Зависимость «доза-эффект» для (сильно разбавленных) растворов молекул При косвенном действии радиации независимо от разведения раствора, абсолютное число поврежденных молекул остается постоянным, а их доля от общего числа изменяется обратно пропорционально их концентрации Эксперимент Г.Фрикке: черные кружки – конц. муравьиной кислоты моль, белые кружки – конц моль.

«Эффект разведения» или «эффект Дейла» - радиационно-химический выход инактивированных молекул не зависит от концентрации При прямом действии радиации число инактивированных молекул при заданной дозе излучения увеличивается при увеличении концентрации раствора (рис.б), а их доля от общего числа молекул остается постоянной (рис.а) При косвенном действии излучения (эксперимент с муравьиной кислотой) число инактивированных молекул при увеличении концентрации раствора остается постоянным (рис. б), а доля инактивированных молекул уменьшается (рис. а). При очень сильном разбавлении раствора часть радикалов, взаимодействует друг с другом и не реагирует с растворенным веществом

Резюме Прямое действие ионизирующего излучения ответственно за 10-20% лучевого поражения макромолекул (на примере ДНК), косвенное действие (посредством продуктов радиолиза воды) излучения ответственно за 80-90% лучевого поражения косвенное действие излучения усиливается или ослабляется за счет действия химических модификаторов

Модификация косвенного действия радиации

Защита и сенсибилизация Радиосенсибилизаторы – вещества, усиливающие действие ИИ; Радиопротекторы – вещества, ослабляющие действие ИИ Подробности – в теме «Радиочувствительность и способы ее модификации»

Эффект защиты Достигается за счет примесей- перехватчиков активных продуктов радиолиза воды, например, кислорода Защитное действие кислорода в водных растворах (обратный кислородный эффект) - будет рассмотрено далее в разделе «модификация радиочувствительности»

Влияние ЛПЭ при косвенном действии излучения Поражающее действие излучения снижается с ростом ЛПЭ ---- Т.е. гамма-излучение поражает эффективнее частиц и ускоренных ядер??? Роль линейной плотности ионизации, (которая определяет пространственное распределение активных радикалов воды): Плотноионизирующее излучение - Продукты радиолиза с большей вероятностью рекомбинируют с образованием молекулярных продуктов (т.к. расположены близко друг к другу); Редкоионизирующее излучение – радикалы пространственно разобщены т.е. они с большей вероятностью провзаимодействуют с молекулами- мишенями, чем друг с другом

Усиление радиационного поражения В облученных клетках образуются и выделяются в окружающую среду относительно долгоживущие (до нескольких минут) продукты (предположительно вещества белковой природы), вызывающие генетические изменения, приводящие к гибели интактных клеток, помещенных в среду. При облучении питательной среды для культивирования клеток, содержащей сыворотку, образуются вещества, которые приводят к нарушению роста посеянных на облученную среду клеток.

Гипотеза: Предполагается, что в среде образуются долгоживущие производные кислорода, которые действуют как непосредственно на ДНК интактных клеток, так и меняют их метаболизм, активируют NADPH-оксидазы цитоплазматических мембран. В результате в необлученной клетке возникают такие же активные формы кислорода, как и в облученной. (кислородный эффект, эффект свидетеля)

Примеры опосредованного действия ионизирующего излучения

«Bystander effect»=«Коммунальный эффект» = «эффект свидетеля» опосредованное действие ионизирующего излучения Поражение клеток, находящихся вне зоны воздействия радиации, но контактирующих с облученными клетками или со средой их обитания Методы: 1.эксперименты по исследованию цитотоксического действия жидкостей-продуктов метаболизма - на интактные объекты 2.Локальное облучение отдельных клеток: цитоплазмы и ядра

Хронология исследования биологической природы факторов опосредованного действия излучения 1954 г. индукция хромосомных аберраций костного мозга грудины после облучения селезенки 1967 г индукция хромосомных аберраций в лимфоцитах, культивируемых на плазме, взятой у людей, подвергнутых противоопухолевой лучевой терапии г факторы имеют небольшой молекулярный вес и возникают в результате оксидативного стресса и перекисного окисления липидов г в культуральную среду выделяются факторы (сигнальные вещества) имеющие скорее всего белковую природу, которые влияют на изменение проницаемости клеточных мембран, вызывают гибель интактных клеток, снижение их клоногенного потенциала Механизм действия малоизучен

Локальное облучение клеток эксперимент 2003 года Передатчики сигналов: Окись азота – NO; Белок коннексин-43 Механизм передачи сигналов мало изучен

Эффект свидетеля. Эксперименты с раковыми клетками человека Фракция выживших необлученных клеток, культивированных совместно с клетками, облученными альфа-частицами (5 Гр), или в присутствии облученной среды mbia.edu/dept/rado ncology/crr/reports2 002

Соотношение между адаптивным ответом и эффектом свидетеля в тех же экспериментах

Эффект свидетеля. Эксперименты с искусственной кожей человека Апоптоз, индуцированный эффектом свидетеля в искусственной коже человека, окрашенной красителем DermaTACS apoptosis kit. Апоптозные клетки – голубые. Formalin fixed, paraffin embedded 5 µm histological sections are shown as imaged through a transmission light microscope (600X).

