Г ЕННЫЙ УРОВЕНЬ ОРГАНИЗАЦИИ НАСЛЕДСТВЕННОГО МАТЕРИАЛА Красноярский государственный медицинский университет им. В.Ф. Войно-Ясенецкого Кафедра Биологии с экологией и курсом фармакогнозии Лекция 3 для специальности – «Медицинская кибернетика» (очная форма обучения) д.б.н. Орлянская Т.Я. к.б.н. Ермакова И.Г. Красноярск 2013

П ЛАН ЛЕКЦИИ 1.Ядро 2.Нуклеиновые кислоты 3.Генетический код и его свойства 4.Экспрессия генов

Ядро (лат. nucleus) это один из структурных компонентов эукариотической клетки. Ядро содержит генетическую информацию. Функции ядра: хранение, передача и реализация генетической информации. ХРАНЕНИЕ – СОДЕРЖИТ ДНК; ПЕРЕДАЧА – ДЕЛЕНИЕ КЛЕТКИ; РЕАЛИЗАЦИЯ – БИОСИНТЕЗ БЕЛКА.

Ядро состоит из ядерной оболочки, ядрышка кариоплазмы (или нуклеоплазмы) и хроматина.

Схема ультраструктурной организации интерфазного ядра: 1 ядерная мембрана с порами (2), 3 гетерохроматин; 4 эухроматин; 5 ядрышко; 6 интерхроматиновые гранулы; 7 перихроматиновые гранулы; 8 перихроматиновые фибриллы; 9 кариоплазма.

В клеточном ядре происходит репликация (или редупликация) удвоение молекул ДНК, а также транскрипция синтез молекул РНК на молекуле ДНК. Синтезированные в ядре молекулы РНК модифицируются, после чего выходят в цитоплазму. Образование обеих субъединиц рибосом происходит в специальных образованиях клеточного ядра ядрышках.

Я ДЕРНАЯ ОБОЛОЧКА, ЯДЕРНАЯ ЛАМИНА И ЯДЕРНЫЕ ПОРЫ ( КАРИОЛЕММА ) Ядерная оболочка образована за счёт расширения и слияния друг с другом цистерн эндоплазматической сети таким образом, что у ядра образовались двойные стенки за счёт окружающих его узких компартментов.

Полость ядерной оболочки называется люменом или перинуклеарным пространством. Внутренняя поверхность ядерной оболочки подстилается ядерной ламиной, жёсткой белковой структурой, образованной белками-ламинами, к которой прикреплены нити хромосомной ДНК. Ламины прикрепляются к внутренней мембране ядерной оболочки при помощи заякоренных в ней трансмембранных белков рецепторов ламинов.

Ядерная ламина фибриллярная сеть жесткой структуры, подстилает ядерную мембрану (находится под ядерной мембраной), участвует в организации хроматина. Ламина, состоящая из белков-ламинов A, B, C, изображена в виде тройной волнистой линии. BAF - хроматин-связывающий белок ( Coutinho et al., 2009).

Ядерные поры имеют сложную структуру, организованную специализированными белками нуклеопоринами. Под электронным микроскопом ядерная пора видна как восемь связанных между собой белковых гранул с внешней и столько же с внутренней стороны ядерной оболочки

Реконструкция ядерной поры

Количество ядерных пор на одно ядро может колебаться от 190 у дрожжей, 3000 – 5000 в клетках человека до 50 млн в зрелых ооцитах (оплодотворенных яйцеклетках) шпорцевой лягушки (Xenopus laevis).

Х РОМАТИН Хроматин (греч. chroma цвет, краска и греч. nitos нить) это вещество хромосом комплекс ДНК, РНК и белков. Основную массу хроматина составляют белки гистоны. ГИСТОНЫ ЯВЛЯЮТСЯ КОМПОНЕНТОМ НУКЛЕОСОМ, НАДМОЛЕКУЛЯРНЫХ СТРУКТУР, УЧАСТВУЮЩИХ В УПАКОВКЕ ХРОМОСОМ.

