МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ В ПРОТЕОМНЫХ ИССЛЕДОВАНИЯХ Марина Васильевна Серебрякова Лаборатория протеомного анализа ФГУ НИИ ФХМ г.Москва Часть 1: Масс-спектрометрия

Белки и пептиды Моноизотопные массы аминокислотных остатков ADLKQLMDNEVLMAFTSYATIILAKMMFLSSATAFQRLTNKVFANPEDCAGFGKGENAKKFLRTD EKVERVRRAHLNDLENIVPFLGIGLLYSLSGPDLSTALIHFRIFVGARIYHTIAYLTPLPQPNRGLAF FVGYGVTLSMAYRLLRSRLYL (Глутатион-трансфераза человека) пептидная связь аминокислотный остаток

SAPASTTQPIGSTTSTTTKTAGATPATASGLFTIPDGDFFSTARAIVASNAVATNEDLSKIEAIWKDM KVPTDTMAQAAWDLVRHCADVGSSAQTEMIDTGPYSNGISRARLAAAIKEVCTLRQFCMKYAPV VWNWMLTNNSPPANWQAQGFKPEHKFAAFDFFNGVTNPAAIMPKEGLIRPPSEAEMNAAQTAA FVKITKARAQSNDFASLDAAVTRGRITGTTTAEAVVTLPPP (Белок оболочки Х-вируса картофеля) Пептидный фингерпринт Num From-To MH+ HPLC pI Sequence ,27 9,85 SAPASTTQPIGSTTSTTTK ,27 9,85 SAPASTTQPIGSTTSTTTK ,79 3,92 TAGATPA..PDGDFFSTAR ,87 4,11 AIVASNAVATNEDLSK ,33 6,99 IEAIWK ,27 6,99 DMK ,51 3,92 VPTDTMAQAAWDLVR ,48 4,34 HCADVGSS..GPYSNGISR ,78 11,20 AR ,82 10,10 LAAAIK ,84 6,29 EVCTLR ,08 8,68 QFCMK ,07 9,42 YAPVVWNWM..QGFKPEHK ,21 6,97 FAAFDFFNGVTNPAAIMPK ,92 4,60 EGLIRPPS..AAQTAAFVK ,80 10,15 ITK ,78 11,20 AR ,77 3,92 AQSNDFASLDAAVTR ,11 11,15 GR ,90 3,15 ITGTTTAEAVVTLPPP Num From-To MH+ HPLC pI Sequence ,08 4,35 SAPASTTQPI…IVASNAVATNE ,08 4,35 SAPASTTQPI…IVASNAVATNE ,90 4,11 DLSKIE ,42 4,58 AIWKDMKVPT..ADVGSSAQTE ,73 9,58 MIDTGPYSNGISRARLAAAIKE ,01 9,02 VCTLRQFCMKY…NWQAQGFKPE ,30 7,58 HKFAAFDFFNGVTNPAAIMPKE ,16 7,04 GLIRPPSE ,83 3,25 AE ,38 10,52 MNAAQTAAFV…RGRITGTTTAE ,07 6,96 AVVTLPPP Трипсин ( /R,K) Стафилококковая протеаза V8 ( /E) Пептидный калькулятор GPMAW 4.04

1 определение количества того или иного белка в образце 2 идентификация белка 3 уточнение первичной структуры 4 определение пост-трансляционных модификаций ПРЕДПОСЫЛКИ: Реализация программы Геномика – быстрое секвенирование ДНК, создание баз данных нуклеотидных последовательностей Развитие инструментальных методов – масс-спектрометрия белков и пептидов, сопряжение с методами разделения ПРОТЕОМИКА – совокупность высокотехнологичных методов изучения белков:

Общий вопрос - что измеряется? Масс- спектрометрия – расчет молекулярной массы ионов по их поведению в электрических и/или магнитных полях Сила, действующая на ион массы m и заряда z в однородном электрическом поле: Сила, действующая на ион массы m, заряда z, скорости v в однородном магнитном поле: Примеры: F q = zeE F L = ze[v x B] a = (z/m)eE a = (z/m)e[v x B] m/z МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ БЕЛКОВ И ПЕПТИДОВ

Источник ионов Система разделения ионов Детектор Общая схема масс-спектрометра MALDI ESI Времяпролетные (TOF) Квадрупольные (Q) Ионные ловушки (IT) Ионно-циклотронного резонанса (ICR-FT) Микроканальные пластины (MCP) Диноды Магнит (ICR-FT) Положительные: - захват протона либо другого катиона (Na, K); - потеря электрона (катион-радикал). Отрицательные: - утрата протона; - захват электрона. Типы ионов

