Физические методы установления строения органических соединений Ельцов Илья Владимирович, к.х.н., кафедра общей химии факультета естественных наук Новосибирского государственного университета Нефёдов Андрей Алексеевич, к.х.н., лаборатория физических методов исследования Новосибирского института органической химии, кафедра органической химии факультета естественных наук Новосибирского государственного университета

Масс-спектрометрия и хромато-масс-спектрометрия высокого разрешения Лекция 2. Краткие сведения о хроматографии. Нефёдов Андрей Алексеевич, лаборатория физических методов исследования НИОХ СО РАН

Хроматография – метод разделения веществ, основанный на разности распределения веществ между двумя фазами – подвижной (называемой еще элюентом) и неподвижной (обычно сорбент с развитой поверхностью, часто полимерной природы). Немного иное определение: метод основан на различии в скоростях движения концентрационных зон разных веществ, которые перемещаются в потоке элюента вдоль слоя неподвижной фазы, причем исследуемые соединения распределены между обеими фазами. Хроматография была открыта и предложена как метод исследования русским ученым Михаилом Семеновичем Цветом в 1903 г. В зависимости от агрегатного состояния элюента (подвижной фазы) хроматографию делят на газовую и жидкостную. В хромато-масс-спектрометрии применяются оба типа хроматографирования.

Характеристики вещества, получаемые в хроматографическом методе Время удержания (время выхода) – время, проходящее между моментом ввода анализируемой пробы в колонку, и моментом выхода вершины пика вещества из колонки. Объем удержания – объем газа/жидкости-носителя, который проходит по хроматографической колонке с момента ввода анализируемой пробы в колонку до момента выхода вершины пика вещества из колонки. Индекс удержания – отношение времен удержания какого-то стандартного вещества (обычно для неполярных колонок какого-либо углеводорода известного строения) и определяемого вещества. Для одинаковых по химическому составу колонок является постоянной величиной. Площадь хроматографического пика – параметр, характеризующий количество вещества в пробе.

Стыковка хроматографа и масс-спектрометра, ограничения, накладываемые при этом на метод анализа Малые объемы пробы (1-10 мкл), малая (

Рис. Схема работы хроматографической колонки на примере капиллярной газовой хроматографии

В случае газовой хроматографии подвижной чаще всего средой является газ-носитель, в нашем случае – гелий, неподвижной фазой в нашем случае является засыпанное («набитое») внутрь трубки из инертного материала либо нанесенное на внутреннюю поверхность кварцевой трубки-капилляра твердое вещество, в зависимости от решаемых задач имеющее ту или иную химическую природу, например: Рис. 30%-Гептакис-(2,3-ди-О-метил-6- О-трет-бутил-диметилсилил)- - циклодекстрин, неподвижная фаза для разделения оптических изомеров Рис. Диметилдифенилполисилоксан, неподвижная фаза для разделения органических соединений

Капиллярная газовая хроматографическая колонка HP-5MS общего назначения, длина 30 м, внутреннний диаметр 0,25 мм, внешний диаметр 0.30 мм Капиллярная газовая хроматографическая колонка HP-5MS, установленная в хроматограф

Возможности газовых хромато-масс- спектрометров 1. Автоматический ввод образца/серии образцов. 2. Диапазон измеряемых масс от 10 до 850 а.е.м. 3. Программируемое изменение температуры хроматографической колонки от -50 до 400 С. 4. Анализ жидких проб – веществ в растворе. 5. Возможность анализа легкокипящих образцов (температура кипения которых меньше либо больше температуры кипения растворителя). 6. Возможность подбора хроматографической колонки под узкоспециализированные задачи: анализ нефтепродуктов, лекарственных препаратов, разделение оптических изомеров и т.д. 7. Возможность подключения других модулей (в частности, термоаналитической приставки)

Возможности масс-спектрометра высокого разрешения Thermo Electron DFS 1. При использовании штока прямого ввода для химической ионизации возможен нагрев образца до температуры 1600 С 2. При использовании штока прямого ввода возможен нагрев образца до температуры 360 С 3. Возможность ввода пробы через газовый хроматограф. 4. Диапазон измеряемых масс до а.е.м. 5. Диапазон точно (до 4 знака после запятой) определяемых масс до а.е.м. (зависит от наличия стандартов) 6. Ручной прямой ввод образца в масс-спектрометр 7. Ионизация электронным ударом 8. Малые количества веществ, расходуемых при проведении анализа