Н УКЛЕОСОМНАЯ МОДЕЛЬ ОРГАНИЗАЦИИ ХРОМАТИНА ЭУКАРИОТ Структура, состоящая из гистонового октамера, обвитого участком ДНК, называется нуклеосомой. Нуклеосома состоит из белков четырех типов: H2A, H2B, H3 и H4. В одну нуклеосому входят по два белка каждого типа всего восемь белков. Гистон H1, более крупный, чем другие гистоны, связывается с ДНК в месте ее входа на нуклеосому. Такая укладка ДНК сокращает её длину в 7 раз.

Нить ДНК с нуклеосомами образует нерегулярную соленоид-подобную структуру толщиной около 30 нанометров, так называемую 30 нм фибриллу. Дальнейшая упаковка этой фибриллы может иметь различную плотность. Если хроматин упакован плотно его называют конденсированным или гетерохроматином, он хорошо видим под микроскопом. ДНК, находящаяся в гетерохроматине не транскрибируется, обычно это состояние характерно для незначащих или молчащих участков. В интерфазе гетерохроматин обычно располагается по периферии ядра (пристеночный гетерохроматин). Полная конденсация хромосом происходит перед делением клетки. Если хроматин упакован неплотно, его называют эу- или интерхроматином. Этот вид хроматина гораздо менее плотный при наблюдении под микроскопом и обычно характеризуется наличием транскрипционной активности. Плотность упаковки хроматина во многом определяется модификациями гистонов ацетилированием и фосфорилированием

НитьДНК Нуклеосомный уровень Уровень 30 нм фибрилл Метафазная хромосома Активная хромосома Схема конденсации хроматина

2. НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ Нуклеиновые кислоты обеспечивают многообразные процессы хранения, передачи и воспроизведения наследственной информации В природе встречается два вида нуклеиновых кислот ДНК и РНК, В прокариотических и эукариотических клетках генетические функции выполняют оба типа нуклеиновых кислот. Вирусы всегда содержат один вид нуклеиновой кислоты.

Нуклеиновые кислоты это полимеры. мономером которых является нуклеотид Азотистое основание

Азотистые основания нуклеотидов делятся на 2 типа: пиримидиновые (состоят из одного 6-членного конца) и пуриновые (состоят из двух конденсированных 5- и 6-членных колец)

П ЕРВИЧНАЯ СТРУКТУРА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ Формирование линейной полинуклеотидной цепи происходит путём образования фосфодиэфирной связи пентозы одного нуклеотида с фосфатом другого. Пентозофосфатный остов состоит из (5' -3')-связей. Концевой нуклеотид на одном конце цепочки всегда имеет свободную 5' –группу, на другом – 3'-группу.

ДНК В составе ДНК – сахар дезоксирибоза. 4 типа азотистых оснований: А – аденин, Т –тимин, Г – гуанин, Ц – цитозин. Две полинуклеотидные цепочки объединяются в молекулу ДНК при помощи водородных связей между азотистыми основаниями по принципу комплементарности: А – Т Г – Ц Принцип комплементарности – это одна из фундаментальных закономерностей природы, определяющая механизм передачи наследственной информации Полинуклеотидные цепочки являются антипараллельными: против 5' -конца одной цепочки, находится 3'-конец другой цепочки.

РНК В составе РНК – сахар рибоза. 4 типа азотистых оснований: А – аденин, Г – гуанин, Ц – цитозин, У - урацил. В клетке присутствуют несколько типов РНК: Информационная (матричная) – и-РНК (м-РНК) Рибосомальная РНК – р-РНК Транспортная РНК – т-РНК Гетерогенная ядерная РНК – гя-РНК, является предшественником и-РНК Малая ядерная РНК – мя-РНК, принимает участие в преобразовании гя-РНК РНК-праймер, участвует в процессе репликации ДНК.

С ТРУКТУРНЫЕ УРОВНИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ Первичная структура – это последовательность нуклеотидов в полинуклеотидной цепочке. Вторичная структура – это порядок укладки полинуклеотидной нити. Для ДНК это двойная спираль. Правозакрученная спираль В- формы встречается наиболее часто. Бывают участки правозакрученные А- и С-формы, и левозакрученные Z-форма. У РНК могут комплементарно соединяться отдельные участки, т-РНК имеет форму клеверного листка. Третичная структура у ДНК – суперспирализация. Третичная структура т-РНК похожа на букву Г. Третичная структура р-РНК зависит от рН среды. Кольцевая ДНК прокариот образована ковалентными соединениями концов ДНК.