Фракция апоптозных клеток в необлученных клетках-свидетелях, расположенных на разном удалении от облученных клеток в 3-D ткани искусственной кожи человека (EPI-200, 10 α-particles every 100 mm) на третий день после облучения.

М. С. Конькова, А. В. Ермаков, С. В. Костюк, Н. Н. Вейко РАЗВИТИЕ ЭФФЕКТА СВИДЕТЕЛЯ, ИНДУЦИРОВАННОГО АДАПТИРУЮЩЕЙ ДОЗОЙ РЕНТГЕНОВСКОГО ИЗЛУЧЕНИЯ В ЭНДОТЕЛИОЦИТАХ ЧЕЛОВЕКА Медико-генетический научный центр РАМН, ул. Москворечье, д. 1, , Москва, Россия А. В. Ермаков, С. В. Костюк, Н. А. Еголина, Е. А. Калашникова, С. Н. Кокаровцева, Е. М. Малиновская, Н. Н. ВейкоА. В. ЕрмаковС. В. КостюкН. А. ЕголинаЕ. А. КалашниковаС. Н. КокаровцеваЕ. М. МалиновскаяН. Н. Вейко СИГНАЛИЗАЦИЯ МЕЖДУ ЛИМФОЦИТАМИ ЧЕЛОВЕКА ПОСЛЕ ИНДУКЦИИ ЭФФЕКТА СВИДЕТЕЛЯ ВОЗДЕЙСТВИЕМ ИОНИЗИРУЮЩЕЙ РАДИАЦИИ В АДАПТИРУЮЩИХ ДОЗАХ ГУ Медико-генетический научный центр РАМН, Москва

Возможное применение эффекта-свидетеля В ряде работ, осуществленных в последние годы, обнаружены доказательства того, что при парциальном облучении отдельных частей тела экспериментальных животных возможна индукция широкомасштабных эпигенетических изменений в органах, не подвергшихся облучению. Высказывается предположение, что индукция таких изменений может быть проявлением генерализованной мобилизации адаптивных механизмов организма, которая возникает в ответ на радиационное воздействие и приводит к «эффектам свидетеля» in vivo, в том числе к подавлению роста новообразований. А.М.Вайсерман Журн. АМН України, 2010, т. 16

Теоретические представления о биологическом действии радиации Принцип попадания и теория мишени Теоретический анализ кривых доза-эффект

Зависимость «доза-эффект» - зависимость между дозой, переданной биологическому объекту и результирующим биологическим радиационным эффектом. Возможны различные варианты экстраполяции. В настоящее время МКРЗ рассматривает три основных: A: линейная B: линейно- квадратичная C: квадратичная пороговая

Гипотеза точечного нагрева Ф.Дессауэра (сформулирована в 1920-е годы): Большой биологический эффект при ничтожном суммарном поглощении энергии объясняется тем, что энергия концентрируется в крайне малых объемах, приводя их к микролокальному разогреву На основе анализа кривых «доза-эффект» выявлено: -отсутствие порога при увеличении дозы -при повышении дозы увеличивается не степень поражения объектов, а количество пораженных единиц Выводы: - Радиобиологические реакции осуществляются в том случае, если в клетке произошло определенное число попаданий в мишень. - Конечный эффект ионизирующих излучений имеет вероятностный характер

Принцип попадания и теория мишени сформулированы для анализа радиобиологических эффектов Теория мишени: характерные зависимости доза-эффект являются отражением квантового характера взаимодействия излучения с веществом и наличия в клетках высокочувствительных объемов – мишеней. Принцип попадания (сформулирован в 1924 г Дж.Кроутером) – регистрируемый эффект связан с некоторым числом ионизаций в пределах мишени - характеристика дискретности поглощения энергии и вероятностный характер попадания Принцип мишени (параметры мишени сопоставимы с размером ядра) – характеризует высокую структурированность и гетерогенность клетки в морфологическом и функциональном смысле