В случае жидкостной хроматографии подвижной средой является растворитель-носитель, в нашем случае – ацетонитрил, метанол, вода, смеси растворителей, неподвижной фазой в нашем случае является трубка-капилляр, в которую забит SiO 2 или Al 2 O 3 с развитой поверхностью, на которую привиты кремнийсодержащие соединения, в зависимости от решаемых задач имеющие ту или иную химическую природу, например: Рис. Неподвижные фазы для жидкостной хроматографии фирмы ZORBAX

Рис. Капиллярные хроматографические колонки для жидкостной хроматографии, слева – аналитическая колонка диаметром 5 микрон с предколонкой, справа – аналитическая колонка диаметром 1.8 микрон

Возможности жидкостных хромато-масс-спектрометров 1. Автоматический и ручной ввод образца/ Серии образцов. 2. Диапазон измеряемых масс от 20 до а.е.м. и выше. 3. Программируемое изменение температуры хроматографической колонки до температуры кипения растворителя (обычно С). 4. Анализ жидких проб – веществ в растворе. 5. Возможность анализа полимеров, олигомеров, биологических объектов, полярных соединений, веществ, содержащих много ОН- и других ионогенных групп и т.д., т.е. тех веществ, которые не проходят через хроматорафическую колонку газового хроматографа. 6. Возможность подбора хроматографической колонки под узкоспециализированные задачи: анализ нефтепродуктов, ароматических соединений, полярных веществ, лекарственных препаратов и т.д.

Количественный масс-спектрометрический анализ Факторы, от которых зависит площадь пика. 1. Количество частиц. Масс-спектрометрический сигнал пропорционален потоку частиц. Если мы имели концентрацию анализируемого раствора 1% по массе фенола (М=94 г/моль) и 1% урсоловой кислоты (М=470 г/моль), то их пики по площади будут отличаться. 2. Сечение ионизации. Любое вещество характеризуется своей уникальной величиной сечения ионизации, т.е. количеством ионов, образовавшихся из молекул в условиях эксперимента. При электронном ударе примерно одна из молекул ионизируется. Это «примерно» зависит от структуры соединения и может изменяться в широком диапазоне. Это означает, что одинаковые навески двух разных веществ после ионизации приведут к возникновению разного количества ионов. Как следствие, площади пиков на хроматограмме, пропорциональные величине полного ионного тока, на масс- хроматограммах будут существенно различаться. 3. Дискриминация по массе. Оказывается, что анализатор масс любого типа пропускает ионы с разными значениями m/z по-разному. В результате 100 ионов с m/z 56 дадут пик с интенсивностью, отличной от пика 100 ионов с m/z 326. Если два соединения в смеси имеют существенно различающиеся молекулярные массы, то дискриминация по массе скажется и на интенсивностях хроматографических пиков по полному ионному току.

Количественный хромато-масс- спектрометрический анализ Метод внешнего стандарта: Для прибора, на котором производится анализ, готовится образец с заведомо известной концентрацией определяемого вещества. Для большей точности делается несколько разведений, записывают хроматограммы и получают калибровочную зависимость. Далее записывается проба с неизвестной концентрацией вещества и по величине площади хроматографического пика и калибровочной зависимости делается вывод о содержании в пробе вещества. Метод внутреннего стандарта Также, как и в случае метода внешнего стандарта, приготовляются калибровочные растворы определяемого вещества и записываются их хроматограммы. Затем к образцу, имеющему в своем составе определяемое вещество, добавляется определенная порция определяемого вещества. Зная сигнал, который должен быть дан концентрацией, созданной добавлением вещества, определяют количество образца в исходной пробе.

Количественный хромато-масс- спектрометрический анализ Субъективный фактор – ручное интегрирование площади хроматографического пика: DEPO Интенсивность сигнала единиц Интенсивность сигнала единиц Разница – в 4,8%

ГАЗОВАЯ ХРОМАТО-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ

Требования к образцам на газовую хроматографию Общие требования: 1. Через хроматограф не проходят соли, полимеры, смолы, вещества с большой молекулярной массой (от 750 и выше). Поэтому такие соединения следует подвергать модификациям или же не приносить на хромато-масс-спектрометрический анализ – ничего разумного анализ показать не сможет. 2. Кислоты и их смеси желательно перевести в эфиры (желательно метиловые – они есть в базах масс-спектроскопических данных). Амины можно ацилировать. Иначе хроматографические пики на колонках с неполярной фазой получаются слишком широкие, и могут «закрывать» пики других соединений в смеси. 3. Не стоит приносить смеси с осадками, но если это неизбежно, то следует указать природу осадка. 4. Для образца в растворе: объем должен быть около 1 мл! Если есть опасность испарения растворителя, на емкости маркером следует оставить метку уровня растворителя. Если образца менее 1 мл, следует согласовать это с оператором хроматографа.

Требования к образцам на газовую хроматографию Образцы в растворе: 1. Необходимо указать растворитель. При прочих равных лучше использовать более легкокипящий растворитель (метанол, хлороформ), т.к. в случае более высококипящего растворителя задержку включения масс-анализатора на проход фронта растворителя выставляют больше, до 8 мин. включительно, в результате чего все соединения, которые выходят до времени включения масс-анализатора, обычно остаются неопределенными. 2. Целесообразно проверить растворитель/растворители на наличие примесей. 3. В случае исследования результатов какого-то химического процесса целесообразно проверить на наличие примесей исходные вещества, особенно если в их чистоте имеются сомнения (вещества низкой квалификации по чистоте, с длительного хранения и т.д.).

Требования к образцам на газовую хроматографию Образцы в растворе: 4. Необходимо как можно точнее указать концентрацию основного компонента в смеси. Желательно иметь это содержание около 0,5% по массе. Иначе получите «зашкаленную пробу»:

Менее «зашкаленный» пик

Требования к образцам на газовую хроматографию Жидкие и твердые образцы веществ в чистом виде: 1. Необходимо указать растворитель (растворители), в котором возможно провести растворение образцов, при этом целесообразно указать особенности растворения – возможно, растворение происходит, но медленно, или растворение можно провести при нагревании и т.д. 2. Если образец представляет собой смесь веществ, желательно перечислить основные компоненты смеси и их примерное содержание. 3. Если для жидкого образца известна температура кипения, ее следует привести. 4. Указать, какие соединения могут оказаться в осадке при растворении в указанном заказчиком растворителе.

Требования к заявкам: Заявка должна быть оформлена возможно более полно, чем больше информации о предполагаемом составе и характере пробы у оператора, тем больше информации будет потом у заказчика. !! Следует не забывать указывать на заявке фамилию, телефон, , оператор может разрешить часть возникающих вопросов по телефону Шифр пробы должен быть не более 8 символов, применяются латиница, цифры, знаки «_» и «-» Структурные формулы следует приводить четко, на их основе потом определяется возможный путь фрагментации соединения под электронным ударом. Не следует упускать возможность написать возможную брутто-формулу соединений, оператор может, конечно, по структурной формуле написать брутто-формулу, но это не является его основной работой. Молекулярные массы целесообразно приводить с округлением в меньшую сторону до целых, если входят в соединение хлор или бром – то с учетом меньшего по массе изотопа (т.е. хлор – 35 а.е.м., бром – 79 а.е.м.).