С ВОЙСТВА ДНК 1. РЕПЛИКАЦИЯ 2.РЕПАРАЦИЯ 3.ТРАНСКРИПЦИЯ 4. РЕКОМБИНАЦИЯ 5. МУТАЦИЯ Основная функция ДНК – хранение и передача наследственной информации.

Р ЕПЛИКАЦИЯ ДНК Репликацией называется процесс удвоения ДНК. Этот процесс лежит в основе воспроизведения себе подобных живыми организмами. Способность к самоудвоению является фундаментальной характеристикой ДНК Процесс репликации происходит в 3 этапа. На локальном участке двойная спираль раскручивается, разрываются водородные связи и цепи расходятся. Образуется репликативная вилка. Затем происходит типичный матричный синтез. На третьем этапе происходит закручивание спирали и восстановление вторичной структуры ДНК

Р ЕПЛИКАЦИЯ ДНК

Схематическое изображение процесса репликации, цифрами отмечены: (1) запаздывающая нить, (2) лидирующая нить, (3) ДНК полимераза, (4) ДНК лигаза, (5) РНК праймер, (6) ДНКпраймаза, (7) фрагмент Оказаки, (8) ДНК полимераза, (9)хеликаза, (10) одиночная нить со связанными белками, (11)топоизомераза

РЕПАРАЦИЯ ДНК

Модель ферментативной репарации ДНК

3. Г ЕНЕТИЧЕСКИЙ КОД И ЕГО СВОЙСТВА

Вопросы реализации наследственной информации неразрывно связаны со способом её зашифровки в молекуле ДНК. А способ зашифровки – это и есть генетический код. И, конечно, базовым понятие генетики является понятие о гене, как о единице наследственной информации.

П ОНЯТИЕ О ГЕНЕ Впервые о существовании единицы наследственной информации, которая передаётся без изменений от родителей потомству, предположил Г. Мендель. В 1909 г. В. Иогансеном введены основные понятия генетической терминологии: ГЕН, ГЕНОТИП, ФЕНОТИП, АЛЛЕЛЬ В 1912 г. Т. Морган предлагает теорию хромосомной локализации генов и в 1926 г. публикует работу «теория гена» Проблема гена становится центральной проблемой молекулярной генетики.

Первые представления о сложной структуре гена возникли в 20- х годах прошлого столетия. Советские генетики А.С. Серебровский и Н.П.Дубинин выдвинули предположение о дискретной структуре гена. Важным этапом в развитии теории гена были работы С. Бензера в конце 50-х годов. В этих работах было показано, что ген, представляющий собой нуклеотидную последовательность не является неделимой единицей рекомбинаций и мутаций.

С. Бензер в 1961 ввёл понятия: Рекон – единица рекомбинации Мутон – единица мутации Цистрон – единица генетической информации В дальнейшем было показано, что рекон и мутон соответствуют одной паре нуклеотидов Понятие цистрон совпадает с понятием ген Иногда термин «цистрон» употребляют, как синоним гена, когда хотят подчеркнуть его функциональное значение.

Мы уже говорили о том, что организация структур, в которых хранится наследственная информация у прокариот и у эукариот отличается. Соответственно и структура гена и процесс реализации наследственной информации у этих организмов тоже разные. Поэтому мы будем рассматривать и их сходство, и отличие.

Главная особенность организации генома прокариот: гены объединены в кластеры Гены одного кластера кодируют ферменты одного биосинтетического пути и транскрибируются на одну мРНК, которая называется полицистронной Группа структурных генов прокариот, находящаяся под контролем одного регуляторного участка, называется опероном. оперон является единицей транскрипции.