ESI – электрораспыление и ионизация Растворители: вода, ацетонитрил, метанол Анализируемое вещество подается в растворе через капилляр с поданым на него напряжением. несколько последовательных «упариваний-взрывов» микрокапель В результате получаются многозарядные газофазные ионы, захватившие на себя разное количество протонов, вплоть до максимально возможного. ИСТОЧНИКИ ИОНОВ

МАТРИЦА: * Поглощает энегрию лазерного излучения, вскипая, увлекает в газовую фазу молекулы анализируемого вещества * Способствует ионизации Матрицы для УФ лазера (336нм) Лазер: 2нс, мкДж/имп, 50мкм Анализируемое вещество (раствор М,

MLLTQVQTYVLSIIPSGPLKAEIAQRLEDVFAGKNTDLEVLMEWLKTRPILSPLTKGILGFVFTLTVPSERGLQ RRRFVQNALNGNGDPNNMDKAVKLYRKLKREITFHGAKEISLSYSAGALASCMGLIYNRMGAVTTEVAFGLV CATCEQIADSQHRSHRQMVTTTNPLIRHENRMVLASTTAKAMEQMAGSSEQAAEAMEVASQARQMVQAMR TIGTHPSSSAGLKNDLLENLQAYQKRMGVQMQRFK Пример MALDI масс-спектра: триптический гидролизат фрагмента белка М1 вируса гриппа

Точный механизм MALDI ионизации неизвестен, однако в результате образуются, как правило, однозарядные ионы, захватившие протон либо иной катион. MALDI : типы положительных ионов и вид спектра

Пептид массой 2000 Д содержит ~ 100 углеродов в нем с вероятностью ~ 30% не встретится 13 С, с вероятностью ~ 50% встретится один 13 С, с вероятностью ~ 20% встретится два 13 С. 1 NB: в масс-спектре детектируется 10 3 – 10 6 молекул аналита. Этого достаточно для наблюдения изотопного рапределения. Моноизотопная масса – масса пептида, не содержащего ни одного 13 С вид MALDI масс-спектра вид ESI масс-спектра моноизотопнная масса средняя (average) масса Естественное изотопное распределение в белках и пептидах

* Оба метода ионизации требуют высокой химической чистоты анализируемого вещества. * Диапазон концентрации аналита при ESI и MALDI – M. * Поскольку разные вещества (например, пептиды) обладают разной способностью к ионизации (захвату протона либо другого катиона), то невозможно делать выводы о количественном соотношении компонентов сложной смеси на основании высот пиков в спектре. При ESI образуется непрерывный поток ионов, при MALDI - сильно ограниченный во времени (до 10нс) пакет ионов. При ESI анализу подлежит более 10 фемтомолей вещества, при MALDI - более 1 фемтомоля вещества. При ESI образуются ионы m/z , возможно измерение белков до ~ Да. При MALDI возможно измерение белков до ~ Да, диапазон измеряемых масс ограничен снизу до ~500 Да из-за присутсвия с спектрах пиков матрицы. ESI является более мягким способом ионизации, чем MALDI. Замечания о ESI и MALDI:

Квадрупольный анализатор Ионная ловушка Магнитный анализатор Времяпролетный масс-анализатор СИСТЕМЫ РАЗДЕЛЕНИЯ ИОНОВ

Микроканальные пластины При MALDI существует разброс по энергиям, приводящий к уширению пиков. Энергия ускорения 20 кэВ и длина пути 1м При энергии ускорения 20 кэВ разброс в 100эВ составляет 0.5%. Так пик пептида м.в. 1000Д имел бы ширину на половине высоте около 2 Да ! MALDI-времяпролетный масс-спектрометр с MCP детектором

Использование отражающего напряжения (рефлектрона Мамырина) Использование «отсрочки экстракции» вакуум Уменьшение стартового разброса ионов – повышение разрешения MALDI-TOF-MS

разрешениеразрешение Разрешение до , точность до 0.002% (=20ppm). Разрешение и точность MALDI-TOF-MS

Когда ион, захвативший избыток энергии в процессе MALDI, распадается в области свободного дрейфа, фрагменты имеют ту же скорость, что и их родительский ион, а энергию - меньшую (~ m) Распад ионов в процессе MALDI