Требования к заявкам: а) Записать и передать ХМС – означает передать файл, сгенерированный управляющим прибором компьютером при записи образца. Обработка его ведется уже химиком на своем компьютере при помощи специальной программы (Stand Alone Review Data) б) Идентифицировать компоненты смеси – означает провести идентификацию путем сравнения масс- спектров соединений смеси с имеющимися базами масс- спектральных данных (около 500 тыс. соединений) в) Идентифицировать и интерпретировать компоненты смеси – означает провести идентификацию по базам данных для всех пиков, для которых это возможно, а для которых невозможно – предположить возможные структуры соединений на основе априорной информации и характера масс-спектра Указать особые условия для записи хромато- масс-спектрограммы - означает указать метод, которым произвести запись, требования к температуре источника и детектора, время, с которого проводить интегрирование пиков, их можно обсудить с оператором, чтобы понять, какой именно режим предпочтителен г) - Особые требования к представлению результатов (обсудить с оператором)

Требования к заявкам: Указать концентрацию по основному веществу в процентах, допустимо указать навеску вещества и объем/массу растворителя, израсходованного на создание пробы, при использовании легкокипящих растворителей на емкости с образцом целесообразно делать метку маркером, обозначающую уровень растворителя сразу после приготовления Если химик не уверен, что вся его смесь пройдет в стандартных условиях через хроматографическую колонку, он должен особо обговорить анализ данной пробы с оператором Указание даты позволяет в дальнейшем легко найти вашу заявку (при хранении заявки сортированы по дате) Указать возможные растворители для образца, если образец в чистом виде

ЖИДКОСТНАЯ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ ВЫСОКОГО РАЗРЕШЕНИЯ (ВЭЖХ-МС)

Требования к образцам на масс-спектрометрию высокого разрешения Твердые образцы: 1. Должны быть как можно более чистыми, если необходим масс- спектр. 2. Несмотря на высокую чувствительность метода и малое количество образца, необходимое для анализа, количество, предоставляемое химиком для записи масс-спектра, должно быть достаточным для того, чтобы образец удобно было помещать в кювету (обычно 10 мг достаточно). 3. Целесообразно проверить образец на наличие примесей (тонкослойной или иного вида хроматографии). 4. Указать растворители для образца, чтобы его отмывать от кюветы.

Требования к заявкам на масс-спектрометрию высокого разрешения Обязательно указание, до какой температуры образец химически стабилен Обязательно указание растворителя, в котором образец хорошо растворим Целесообразно указать электронный адрес, помимо комнаты и телефона Указать молекулярный вес или интервал, где следует искать молекулярный ион образца

Требования к заявкам на масс-спектрометрию высокого разрешения Определение брутто-формулы – на основании значения молекулярной массы и некоторой априорной информации возможно определить с той или иной ошибкой комбинацию атомов, имеющих такой же молекулярный вес Определение ММ – означает определение молекулярной массы с точностью обычно до четвертого знака после запятой Запись МС – означает просто запись масс-спектра, например, для размещения его в статье или отчете, не определяется точная масса и брутто-формула

МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ ВЫСОКОГО РАЗРЕШЕНИЯ

Специфика ВЭЖХ-МС анализа - пригоден для многих термолабильных и малолетучих веществ - не даёт стандартных масс-спектров - слабое разделение на колонках - проблема растворимости образца (лучше в AсCN, MeOH, i-PrOH, H 2 O) Предпосылки к использованию ВЭЖХ-МС анализа Проблемы с идентификацией, не решаемые другими физметодами Надежда на наличие в молекуле ионогенных групп Предварительный подбор условий ВЭЖХ-анализа (для смесей) Заметная растворимость образца в неагрессивных растворителях

Жидкие и твердые образцы веществ в чистом виде: 1. Необходимо указать растворитель (растворители), в котором возможно провести растворение образцов, при этом целесообразно указать особенности растворения – возможно, растворение происходит, но медленно, или растворение можно провести при нагревании и т.д. Целесообразно указать полярные растворители, в котором растворяется образец – метанол, ацетонитрил и т.д. – для обеспечения электроспрей- ионизации. 2. Если образец представляет собой смесь веществ, желательно перечислить основные компоненты смеси и их примерное содержание. 3. Если для жидкого образца известна температура кипения, ее следует привести. 4. Указать, какие соединения могут оказаться в осадке при растворении в указанном заказчиком растворителе. Требования к образцам на жидкостную хроматографию

Пример масс-спектральной информации с жидкостного хромато-масс-спектрометра Agilent 1100 (квадрупольный масс-анализатор)

Пример масс-спектральной информации с жидкостного хромато-масс-спектрометра Agilent 1100 (времяпролетный масс-анализатор)