Зависимости «доза-эффект» (повреждение объектов при малых дозах и наличие неповрежденных объектов при больших дозах) Вид кривых зависит от способа передачи энергии биологическому объекту, что обусловлено: 1)дискретностью природы ионизирующего излучения 2)вероятностным характером его воздействия на объекты (структурированность клетки) Линейные зависимости – для одноударных процессов Зависимости с плечом – для многоударных процессов Выживаемость стволовых клеток кишечника (1) и стволовых кроветворных клеток (2) мышей при гамма облучении; и то же самое при облучении нейтронами (3, 4)

Обобщенная формула для расчета кривых «доза-эффект» 1922 Блау и Альтенбургер (см. Кудряшов, 2004, с.92) Основана на принципе попадания Позволила рассчитать теоретические кривые для разного числа попаданий Расчеты совпали с реальными кривыми

Модели лучевого поражения Для плотноионизирующего излучения N=N 0 e -D/D 0 где N- число выживших клеток из общего числа N 0, D- доза излучения, D 0 – доза, при которой доля живых клеток уменьшается в сравнении с исходной в е раз. D q - «квазипороговая доза» - выживает 37% объектов

Для редкоионизирую- щего излучения N= N 0 - N 0 (1- e -D/D 0 ) n, n –способность клеток к восстановлению где N- число выживших клеток из общего числа N 0, D- доза излучения, D 0 – доза, при которой доля живых клеток уменьшается в сравнении с исходной в е раз. Dq- «квазипороговая доза» - выживает 37% объектов

1 n С точки зрения теории мишени количество попаданий прямо пропорционально дозе облучения В диапазоне малых доз число пораженных мишеней строго пропорционально дозе, или числу попаданий, т.к. поражается лишь небольшая их часть (линейный участок кривой) С повышение дозы вероятность попадания в одну и ту же мишень увеличивается и эффективность на единицу дозы уменьшается - количество пораженных мишеней возрастает медленнее, асимптотически приближаясь к 100 % (рис.) В случае многоударных процессов кривая имеет S-образный вид (Кудряшов, 2004,с.98).

Наиболее часто используемые параметры зависимости «доза-эффект» LD – lethal dose; LD 100 -летальная доза (гибнет 100 % объектов); LD 50 -полулетальная доза; LD 50/30 - половина объектов погибает за 30 дней;

Объяснение парадокса радиобиологии Экстремальный эффект, возникающий в клетке в результате поглощения ничтожной по величине энергии, происходит вследствие дискретного акта ее размена (попадания) в крошечном, но жизненно важном микрообъеме (мишени), например в уникальной молекуле ДНК

Переход к стохастической модели Накопление экспериментальных данных – плечо на кривой выживания – теория мишени не объясняет. Возникновение плеча объясняли репарационной способностью клеток. Теория мишени не объясняла косвенные радиационные эффекты (результат радиолиза воды, метаболические взаимодействия клеточных органелл) В результате в 1940-е годы применение теории мишени было ограничено только анализом одноударных эффектов. Стало известно, что первичные повреждения клеточных структур могут возникать не только при их непосредственной ионизации, но и опосредованно - например, продуктами радиолиза воды. Также были установлены факты миграции энергии по макромолекулам. В 1960-е годы предложена теория попаданий на основе стохастического принципа (О.Хуг и А.Келлер)

Стохастическая (вероятностная) теория Рассматривает различные возмущения биологической системы, возникающие в процессе жизнедеятельности или под влиянием ионизирующих излучений, с позиций теории вероятностей. В этом случае мишенями являются все компоненты живой системы, а регистрируемая реакция обусловлена суперпозицией разных событий; Стохастическая теория учитывает как физиологические, так и индуцированные излучением процессы в их динамике, в то время как классическая теория мишени рассматривает эффекты, вызванные облучением, как строго детерминированные первичными актами сорбции энергии Стохастическая теория (с помощью разработанного математического аппарата) рассматривает взаимодействие ряда последовательных попаданий, репарационных процессов и т.д. Выводы теории мишени можно рассматривать как частный случай стохастического подхода: гибель клетки в результате попадания в одну из ее уникальных структур может быть описан как в рамках теории мишени, так и с точки зрения стохастической теории.

Сходство двух концепции Строго количественный подход Дискретность воздействия излучения Функциональная негомогенность биологического объекта ( в классической теории постулируется существование фиксированных мишеней, в стохастической – физиологические процессы и их нарушения имеют вероятностный характер ).

Следующая тема Радиочувствительность (радиоустойчивость) биологических объектов и способы ее модификации

Задание на дом Современные препараты- радиопротекторы, механизм их действия - к следующему занятию «Эффект свидетеля» – найти научную статью, принести показать мне, затем подготовить по ней доклад.