Структура гена прокариот А – ген, кодирующий один белок Б – гены, кодирующие рРНК и тРНК

В геноме эукариот выделяют три типа последовательностей ДНК: уникальные последовательности – представленные одной или несколькими копиями (60 – 80% генома); умеренные повторы – представлены от десятка до нескольких тысяч копий на геном (10 – 20% генома); высокоповторяющаяся ДНК – от нескольких тысяч до миллиона копий на геном (10 – 20% генома). Наличие копий – особенность генома эукариот. Большинство функционирующих генов – уникальные последовательности или умеренные повторы.

Но особенно важным было открытие прерывистой, «мозаичной», экзон - интронной структуры большинства генов у эукариот. Это было показано в 1977 г. Р. Робертсом и Ф. Шарпом.

Структура гена эукариот Экзон – информативная часть гена, т.е последовательность, нуклеотидов, кодирующая структуру полипептида Интрон - неинформативные последовательности нуклеотидов внутри одного гена, некодирующие структуру полипептида Для некоторых генов экзоны составляют лишь незначительную часть их длины. Роль интронов до конца не ясна.

Дальнейшие исследования в области молекулярной биологии ещё больше осложнили определение понятия «ген». В геноме эукариот были обнаружены большие регуляторные области, которые иногда располагались за пределами единиц транскрипции на расстоянии в десятки тысяч п.н. Причём в регуляторной части генома выделяют различные по функциям участки: промотор, энхансер, сайленсер, инсулятор.

Гены, несущие информацию о структурных и функциональных белках, о т–РНК, р–РНК, мя–РНК Структурные Онтогенетически е Хроногены, Гены пространственной организации Промотор, оператор, энхансер, сайленсер, терминатор, инсулятор Функциональные К ЛАССИФИКАЦИЯ ГЕНОВ

Промотор – участок связывания с ДНК факторов транскрипции, включает нп, способен связываться с ДНК – зависимой РНК – полимеразой. Полимераза узнает участок ТАТААТ, который называется блок Прибнова. В этом месте ДНК плотно не упаковывается. Промотор определяет место, с которого начинается транскрипция

Оператор – определяет время, с которого начинается транскрипция. Спейсер – неинформативный участок генома, располагаются между генами.

Энхансеры – усилители транскрипции Сайлансеры – ослабители транскрипции Одни и те же последовательности в ДНК могут выполнять эти функции, взаимодействуя с регуляторными белками, они меняют конформацию участка ДНК, тем самым изменяя активность генов

Терминатор - ген, на котором заканчивается транскрипция. Находится на 3 конце Включает палиндром Инсуляторы - короткие последовательности, (300 – 1000 п.н.) которые обеспечивают независимость функций гена, блокируя взаимодействие между энхансером и промотором.

В последних моделях структурно-функциональной организации генома организации генома предполагается, что ДНК-нуклеосомная нить образует функциональные специфические участки – домены, которые представляют петли (обычно – п.н.), прикрепляющиеся к структурам ядерного матрикса. В этих моделях инсуляторам отводится роль, определяющая функционирование домена, который и представляет собой единую функциональную единицу, возможно один ген.

С ТРУКТУРА ГЕНА ЭУКАРИОТ 1 – энхансеры, 2 – сайленсеры, 3 – промотор, 4 – экзоны, 5 – интроны, 6 – участки экзонов, кодирующие нетранслируемые области

О РГАНИЗАЦИЯ ГЕНОМА У прокариот ЦИСТРОННАЯ Считывающаяся на всем протяжении единица У эукариот ПРЕРЫВИСТАЯ ИНТРОН - ЭКЗОННАЯ

Код наследственности – способ зашифровки в молекуле ДНК наследственной информации о структуре и функции белков Генетический код и его свойства Свойства кода: Колинеарность Триплетность Неперекрываемость – перекрываемость Вырожденность Универсальность Квазиуниверсальность

Колинеарность – параллелизм. Нуклеотидная последовательность ДНК соответствует аминокислотной последовательности белка Триплетность – каждая аминокислота кодируется тройкой нуклеотидов – триплетом. Из четырех нуклеотидов путем различных сочетаний можно получить 64 триплета - кодона.