для адекватного отражения дочерних ионов: U1ref/U0ref = m1/m0 набор масс-спектров с разным U рефлектрона компьютерно сшиваются в один спектр PSD получается один спектр фрагментации TOF-TOF точность измерения масс фрагментов % PSD (post source decay) и TOF-TOF детекция распада ионов во время свободного дрейфа

На верхний и нижний электроды подано постоянное положительное напряжение. На короткое время отталкивающее напряжение с верхнего электрода снимается, позволяя пакету ионов влететь в ловушку. На центральном электроде - быстропеременное напряжение, которое заставляет ионы всех m/z двигаться со своими частотами по своим орбитам. Затем, на экстрагирующие линзы подается осцилируещее напряжение, последовательно вытягивающее ионы согласно их m/z. Характеристиками ловушки являются: ёмкость (верхнее значение разделяемых m/z ) до 4000, разрешение до 0.2 Да по диапазону, точность до 0.01% (=100ppm) для родительских ионов и фрагментов. Ионные ловушки позволяют, варьируя напряжения, оставлять в ловушке определенные ионы и получать спектры их фрагментов. При этом возможен ряд последовательных фрагментаций иона. Ионная ловушка хорошо сочетается с жидкостным хроматографом. ESI – ионная ловушка с МСР детектором

Сочетает хорошее разрешение времяпролетного масс-спектрометра с возможностью хорошего выделения (включением квадруполя) определенных ионов для получения спектров фрагментации. На электроды квадруполя подается переменное напряжение, позволяющее пролетать только резонансным ионам. Напуск инертного газа приводит к столкновительной фрагментации ионов. точность % для родительских ионов и фрагментов «Гибридные» приборы: ESI – квадруполь – ортогональный времяпролетный МС

Ионы «запираются» в мощный (7-14 тесла) секторный сверхпроводящий магнит, где вращаются под действием силы Лоренца с частотой, зависящей от m/z. Два сектора магнита используются для снятия токов, наведенных пролетающими мимо них ионами. Сложный сигнал от ионов разных m/z подлежит разложению по частотам (Фурье-преобразованию). Характеристики ICR-FT : разрешение до , точность до % (=1ppm). ESI - масс-спектрометры ионно-циклотронног резонанса с последующим Фурье- преобразованием (ICR-FT)

Сравнение характеристик приборов

Cовременный масс-спектрометр основан на работе, сделанной сэром Дж. Томсоном в Кэвендишевской лаборатории Кембриджского университета. Исследования Томсона, приведшие к открытию электрона в 1897 году, также привели к созданию первого масс- спектрометра, построенного им для изучения влияния электрического и магнитного полей на ионы, генерируемые в остаточном газе на катоде рентгеновской трубки. В 1906 году Томсон получил Нобелевскую премию по физике за "Выдающиеся заслуги в теоретическом и экспериментальном изучении электропроводимости газов". К концу Первой мировой войны работы Френсиса Астона и Артура Демпстера привели к значительному улучшению точности и воспроизводимости измерений на масс-спектрометрах. Позднее Альфред Нир воплотил эти достижения вместе со значительным продвижением в вакуумной технике и электронике в конструкцию масс- спектрометра, значительно сократив его размеры. Еще раньше, в 1946 году, Уильям Стивенс предложил концепцию времяпролетных анализаторов. В середине 1950-ых годов Вольфганг Пол разработал квадрупольный масс- анализатор. Другой разработкой Пола было создание квадрупольной ионной ловушки, специально предназначенной для захвата и измерения масс ионов. За свои инновационные работы Вольфганг Пол получил в 1989 году Нобелевскую премию по физике. В 1950-е годы впервые были соединены газовый хроматограф и масс- спектрометр (Голке, Маклаферти и Рихаге). Затем появились новые методы ионизации - бомбардировка быстрыми атомами (Барбер), химическая ионизация (Тальрозе, Филд, Мансон), полевая десорбция/ ионизация (Беки), MALDI (Танака, Карас, Хилленкампф), ESI (Доул, Фенн), ионизация в инуктивно-связанной плазме (Фассел). Были разработаны масс-спектрометры ионно- циклотронного резонанса (Хиппл) и, затем, с Фурье-преобразованием сигнала (Комиссаров, Маршалл), тройные квадрупольные тандемные масс-спектрометры (Йоуст, Энке). Историческая справка: