АНАЛИЗ СТЕПЕНИ СТРУКТУРНОЙ И ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ОДНОТИПНОСТИ ПОЛИВАЛЕНТНОГО ИНГИБИТОРА ПРОТЕАЗ, СОДЕРЖАЩЕГОСЯ В ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЕ ЖИВОТНЫХ, И СОЕВОГО ИНГИБИТОРА ТРИПСИНА

Протеолиз лежит в основе регуляции важных физиологических процессов организма. Протеолиз осуществляется большим количеством внутри- и внеклеточных протеолитических ферментов. Типичными представителями протеаз являются трипсин, калликреин, тромбин, плазмин, урокиназа, пепсин, дуоденаза. Деятельность протеаз регулируется преимущественно белками- ингибиторами, составляющими мощный антипротеолитический потенциал организма. Ингибиторы встречаются в организмах животных и растений. Предотвращая преждевременную и чрезмерную активность, либо полностью блокируя работу протеолитических ферментов, ингибиторные белки участвуют в механизмах многих сопряженных с протеолизом процессов, таких как свертывание крови, распад фибринового сгустка, активация комплемента и другие. Особую группу белков-ингибиторов животного происхождения составляют серпины. К ним относят гирудин, α 1 -антитрипсин, α 2 -макроглобулин и другие. Особый интерес представляет поливалентный ингибитор протеаз (апротинин), выделенный из органов крупного рогатого скота. Аналоги животных ингибиторов обнаружены у таких растений как табак, горчица, картофель, пшеница, соя и другие. В частности к ним относятся ингибиторы из соевых бобов. К сожалению, вопрос о структурной и функциональной однотипности протеазных ингибиторов, присутствующих в организмах животных и растений, имеет существенные пробелы. Поэтому в качестве объектов сравнения были выбраны поливалентный ингибитор протеаз поджелудочной железы животных (апротинин) и соевый ингибитор трипсина. Кроме того, актуальность данного исследования обусловлена исключительно важной ролью регуляторов протеолиза в функционировании физиологических процессов.

ЦЕЛЬ – анализ степени структурной гомологии и функциональной однотипности апротинина животного происхождения и соевого ингибитора трипсина (СИТ) ЗАДАЧИ: 1) Методами биоинформатики установить степень структурной гомологии, спектр биологической активности и потенциальные молекулы-мишени апротинина и СИТ среди протеаз человека. 2) Определить трипсин-ингибиторную активность апротинина и СИТ в опытах in vitro. 3) Изучить влияние апротинина и СИТ на свертывание крови (протромбиновое время, активированное частичное тромбопластиновое время и тромбиновое время). 4) Определить влияние апротинина и СИТ на фибринолиз (определение времени фибринолиза). 5) Сравнить влияние апротинина и СИТ на агрегацию тромбоцитов (скорость и степень агрегации). 6) Проанализировать влияние апротинина и СИТ на функциональное состояние системы комплемента (гемолитическая активность). 7) Изучить влияние приема изолята соевого белка, содержащего соевый ингибитор трипсина, на общую протеолитическую и трипсин- ингибиторную активности в сыворотке крови людей.

Итоги проекта по отделу ЭЛЕКТРОННЫЕ БАЗЫ ДАННЫХ БЕЛКОВ Из 49 просмотренных баз данных белков только 8 содержат информацию об апротинине и СИТ. Наиболее информативные базы - Protein Data Bank и UniProt/Swiss-Prot.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТЕПЕНИ ГОМОЛОГИИ ИНГИБИТОРОВ Рис. 1. Результат подсчета гомологии апротинина (Aprotinin) и СИТ (SBTI). Рис. 2. Результат подсчета гомологии отдельных участков полипептидных цепей апротинина (Aprotinin) и СИТ (SBTI).

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СПЕКТРА БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ Программа показала 4 вида активности для апротинина и 3 для соевого ингибитора. Ингибиторы схожи по 3 видам активности и вероятности их проявления (Drug-Likeness). Согласно программе они являются ингибиторами ренина и ферментов-конвертаз. Произвести поиск молекул-мишеней для исследуемых ингибиторов методами биоинформатики не удалось, по причине отсутствия в свободном доступе необходимых программ. Программа показала 4 вида активности для апротинина и 3 для соевого ингибитора. Ингибиторы схожи по 3 видам активности и вероятности их проявления (Drug-Likeness). Согласно программе они являются ингибиторами ренина и ферментов-конвертаз. Произвести поиск молекул-мишеней для исследуемых ингибиторов методами биоинформатики не удалось, по причине отсутствия в свободном доступе необходимых программ. Рис. 3. Результат определения биологической активности апротинина и СИТ.

Рис. 4. Электронные трехмерные третичные структуры апротинина и СИТ.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТРИПСИН-ИНГИБИТОРНОЙ АКТИВНОСТИ АПРОТИНИНА И СИТ Рис. 5. Трипсин-ингибиторная активность апротинина (1), СИТ (2), ε-аминокапроновой кислоты (3) и D-лизина (4) в ИЕ на 1 мг вещества. Рис. 6. Трипсин- ингибиторная активность апротинина (1) и СИТ (2) в ИЕ на 1 нмоль вещества.

Показатель ВРЕМЯ В СЕКУНДАХ Контроль Трипсин 0,1 % Апротинин 1 % СИТ 1 % Протромбиновое время 20±0,9 13±0,9 Р 1-2 0,05 31±0,9 Р 1-4

Табл. 2. Влияние апротинина, СИТ и трипсина на АДФ- и Адреналин-инициируемую агрегацию тромбоцитов Установлено, что трипсин повышает, а ингибиторы в равной степени снижают агрегабельность тромбоцитов при всех исследуемых типах агрегации. Контроль (плазма)(1) Плазма + Апротинин (2) Плазма + СИТ (3) Плазма + Трипсин (4) Обратимая (адф) МА Т МА 22±1,8 55±4,7 14±0,9 Р 1-2

ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕМОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ КОМПЛЕМЕНТА Рис. 7. Типичные кривые гемолиза в присутствие трипсина и ингибиторов. Система комплемента активируется путем ограниченного протеолиза и мы предполагали, что трипсин может ускорить гемолиз эритроцитов, а ингибиторы наоборот. Однако, внесение трипсина оказало противоположный эффект, возможно за счет разрушения компонентов системы комплемента. Ингибиторы не повлияли на процесс гемолиза вероятно по причине их субстратной специфичности.

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ПРИЕМА ИЗОЛЯТА СОЕВОГО БЕЛКА НА ОБЩУЮ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКУЮ И ТРИПСИН-ИНГИБИТОРНУЮ АКТИВНОСТЬ СЫВОРОТКИ КРОВИ ЛЮДЕЙ СИТИзолят Кол-во ингибиторных единиц (ИЕ) на мг вещ-ва 461,3-1,5 Протеолитическая активность (ЕТ/мл) Ингибиторная активность (ИЕ/мл) До приема 0,343±0,010113±3,6 После приема 0,282±0,008137±5,3 После термической обработки в процессе приготовления изолята соевого белка сохранилась активность соевого ингибитора трипсина. Установлено, что прием на протяжении 2 месяцев изолята соевого белка, обладающего антитрипсиновой активностью, сопровождался достоверным снижением общего уровня протеолитической активности на 18% и увеличением уровня трипсин-ингибиторной активности на 22% в сыворотки крови. Табл. 3. Трипсин-ингибиторная активность СИТ и изолята соевого белка Табл. 4. Общая протеолитическая и трипсин-ингибиторная активность сыворотки крови людей, длительно принимавших изолят соевого белка

ВЫВОДЫ 1) Первичные структуры и спектры биологической активности апротинина и СИТ гомологичны in silico. 2) СИТ и апротинин обладают одинаковой трипсин-ингибиторной активностью in vitro. 3) СИТ и апротинин в равной степени препятствуют свертыванию крови, фибринолизу и агрегации тромбоцитов. СИТ замедляет время свертывания, протекающего по внешнему и внутреннему пути, а апротинин – только по внутреннему пути. 4) Оба ингибитора полностью блокируют фибринолиз. 5) Апротинин и СИТ обладают антиагрегационными свойствами. Они не отличаются по силе торможения обратимой, двухфазной, необратимой АДФ-инициируемой и двухфазной адреналин- инициируемой агрегации тромбоцитов. 6) Растворы СИТ и апротинина в концентрациях 0,01-1,0% не влияют на скорость и степень комплемент-зависимого гемолизиса in vitro. 7) 2-хмесячный прием изолята соевого белка, содержащего активный СИТ, снижает общую протеолитическую активность на 18% и увеличивает трипсин-ингибиторную активность на 21% в сыворотке крови.