Неперекрываемость – перекрываемость при неперекрываемости один и тот же нуклеотид не может одновременно принадлежать двум кодонам Перекрываемость – заключается в том, что с одного и того же участка ДНК может считываться информация для образования двух и более белков в зависимости от начальной точки считывания АУГУУЦГУЦЦУГ- аминокислоты: метионин – фенилаланин – валин – лейцин цистеин – серин - серин 1. 2.

Вырожденность – экспериментально установлено, что при триплетности все 64 кодона имеют значение в экспрессии генов. Из них 61 кодон кодирует аминокислоты, а 3 кодона являются стоп – кодонами: УГА,УАГ,УАА. Универсальность – кодирование аминокислот происходит одинаково на всех уровнях организации живой системы Квазиуниверсальность – некоторые кодоны в разных генетических системах кодируют различные аминокислоты

В ТОРОЙ ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОД Редкие аминокислоты (селеноцистеин) могут включаться в первичную структуру полипептида, кодируясь тройкой УГА(стоп), если за этим кодоном находится особая стимулирующая последовательность нуклеотидов Инициативный кодон АУГ, отвечает за включение метионина Иногда инициация метионина может быть обеспечена кодонами АЦА, АУУ (изолейцин),УУГ (лейцин). Это происходит в том случае, если эти кодоны находятся в контексте: ГЦЦГЦЦАГЦЦАУГ

4. Э КСПРЕССИЯ ГЕНОВ

ДНКРНКБЕЛОК

Р ЕАЛИЗАЦИЯ НАСЛЕДСТВЕННОЙ ИНФОРМАЦИИ НА ПРИМЕРЕ ОБРАЗОВАНИЯ ПИГМЕНТА МЕЛАНИНА Фенилаланингидроксилаза (фермент) Фенилаланин Тирозин Нет фермента Фенилпировиноградная кислота Диоксифенилаланин Нет фермента Альбинизм ФКУМеланин … Аминокислота фенилаланин – поступает с пищей

Реализация наследственной информации – экспрессия генов – выражается в процессах транскрипции и трансляции Но эти процессы происходят неодинаково у прокариот и у эукариот

Э КСПРЕССИЯ ГЕНОВ У прокариот У эукариот Этапы Транскрипция Транспорт аминокислот Трансляция Транскрипция Процессинг Транспорт аминокислот Трансляция

Э КСПРЕССИЯ У ПРОКАРИОТ БЕЛОК

Э КСПРЕССИЯ У ЭУКАРИОТ эс СН 3 - G - РРР кэп гяРНК иРНК Метилирование Рестрикция Сплайсинг Полиаденилирование БЕЛОК

Т РАНСКРИПЦИЯ Транскрипция происходит на матричной цепи ДНК Вторая цепь Вторая цепь – комплементарная или смысловая

Т РАНСКРИПЦИЯ Транскрипцией называется процесс переноса генетической информации с ДНК на РНК. Процесс транскрипции происходит в три стадии: Инициация Элонгация Терминация

И НИЦИАЦИЯ – НАЧАЛО СИНТЕЗА Происходит присоединение к промотору комплекса ферментов, в том числе ДНК – зависимой РНК – полимеразы. Присоединение РНК – полимеразы к промотору инициирует раскручивание ДНК и освобождение нуклеотидных связей Промотор содержит блок Прибнова 5' - ТАТААТ - 3', который является стартом транскрипции

Э ЛОНГАЦИЯ – САМ ПРОЦЕСС СЧИТЫВАНИЯ ИНФОРМАЦИИ

Э ЛОНГАЦИЯ – ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОЕ ПРИСОЕДИНЕНИЕ СВОБОДНЫХ НУКЛЕОТИДОВ К СМЫСЛОВОЙ ЦЕПИ ДНК И СОЕДИНЕНИЕ ИХ В ПОЛИРИБОНУКЛЕОТИДНУЮ ЦЕПОЧКУ Фермент РНК - полимераза считывает информацию с ДНК - матрицы в направлении 3' 5' Синтез м - РНК идет в направлении 5' 3' Регуляторы скорости транскрипции: ЭНХАНСЕРЫ – ускоряют САЙЛЕНСЕРЫ – замедляют

Т ЕРМИНАЦИЯ – ЗАВЕРШЕНИЕ СИНТЕЗА РНК Фактор терминации - палиндром, который образует шпилечную структуру или фигуру креста Шпилька Крест

П РОЦЕССИНГ – ПРОМЕЖУТОЧНЫЙ ЭТАП ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ У ЭУКАРИОТ У прокариот процессы транскрипции и трансляции идут практически одновременно. У эукариот эти этапы разделены во времени. У эукариот в результате транскрипции, которая заканчивается в стадии терминации, образуется гетерогенная ядерная РНК (гя-РНК).

Структура гя- РНК 1 - 5'– нетранслируемая область 2 - 3'- нетранслируемая область 3 – копии экзонов 4 – копии интронов

После этого гя-РНК претерпевает процессинг – процесс образования функционально активных м-РНК, который включает: Сплайсинг - вырезание интронов и соединение экзонов; В сплайсинге участвуют органоиды ядра- сплайсосомы, в состав которых входит мя–РНК и ферменты: рестриктазы – вырезают неинформативные участки; лигазы – сшивают информативные участки Кэпирование – присоединение 7-метил-ГТФ к 5-концу гя-РНК с образованием «кэпа»; Полиаденилирование – присоединение к 3-концу поли-А размером в 100 – 250 нуклеотидов

Структура м-РНК 1 – «кэп» 2 – поли-А-участок 3 – копии экзонов

Процессинг

А ЛЬТЕРНАТИВНЫЙ СПЛАЙСИНГ Некоторые экзоны мРНК могут сшиваться в разных комбинациях с образованием различных матричных последовательностей. Открыт впервые у аденовирусов Это позволяет организму синтезировать разные по структуре и свойствам белки на базе одного гена.

Существуют три механизма альтернативного сплайсинга: Для образования различных мРНК могут использоваться разные промоторы Изменение сайта полиаденилирования первичного транскрипта Выбор различных экзонов из одинаковых гя-РНК

AUG AAAAAA AUG Некодирующая последовательность Кодирующая последовательность Стоп H2NH2N H2NH2N H2NH2N COOH Транслируется только белок 3 Транслируется только белок 2 Транслируется только белок 1 OH 3'3' 3'3' 3'3' Gppp

Гя-РНК обычно в десятки раз больше м-РНК. Предполагается, что функция «кэпа» связана с инициацией процесса трансляции. Полиадениловый «хвост» защищает м-РНК во время транспортировки к рибосомам. Точность сплайсинга регулируется мя-РНК, которые имеют участки, комплементарные концам интронов.

У прокариот и-РНК образуется сразу в результате транскрипции.

Т РАНСЛЯЦИЯ – ПРОЦЕСС СИНТЕЗА ПОЛИПЕПТИДНОЙ ЦЕПИ НА НИТИ И -РНК В процессе трансляции различают стадии: 1. Стадия активации аминокислот 2. Инициация 3. Элонгация 4. Терминация

Активация и транспорт аминокислот Участвуют: 1.Т – РНК 2. Ферменты – аминоацил - т - РНК – синтетазы Они обеспечивают посттранскрипционную регуляцию

Т – РНК обеспечивают перевод нуклеотидной последовательности в аминокислотную

Связывание тРНК с аминокислотой Комплекс глутаминил-тРНК- синтетазы с глутаминовой тРНК и АТФ по данным рентгеноструктурного анализа

Каталитические центры располагаются на рибосоме в нескольких участках

И НИЦИАЦИЯ ТРАНСЛЯЦИИ Малая субъединица узнаёт матричную РНК и её кодон - инициатор – АУГ; Инициаторная тРНК, узнаёт малую субъединицу рибосомы с помощью белковых факторов инициации; Образуется комплекс: малая субчастица рибосомы + мРНК. + тРНК. Белковые факторы инициации уступают место большой субчастице. Происходит сборка рибосомы

Э ЛОНГАЦИЯ ТРАНСЛЯЦИИ Стадии элонгации

Т ЕРМИНАЦИЯ ТРАНСЛЯЦИИ Стадии терминации

? П ЕРЕЧИСЛИТЕ ВСЕ ФУНКЦИОНАЛЬН ЫЕ ГЕНЫ. СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ!